樟科16個樹種木材的RAPD與ISSR分子鑒別

駱嘉言，王 英，鐘文翰，劉海沖，蔣火俊

（1.南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京210037；2.浙江省家具檢測技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311112）

研究簡報

樟科16個樹種木材的RAPD與ISSR分子鑒別

駱嘉言1，王 英1，鐘文翰2，劉海沖1，蔣火俊1

（1.南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京210037；2.浙江省家具檢測技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311112）

采用隨機擴增多態(tài)性（RAPD）和簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）技術(shù)鑒別樟科Lauraceae16個樹種。用改良十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉（CTAB-SDS）法提取樟科16個樹種192株（12株·種－1）木質(zhì)部基因組DNA，用RAPD與ISSR技術(shù)對它們進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增。共篩選出8條RAPD引物與6條ISSR引物，8條RAPD引物共擴增出165條大小為100～2 000 bp的條帶，其中多態(tài)性條帶為153條，多態(tài)率為92.7%；6條ISSR引物共擴增出96條大小為100～2 000 bp的條帶，其中多態(tài)性條帶為86條，多態(tài)率為89.6%。通過1～2個引物擴增的多態(tài)性條帶就可鑒別與區(qū)分參試的16個樹種，為樹種鑒定提供技術(shù)支持。圖3表5參18

植物學(xué)；樟科；木材；RAPD；ISSR；分子鑒定

Abstract:Random amplified polymorphic DNA （RAPD）and inter simple sequence repeats（ISSR）techniques were applied to identify 16 species of Lauraceae.The optimized cetyl trimethylammonium bromide （CTAB）-sodium dodecyl sulfate （SDS） method was used to extract wood DNA of 192 trees in the 16 species.RAPD and ISSR techniques were used to amplify DNA of the 16 species.Results showed that eight RAPD primers and six ISSR primers were screened.Through the eight RAPD primers,165 bands were obtained,among which 153 were polymorphic for a species level polymorphism loci rate of 92.7%.96 bands were obtained through the six ISSR primers,among which 86 were polymorphic for a species level polymorphism loci rate of 89.6%.DNA fragment size was 100－2 000 bp.These polymorphism bands amplified by 1 or 2 primers could distinguish the wood of these 16 species in the Lauraceae family,providing technical support for wood identification.［Ch,3 fig.5 tab.18 ref.］

Key words:botany;Lauraceae;wood;random amplified polymorphic DNA （RAPD）;inter simple sequence repeats （ISSR）;molecular identification

樟科Lauraceae植物廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，全世界約50屬2 500～3 000種［1］，中國有24屬約430種。樟科樹木是中國南方重要的經(jīng)濟林木，在林業(yè)、輕工、醫(yī)藥、園林綠化中均占有重要地位。楠屬Phoebe和樟屬Cinnamomum等木材被認為是優(yōu)質(zhì)木材，常用作建筑物的梁柱構(gòu)件、棺槨、家具、箱盒等。樟科木材普遍含有油細胞或黏液細胞，是樟科木材的識別標(biāo)識；但樟科各個屬間及種間，木材結(jié)構(gòu)特征相似，僅通過木材解剖結(jié)構(gòu)特征很難區(qū)分。隨機擴增多態(tài)性（RAPD）與簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增進行檢測的DNA標(biāo)記［2］，具備穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、成本低、操作簡單、樣品用量少等優(yōu)點，因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)建立DNA指紋圖譜被認為是鑒別樹種的有力工具［3］。LANGE等［4］運用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對巨桉Eucalyptu grandis12個無性系進行研究，發(fā)現(xiàn)通過其指紋圖譜可以有效地鑒定12個巨桉無性系。CASTIGLIONE等［5］利用RAPD分子標(biāo)記繪制了楊樹Populus 32個無性系的指紋圖譜，并對它們加以區(qū)分。GRAHAM等［6］運用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究懸鉤子屬Rubus的13種植物的分類狀況。沈永寶等［7］采用ISSR標(biāo)記技術(shù)，僅用2條ISSR引物就將銀杏Ginkgo biloba 13個品種進行區(qū)分。侯渝嘉等［8］利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了茶樹Camellia sinensis種質(zhì)資源，結(jié)果表明：只要用其中任何1條引物即可區(qū)分14個茶樹品種。李薇等［9］采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對6個美洲黑楊Populus deltoids品種進行鑒定，并用1條引物將它們區(qū)別。RAPD與ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在樹種鑒定中被證實具有較強可靠性和穩(wěn)定性。因此，本研究利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對樟科16個樹種進行鑒別，以期為樟科木材精確鑒別提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采集南京中山植物園樟科5屬16種立木的新鮮枝條，12株·種－1，計192個樣品（表1）。

表1 實驗用材信息Table 1 Information of tested materials

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 將去除樹皮的枝條切成碎木屑，液氮研磨成粉，準(zhǔn)確稱量0.1 g木粉，采用改良十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉（CTAB-SDS）法［10］提取基因組DNA；紫外分光光度計及質(zhì)量分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠檢測模板DNA的濃度和純度，置于－20℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴增 按照文獻［11－15］選出ISSR引物42條（表2），RAPD引物45條（表3），對提取到的模板 DNA 進行 PCR 擴增。RAPD 擴增反應(yīng)體系：10×Taq 緩沖液（含 Mg2＋）2.0 μL； 10 mmol·L－1dNTP Mixture 0.6 μL； 10 μmol·L－1RAPD 引物 3.0 μL； 5×16.67 mkat·L－1Taq DNA 聚合酶 0.2 μL； DNA 模板2.0 μL；無菌水12.2 μL。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 1 min，退火50 s，72℃延伸 1 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。設(shè)定梯度退火溫度34℃，36℃，38℃和40℃。ISSR擴增反應(yīng)體系： 10×Taq 緩沖液（含 Mg2＋） 2.0 μL； 10 mmol·L－1dNTP Mixture 0.8 μL；10 μmol·L－1ISSR 引物 3.0 μL；5×16.67 mkat·L－1Taq DNA 聚合酶 0.2 μL； DNA 模板 2.0 μL； 無菌水 12.0 μL。 PCR 程序： 94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，退火40 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。設(shè)定梯度退火溫度50℃，52℃，54℃和56℃。

1.2.3 電泳檢測 取擴增產(chǎn)物5.0 μL上樣到質(zhì)量分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓160 V，電泳40 min。電泳完畢后放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分析電泳圖，讀帶時只記錄清晰可辨的條帶，排除模糊不清的條帶。以16個樹種為單元，統(tǒng)計同一樹種12株同一位置上出現(xiàn)的共有條帶，忽略同一樹種不同樣本間的差異條帶，統(tǒng)計多態(tài)性位點，計算多態(tài)性比率，多態(tài)性比率（%）＝（總條帶數(shù)－共有條帶數(shù)）/總條帶數(shù)×100%。

表2 ISSR引物及其序列Table 2 ISSR primers and sequences

表3 RAPD引物及其序列Table 3 RAPD primers and sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 木材基因組DNA的檢測結(jié)果

16個樹種均取3個樣本的基因組DNA進行電泳檢測，發(fā)現(xiàn)所有條帶清晰無彌散，點樣孔清晰（圖1），說明基因組DNA完整性好；紫外分光光度計檢測，DNA樣品D（260/280）值為1.7～2.0，說明DNA樣品純度較好，滿足本試驗的要求。

2.2 RAPD引物篩選及多態(tài)性標(biāo)記鑒別

RAPD-PCR擴增篩選出8條能擴增出清晰條帶且多態(tài)性好的引物，并測得其最佳退火溫度均是38℃（表4）。共獲得清晰可辨條帶165條，其中多態(tài)性條帶153條，多態(tài)性比率為92.7%，擴增的DNA片段長度集中在100～2 000 bp。平均每條引物擴增出20.6條帶，其中19.1條具多態(tài)性。引物S91多態(tài)性最高，達到100%，引物S221最低，為83.3%。不同引物擴增的產(chǎn)物在多態(tài)性水平上的較大差異，表明參試的16個樹種在分子水平上差異很大，具有豐富的遺傳多樣性。

圖1 基因組DNA電泳檢測結(jié)果Figure 1 Electrophoresis figure of genomic DNA

表4 8條RAPD引物擴增結(jié)果Table 4 Amplified results of 8 RAPD primers

擴增結(jié)果表明：每條RAPD引物單獨使用均可區(qū)別這16個樹種。以引物S35為例，該引物共擴增出21條多態(tài)性條帶 （圖2），其中楠屬擴增出4條共有條帶，樟屬擴增出5條共有條帶。楠屬樹種擴增出特異性條帶450 bp和750 bp，山胡椒屬特異性條帶為310 bp，樟屬特異性條帶為2 000 bp和1 000 bp；這些條帶可將樟科5屬區(qū)別開。同屬樹種間多態(tài)性條帶差異較小，楠屬樹種浙江楠（編號1）特異性條帶為1 500 bp，紫楠（編號2）特異性條帶為1 800 bp，楨楠（編號3）特異性條帶為600 bp，湘楠（編號5）特異性條帶為2 000 bp。由此可區(qū)分楠屬5個樹種。潤楠屬中薄葉潤楠 （編號8）特異性條帶為170 bp，龍眼潤楠（編號7）特異性條帶為1 000 bp；山胡椒屬山胡椒（編號9）特異性條帶為300 bp，狹葉山胡椒（編號10）特異性條帶為1 000 bp，黑殼楠（編號11）特異性條帶為2 000 bp；樟屬大葉樟（編號15）特異性條帶為320 bp，浙江樟（編號13）特異性條帶為1 000 bp。由此可知，RAPD引物S35可將16個樹種有效區(qū)分。

2.3 ISSR引物篩選及多態(tài)性標(biāo)記鑒別

ISSR-PCR擴增篩選出6條能夠擴增出清晰條帶且多態(tài)性好的引物，并測得其最佳退火溫度（表5）。共獲得清晰可辨條帶96條，其中多態(tài)性條帶86條，平均多態(tài)性比率為89.6%，擴增的DNA片段長度集中在100～2 000 bp。平均擴增出條帶16條·引物－1，其中14.3條具多態(tài)性，引物843多態(tài)性最高，為94.4%，引物825多態(tài)性最低，為80.0%。

以引物840擴增結(jié)果（圖3）為例，共擴增出16條多態(tài)性條帶，其中山胡椒屬特異性條帶在600 bp和750 bp位置，潤楠屬特異性條帶在250 bp和700 bp位置，樟屬特異性條帶為300 bp和700 bp，月桂屬在100 bp處擴增出特異性條帶。根據(jù)這些特異性條帶可區(qū)分樟科5屬。同屬樹種間多態(tài)性條帶差異較小，楠屬樹種浙江楠（編號1）的特異性條帶在1 000 bp位置，紫楠（編號2）特異性條帶為450 bp和750 bp，閩楠（編號4）特異性條帶為350 bp和400 bp的片段，湘楠（編號5）特異性條帶為350 bp和750 bp位置。由此將楠屬樹種區(qū)分開。引物840在山胡椒屬的黑殼楠（編號11）和江浙釣樟（編號12）中擴增出相同的條帶，不能有效區(qū)分這2個樹種。

除引物840外，引物815，825，848和843擴增的多態(tài)性條帶都可區(qū)分16個樹種。引物840擴增的多態(tài)性條帶不能有效區(qū)分黑殼楠和江浙釣樟，引物834不能有效區(qū)分山胡椒和狹葉山胡椒，但這2個引物的組合可區(qū)分16個樹種。

圖2 引物S35擴增16個樹種的產(chǎn)物比較圖Figure 2 Amplified profile comparison of 16 species with RAPD primer S35

表5 6條ISSR引物擴增結(jié)果Table 5 Amplified results of 6 ISSR primers

3 結(jié)論與討論

ISSR和RAPD分子標(biāo)記具備良好的多態(tài)性，因而在樹種鑒定和指紋圖譜研究方面得到了廣泛應(yīng)用。本試驗利用8條RAPD引物和6條ISSR引物對樟科16個樹種進行DNA擴增，發(fā)現(xiàn)2種標(biāo)記均能擴增出穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性好的條帶。RAPD分子標(biāo)記擴增的多態(tài)性比率為92.7%，平均每條引物擴增的多態(tài)性條帶有19.1條；ISSR分子標(biāo)記擴增的多態(tài)性比率為89.6%，平均每條引物擴增的多態(tài)性條帶有14.3條，通過1個RAPD引物或1～2個ISSR引物擴增的多態(tài)性條帶可鑒別樟科16個樹種。對比結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，RAPD分子標(biāo)記的多態(tài)性和穩(wěn)定性比ISSR高，與李元春等［16］在山核桃Carya cathayensis中發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)記的多態(tài)性要高于ISSR標(biāo)記的結(jié)果一致；而在馬尾松Pinus massoniana［17］和銀杏［18］等的研究卻發(fā)現(xiàn)ISSR標(biāo)記的多態(tài)性要高于RAPD標(biāo)記，說明不同樹種適合不同的分子標(biāo)記。考慮到2種分子標(biāo)記的檢測水平不同，產(chǎn)生的高效的多態(tài)性條帶也不同，因此，將這2種標(biāo)記結(jié)合使用會使樹種鑒別結(jié)果更加準(zhǔn)確和全面。

圖3 引物840擴增16個樹種的產(chǎn)物比較圖Figure 3 Amplified profile comparison of 16 species with ISSR primer 840

用RAPD分子標(biāo)記和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定木材，結(jié)果準(zhǔn)確、耗材少、不受時間和環(huán)境的限制，拓寬了木材識別的范圍，提高了木材識別的精確性；采用瓊脂糖凝膠電泳進行分子鑒定節(jié)約了實驗經(jīng)濟成本，這不僅在進出口樹種鑒定中意義重大，在巨大的木制品消費市場及相關(guān)其他領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)利用價值。

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Establishment of RAPD and ISSR markers for wood identification of 16 species of Lauraceae

LUO Jiayan1,WANG Ying1,ZHONG Wenhan2,LIU Haichong1,JIANG Huojun1
（1.College of Materials Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China;2.Key Laboratory of Furniture Inspection Technology of Zhejiang Province,Hangzhou 311112,Zhejiang,China）

S792.26

A

2095-0756（2017）05-0942-07

2016-10-28；

2017-01-05

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD，2014-2017）

駱嘉言，副教授，從事木材學(xué)研究。E-mail：luojiayan@njfu.edu.cn。通信作者：王英，從事木材科學(xué)與技術(shù)研究。E-mail：yingw823924@163.com