楊 苗,賀俊亞,孫雨舟,韓兆雪,陳曉紅,李亞君*,溫曉霞*
不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑類離子液體對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響
楊 苗1,賀俊亞1,孫雨舟1,韓兆雪2,陳曉紅2,李亞君1*,溫曉霞1*
(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西 楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌712100)
為探討離子液體(ILs)對(duì)農(nóng)業(yè)生物的毒性,以典型農(nóng)作物玉米為材料,采用水培法研究三種不同烴鏈長(zhǎng)度離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([C4mim]Cl)、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽([C6mim]Cl)和1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽([C8mim]Cl)在不同濃度下對(duì)幼苗的根、莖生長(zhǎng)以及部分生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:三種離子液體對(duì)玉米幼苗根、莖干重均有顯著抑制作用。由EC50值得出,抑制程度表現(xiàn)為[C4mim]Cl<[C6mim]Cl<[C8mim]Cl,且對(duì)根重的抑制大于莖重。隨三種離子液體處理濃度增加,玉米幼苗根、莖抗氧化酶系(SOD、POD、CAT、APX)總體呈下降趨勢(shì),而丙二醛(MDA)含量顯著升高,表明氧化脅迫可能是離子液體產(chǎn)生毒性的重要原因。
咪唑類離子液體;烴鏈長(zhǎng)度;玉米;抗氧化酶
離子液體(Ionic Liquids,ILs)是由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子組成、室溫下呈液體狀態(tài)的鹽。由于具有導(dǎo)電性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不揮發(fā)、不易燃等特性,使其在電化學(xué)、化學(xué)反應(yīng)和分離過(guò)程等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1-2]。伴隨著ILs的大規(guī)模應(yīng)用,其不可避免的通過(guò)水循環(huán)等途徑進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng),對(duì)環(huán)境和生物體造成不同程度的影響。咪唑類ILs為目前應(yīng)用最廣泛的一類ILs,并且越來(lái)越多的研究表明,咪唑類傳統(tǒng)ILs的生物降解性較差,對(duì)分子(酶)、細(xì)胞、微生物、藻類和動(dòng)植物等均有較顯著的毒性[3-4]。
有關(guān)ILs的毒性研究主要集中在以下兩方面:一是ILs對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中各類生物的毒性作用情況;二是ILs的陰、陽(yáng)離子組成及結(jié)構(gòu)對(duì)其毒性之影響[5]。相關(guān)研究以生物個(gè)體水平的毒性試驗(yàn)為主,并有一些分子、細(xì)胞水平的毒性研究。其毒性機(jī)理主要與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞以及氧化脅迫有關(guān),例如:Hartmann等[6]從基因水平研究了季鏻離子液體對(duì)構(gòu)巢曲霉的毒性,發(fā)現(xiàn)離子液體毒性作用的主要機(jī)制是損壞細(xì)胞壁以及增大細(xì)胞膜透性;Du等[7]分析了離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Omim]PF6)對(duì)斑馬魚Danio rerio的抗氧化酶活性、DNA損傷等的影響,結(jié)果表明離子液體可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷,并且程度隨時(shí)間而累積;牧輝等[8]研究發(fā)現(xiàn)ILs對(duì)普通小球藻的生長(zhǎng)和葉綠素a的產(chǎn)生均有顯著的抑制作用;Liu等[9]在水稻中的研究也發(fā)現(xiàn)ILs對(duì)光合作用及葉綠素代謝具有顯著的抑制作用。在所研究的生物類群方面,以對(duì)水生生物(如藻類、魚類等)影響的研究居多,對(duì)陸生植物的相對(duì)較少。
玉米(Zea mays L.)是目前我國(guó)播種面積最大的農(nóng)作物,在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中具有重要地位。本研究以玉米為實(shí)驗(yàn)材料,探究三種不同烴鏈長(zhǎng)度咪唑類ILs:1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([C4mim]Cl)、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽([C6mim]Cl)和1-辛基-3-甲基咪唑氯鹽([C8mim]Cl)對(duì)玉米幼苗的毒性效應(yīng),為綜合評(píng)價(jià)ILs對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在危害提供理論依據(jù)。
1.1 供試材料
本試驗(yàn)以目前我國(guó)廣泛種植的玉米品種鄭單958為材料(北京德農(nóng)種業(yè))。[C4mim]Cl、[C6mim]Cl和[C8mim]Cl均購(gòu)自蘭州中科凱特科工貿(mào)有限公司。
1.2 玉米幼苗培養(yǎng)
幼苗的培養(yǎng)全部在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。挑選均一飽滿的玉米種子,用75%酒精溶液消毒5 min,蒸餾水多次沖洗后,28℃(暗)浸種催芽12 h,在發(fā)芽盒底部鋪上雙層濾紙,30 mL蒸餾水浸濕,28℃發(fā)芽48 h[9]。選取發(fā)芽均勻一致的種子,每20粒一組培養(yǎng)于帶孔水培盒上,將種子初生根浸入培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含不同濃度ILs的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH=6.0)[10],無(wú)曝氣裝置。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度10 000 lx,溫度28℃,光照/黑暗周期為16 h/8 h[9],培養(yǎng)6 d,每隔1 d更換一次培養(yǎng)液。
1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
玉米幼苗根、莖干重抑制率測(cè)定,依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未提供)設(shè)置:[C4mim]Cl,0、75、200、400、600、800、1000 mg·L-1;[C6mim]Cl,0、10、20、50、100、150 mg·L-1;[C8mim]Cl,0、5、10、25、50、75、100 mg·L-1。
玉米幼苗抗氧化酶系和MDA含量測(cè)定,參照根、莖生物量抑制情況設(shè)置:[C4mim]Cl,0、200、400、600、800 mg·L-1;[C6mim]Cl,0、10、20、30、40 mg·L-1;[C8mim]Cl,0、2、4、6、8 mg·L-1。
以不含ILs的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照,每處理設(shè)3組重復(fù)。
1.4 測(cè)定方法
ILs對(duì)玉米幼苗根、莖重的影響:取培養(yǎng)第7 d的玉米幼苗進(jìn)行測(cè)定,根、莖重均為干重(80℃烘干48 h),根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算根、莖重抑制率,每處理10株重復(fù)。采用Logistic模型[11]擬合根/莖干重抑制率-濃度曲線,并計(jì)算各處理的EC50值。
抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定:稱取0.3 g玉米根/莖鮮樣并勻漿,用于酶液的提取,參照李忠光等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。本研究中所測(cè)定的酶活力為比活力,即每毫克可溶性蛋白所含的酶活力單位。可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法[13];超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用NBT還原法[13];過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[14];過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照Kang等[15]的方法;APX活性參照李忠光等[12]的方法;MDA含量測(cè)定參照鄒琦等[13]的方法。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
用Orgin 7.5對(duì)抑制率進(jìn)行擬合,模型為L(zhǎng)osgitic模型y=(A1-A2)/[1+(x/x0)p]+A2,采用單因素方差分析(ANOVA)并用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。
2.1 三種烴鏈長(zhǎng)度ILs對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響
不同濃度[C4mim]Cl、[C6mim]Cl和[C8mim]Cl培養(yǎng)6 d后,玉米幼苗根、莖生長(zhǎng)均受到明顯抑制,表現(xiàn)為植株細(xì)弱、側(cè)根不生長(zhǎng)等(圖1)。生物量積累是反映植株生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo),對(duì)不同濃度的三種ILs處理下玉米根、莖生物量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),隨著ILs濃度的增加,其對(duì)玉米幼苗根、莖生長(zhǎng)的抑制率也逐漸升高。分別對(duì)不同濃度下[C4mim]Cl、[C6mim]Cl和[C8mim]Cl處理6 d后玉米根、莖重抑制率做曲線,建立玉米幼苗根、莖生長(zhǎng)與離子種類及液體濃度的關(guān)系,并用Logistic模型進(jìn)行擬合(圖2),計(jì)算三種ILs分別對(duì)玉米根、莖干重抑制的EC50值。結(jié)果表明,[C4mim]Cl、[C6mim]Cl和[C8mim]Cl抑制玉米根生長(zhǎng)的EC50分別為194、38.4、2.97 mg·L-1,抑制玉米莖生長(zhǎng)的EC50分別為369、52.9、23.3 mg·L-1。不同烴鏈長(zhǎng)度ILs對(duì)玉米根、莖生長(zhǎng)的抑制情況表現(xiàn)為[C4mim]Cl<[C6mim]Cl<[C8mim]Cl,即三種ILs對(duì)玉米幼苗根、莖生長(zhǎng)的抑制作用隨著烴鏈長(zhǎng)度的增加而增大,且對(duì)根的抑制作用大于莖。
2.2 三種烴鏈長(zhǎng)度ILs對(duì)玉米幼苗根、莖部抗氧化酶活性的影響
經(jīng)不同濃度三種ILs處理6 d后,玉米幼苗根、莖部抗氧化酶活性均發(fā)生變化,結(jié)果如表1至表3所示。玉米幼苗根部SOD活性受到顯著抑制,SOD活性隨ILs濃度的升高而逐漸下降。[C6mim]Cl處理組莖部SOD活性表現(xiàn)為先激活后抑制,30 mg·L-1[C6mim]Cl處理組SOD活性比對(duì)照顯著提高,隨后逐漸下降,而[C8mim]Cl處理組莖部SOD活性被顯著抑制。與對(duì)照相比,800 mg·L-1[C4mim]Cl處理組根部SOD活性下降40.4%;50 mg·L-1[C6mim]Cl處理組根部SOD活性下降42.2%;8 mg·L-1[C8mim]Cl處理組根、莖部SOD活性分別下降了50.8%和45.8%。
玉米幼苗根、莖部POD活性均受到顯著抑制,表現(xiàn)為隨ILs濃度的升高逐漸下降。與對(duì)照相比,800 mg·L-1[C4mim]Cl處理組根、莖部POD活性分別下降53.7%和54.7%;50 mg·L-1[C6mim]Cl處理組根、莖部POD活性分別下降58.8%和37.5%;8 mg·L-1[C8mim]Cl處理組根、莖部POD活性分別下降54.8%和18.5%。
隨著ILs濃度的增加,三種ILs處理下玉米幼苗根、莖部CAT和APX活性均呈逐漸下降趨勢(shì)。同對(duì)照相比,800 mg·L-1[C4mim]Cl處理組根、莖部CAT活性分別降低16.7%和18.6%;50 mg·L-1[C6mim]Cl處理組根、莖部CAT活性分別降低79.3%和12.6%;8 mg·L-1[C8mim]Cl處理組根、莖部CAT活性分別降低72.7%和49.7%;800 mg·L-1[C4mim]Cl處理組根、莖部APX活性分別降低8.4%和54.2%;50 mg·L-1[C6mim]Cl處理組根、莖部APX活性分別降低21.0%和67.0%;8 mg·L-1[C8mim]Cl處理組根、莖部APX活性分別降低29.1%和88.1%。
圖1 三種ILs對(duì)玉米幼苗形態(tài)的影響Figure 1 Effect of three ILs on morphology of maize seedlings
2.3 三種烴鏈長(zhǎng)度ILs對(duì)玉米幼苗根、莖部MDA含量的影響
三種ILs處理組對(duì)玉米幼苗根、莖部MDA含量的影響列于表4和表5。玉米幼苗根、莖部MDA含量均隨ILs處理濃度的增加而上升。800 mg·L-1[C4mim]Cl處理組根、莖部MDA含量為對(duì)照組的6.2倍;40 mg·L-1[C6mim]Cl處理組根、莖部MDA含量為對(duì)照組的5.5倍;8 mg·L-1[C8mim]Cl處理組根、莖部MDA含量為對(duì)照組的5.1倍。三種ILs處理組MDA含量均顯著高于對(duì)照組。
圖2 三種ILs對(duì)玉米幼苗根/莖生物量的濃度-抑制率曲線(Logistic model)Figure 2 Concentration-inhibition rate curves of three ILs treatment on the growth of maize seeding root/shoot
ILs毒性與其種類及陰陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)有關(guān)。在分子結(jié)構(gòu)上,ILs可能是某些抗生素或除草劑的類似物,從而產(chǎn)生相似的毒性效應(yīng)[16-18]。側(cè)鏈基團(tuán)是影響ILs毒性的重要因素。Bubalo等[19]通過(guò)建立定量結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系(QSTR)模型,探討14種帶有功能側(cè)鏈的咪唑類ILs對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲴回卵巢細(xì)胞(CCO)的毒性,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性主要與陽(yáng)離子基團(tuán)的形狀和疏水性相關(guān)。Ma等[20]探討了陰陽(yáng)離子組成對(duì)海洋發(fā)光菌費(fèi)氏弧菌Vibriofischeri的定量結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系,發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子的尺寸、親脂性及三維分子結(jié)構(gòu)是影響ILs毒性的主要因素。在不同生物中的研究表明,ILs毒性隨側(cè)鏈取代基長(zhǎng)度增加而增加[21-24]。究其原因,取代基鏈長(zhǎng)度增加意味著更高的親脂性,因此更容易破壞膜結(jié)構(gòu),對(duì)生物體產(chǎn)生不利影響[25]。本研究取得了相似的結(jié)果,三種ILs對(duì)玉米根莖生長(zhǎng)的抑制作用表現(xiàn)為[C4mim]Cl<[C6mim]Cl<[C8mim]Cl,即側(cè)鏈取代基鏈越長(zhǎng),毒性越高。
表1 不同濃度[C4mim]Cl處理對(duì)玉米根/莖抗氧化酶系的影響Table 1 Effect of[C4mim]Cl at different concentrations on antioxidant enzyme series
表2 不同濃度[C6mim]Cl處理對(duì)玉米根/莖抗氧化酶系的影響Table 2 Effect of[C6mim]Cl at different concentrations on antioxidant enzyme series
表3 不同濃度[C8mim]Cl處理對(duì)玉米根/莖抗氧化酶系的影響Table 3 Effect of[C8mim]Cl at different concentrations on antioxidant enzyme series
表4 ILs對(duì)玉米根部MDA含量的影響Table 4 Effect of ILs on MDA contents in maize roots
表5 ILs對(duì)玉米莖部MDA含量的影響Table 5 Effect of ILs on MDA contents in maize stems
ILs對(duì)生長(zhǎng)的影響并非完全不利。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)[C2mim][OAc]添加可以對(duì)小麥Cd2+脅迫起到明顯的緩解作用,原因是[C2mim][OAc]能夠與Cd2+結(jié)合而使其鈍化。Pernak等[18]發(fā)現(xiàn)ILs因具有與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑矮壯素(CCC)類似的結(jié)構(gòu)而使其具有相似的生物活性。段煉等[27]研究[C4mim]Cl對(duì)藻類的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn),在較低濃度情況下,[C4mim]Cl在處理最開始的一段時(shí)期內(nèi)對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)為輕微的促進(jìn)作用,之后逐漸轉(zhuǎn)為抑制,這暗示了ILs對(duì)生物生長(zhǎng)的影響可能具有更復(fù)雜的生理機(jī)制。
植物在正常生理代謝過(guò)程或不良逆境脅迫下均存在活性氧(ROS)類物質(zhì)的釋放,包括H2O2、-OH、O2-·等,ROS通常來(lái)源于線粒體、葉綠體和過(guò)氧化物體,一般為代謝副產(chǎn)物[17]。植物在干旱、鹽堿、冷凍、病蟲害等不良逆境條件下,均可發(fā)生ROS的過(guò)量積累,引起細(xì)胞發(fā)生中毒反應(yīng),如對(duì)生物大分子的破壞及生物膜的過(guò)氧化等[25,28]。正常情況下,植物通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)(如SOD、POD、CAT和APX等)或一些抗氧化物質(zhì)(如谷胱甘肽、抗壞血酸等)清除自身代謝產(chǎn)生的ROS,使其維持在較低的水平[9]。逆境脅迫會(huì)對(duì)植物ROS代謝產(chǎn)生雙重不利影響:一方面,逆境脅迫會(huì)刺激ROS的大量產(chǎn)生;另一方面,逆境脅迫下植物自身生理機(jī)能衰退,ROS清除能力亦受到限制[29]。
抗氧化酶系統(tǒng)在植物ROS清除過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,其中SOD參與將O2-·轉(zhuǎn)化為O2和H2O2[30],而POD、CAT則參與將H2O2分解為O2和H2O,APX參與將抗壞血酸作為電子供體消除H2O2的過(guò)程[4]。在本研究中,隨著三種ILs處理濃度的增加,根/莖SOD、POD、CAT和APX比活力總體呈逐漸下降趨勢(shì)??梢姡M管三種ILs毒性大小不同,但對(duì)玉米幼苗可能具有相同的毒性機(jī)理,即引起抗氧化酶活性降低。上述變化趨勢(shì)與Bubalo等[25]在小麥中以及Liu等[9]在水稻中的研究一致。此外,[C6mim]Cl處理下莖部SOD活性隨濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律。這可能與低濃度下ROS積累引起SOD活性的“刺激作用”有關(guān)[31],類似的趨勢(shì)在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道[11]。
抗氧化酶活性下降可能會(huì)引起植物體內(nèi)ROS的大量積累,這些活潑ROS極易對(duì)生物膜上的重要結(jié)構(gòu)——脂肪酸分子造成破壞,導(dǎo)致質(zhì)膜過(guò)氧化,同時(shí)產(chǎn)生有毒的醛類物質(zhì)。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物,在植物中,MDA的積累通常作為反映質(zhì)膜過(guò)氧化程度或植物遭受脅迫程度的重要指標(biāo)。本研究中,三種ILs處理均引起玉米幼苗根、莖MDA含量顯著增加,表明ILs處理引起玉米質(zhì)膜過(guò)氧化,對(duì)根、莖造成傷害。質(zhì)膜過(guò)氧化很可能與ROS的過(guò)量積累有關(guān),而這也與抗氧化酶系統(tǒng)活性下降的結(jié)果相符。綜上所述,三種咪唑類ILs對(duì)玉米幼苗的毒性機(jī)理很可能與抗氧化酶活性下降,以及膜脂過(guò)氧化有關(guān),反映出ILs對(duì)植物的影響與干旱、高鹽、冷凍或病蟲害等環(huán)境脅迫具有相似的作用特點(diǎn)??紤]到不同ILs間特殊分子結(jié)構(gòu)及其在工業(yè)生產(chǎn)中的重要作用,有關(guān)ILs對(duì)農(nóng)業(yè)生物的綜合影響還有待更詳盡和深入的探討。
(1)三種ILs([C4mim]Cl、[C6mim]Cl和[C8mim]Cl)對(duì)玉米幼苗根、莖生長(zhǎng)具明顯抑制作用,表現(xiàn)為側(cè)鏈取代基越長(zhǎng),毒性越高;同一種ILs處理下對(duì)根重的抑制率大于莖重。
(2)總體而言,隨濃度增加三種ILs對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT和APX)活性在根、莖中均表現(xiàn)為抑制趨勢(shì),且根、莖部MDA含量顯著增加。
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Effects of imidazolium-based ionic liquids with different hydrocarbon chain Length on growth of maize seedlings
YANG Miao1,HE Jun-ya1,SUN Yu-zhou1,HAN Zhao-xue2,CHEN Xiao-h(huán)ong2,LI Ya-jun1*,WEN Xiao-xia1*
(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)
Ionic liquids(ILs)are considered as ideal solvents in various chemical processes including organic synthesis,catalytic reactions,and separation engineering.However,the hazardous nature and poor biodegradability property of many ILs increase the risk of becoming potential environmental pollutants.Studies of the toxicity of ILs on crop growth could help assess the potential risks of ILs to field ecosystems.Maize has the largest planting area in China.Herein,the effects of three imidazolium-based ionic liquids([C4mim]Cl,[C6mim]Cl,and[C8mim]Cl)on the growth of maize seedlings,as well as some physiological and biochemical indexes,were analyzed.The results suggested that the three ionic liquids had significant inhibitory effects on the dry weight accumulation of maize seedling roots and shoots.According to the logistic regression equation,EC50of ILs for inhibiting maize showed a tendency toward an inhibitory effect:[C4mim]Cl<[C6mim]Cl<[C8mim]Cl.In addition,shoots were inhibited more than roots.Antioxidant enzymes play central roles in plant defense against reactive oxygen species(ROS).The activities of antioxidant enzymes(SOD,POD,CAT,and APX)in maize roots and shoots were analyzed.Generally,the specific activity of the four antioxidant enzymes declined with an increase in IL concentration when exposed to the three ionic liquids.The contents of malondialdehyde(MDA)were significantly increased.The results indicated that oxidative stress may explain the toxic effects of imidazolium-based ILs.
imidazolium-based ionic liquids;hydrocarbon chain length;maize;antioxidant enzyme
X171.5
A
1672-2043(2017)09-1719-07
10.11654/jaes.2017-0570
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2017-04-17
楊 苗(1994—),女,碩士研究生,主要研究方向?yàn)橛衩啄婢成怼-mail:350230865@qq.com
*通信作者:李亞君E-mail:yajun3725@126.com;溫曉霞E-mail:wenxiaoxia6811@163.com
國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31500439,31401303)
Project supported:The Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China(31500439,31401303)