氣滯血瘀證大鼠舌部基因表達譜變化初探

梁耀月，董世芬，程 龍，宋敬怡，施佳晨，馬 丹，孫建寧

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 100102)

研究報告

氣滯血瘀證大鼠舌部基因表達譜變化初探

梁耀月，董世芬，程 龍，宋敬怡，施佳晨，馬 丹，孫建寧*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 100102)

目的采用基因芯片技術(shù)研究氣滯血瘀證模型大鼠舌部全基因表達譜的變化以及差異基因涉及的生物過程和通路，以期為研究血瘀證相關(guān)理論和藥物治療提供科學(xué)依據(jù)。方法采用高脂飼料復(fù)合慢性不可預(yù)知刺激復(fù)制氣滯血瘀動物模型，利用基因芯片技術(shù)分析正常大鼠與模型大鼠舌中全基因表達譜的變化以及所涉及通路。結(jié)果氣滯血瘀證大鼠與正常大鼠比較，結(jié)果顯示差異表達基因有277個，其中上調(diào)基因68個，下調(diào)基因209個。GO和Pathway分析結(jié)果顯示氣滯血瘀證分別與炎癥、脂代謝、免疫反應(yīng)等生物過程以及補體與凝血級聯(lián)通路、PPAR信號通路、細胞色素P450異物代謝通路等7條通路的改變有關(guān)。結(jié)論CYP450以及補體與凝血級聯(lián)通路、PPAR信號通路中的差異基因可能涉及血瘀證的發(fā)病機制，為血瘀證以及相關(guān)藥物的研究提供依據(jù)。

氣滯血瘀證；舌；基因芯片；大鼠

血瘀證通常指因氣虛、氣滯、寒凝、血熱、痰阻和外傷等原因，導(dǎo)致血行不暢、壅阻血脈或出血未能及時消散而引起的病證[1]，一般認為與血液循環(huán)和微循環(huán)障礙、血液高黏滯狀態(tài)、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、組織和細胞代謝異常、免疫功能障礙等多種病理變化有關(guān)[2]。同時與多種疾病的形成有關(guān)，包括心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等疾病[3]。舌診是血瘀證臨床診斷的主要組成部分，對于不同疾病血瘀證量化診斷有重要貢獻，如舌質(zhì)紫黯、舌脈曲張均入選高血壓、冠心病和腦血管病的血瘀證診斷危險因子[4]，提示血瘀證發(fā)生時舌部的生物物質(zhì)基礎(chǔ)研究對血瘀證發(fā)生時疾病網(wǎng)絡(luò)變化及相關(guān)藥物研究有重要意義。

在本課題組前期實驗研究中，我們采用高脂飼料飼養(yǎng)復(fù)合慢性不可預(yù)知刺激可模擬出氣滯血瘀證癥狀，發(fā)現(xiàn)模型大鼠情志出現(xiàn)異常，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)上升，心功能檢測顯示收縮末期左室前壁厚度、后壁厚度、舒張期左心室指數(shù)均發(fā)生異常[5]。此外通過色度分析觀測到模型大鼠的舌質(zhì)出現(xiàn)瘀斑、暗紫等表征變化。因此本研究在此基礎(chǔ)之上，利用基因芯片技術(shù)研究氣滯血瘀證模型大鼠與正常大鼠舌部位全基因表達譜的差異，以期為研究血瘀證相關(guān)理論和藥物治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠20只，4周齡，體重(120±10) g，雄性，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供【SCXK(京)2011-0004】，在北京中醫(yī)藥大學(xué)無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)的實驗動物室【SYXK(京)2011-0024】飼養(yǎng)，每日光照12 h，房間溫度和濕度保持在(23±1)℃和(65±5)%。

1.2藥品與試劑

RNA 6000試劑盒(Agilent，批號：5067-1511)，熒光標(biāo)記Cy5(GE，批號：PA15106)，無核酸酶水(Sigma，批號：W4502)，OneArray Amino Allyl aRNA擴增試劑盒，預(yù)雜交液，標(biāo)記和雜交試劑盒，全基因組表達芯片，洗滌緩沖液I，洗滌緩沖液II，洗滌緩沖液III，以上試劑均由華聯(lián)生物科技股份有限公司提供。

1.3儀器

G2940CA安捷倫2100生化分析儀(美國安捷倫科技公司)；ND1000超微量分光光度儀(賽默飛世爾科技公司)；Alpha Imager 2200凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)；5415R微型離心機(德國Eppendorf公司)；9700 PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；HR-80雜交爐(華聯(lián)生物科技股份有限公司)；G2505C安捷倫微陣列芯片掃描儀(美國安捷倫科技公司)。

1.4實驗方法

1.4.1 動物的模型建立與標(biāo)本采集

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，將動物隨機分為正常對照組和高脂飼料+慢性刺激組2組，每組10只。高脂飼料+慢性刺激組大鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)并給予慢性不可預(yù)知刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，刺激因素包括噪聲(40 kHz，1 min/只，每間隔5 min給予刺激1次，1天60次)、夾尾(1 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、電刺激(30 V，1 min)、晝夜顛倒(24 h)。上述刺激每日一種，隨機安排，使動物不能預(yù)知次日的刺激，持續(xù)6周。6周后麻醉，快速取動物舌并迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆?。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.4.2 總RNA的提取、純化及芯片雜交

RNA提取分離、探針標(biāo)記與雜交、基因芯片制作檢測等均由華聯(lián)生物科技股份有限公司提供服務(wù)。采用TRIzol試劑進行舌的總RNA提取，所得總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定濃度、毛細管電泳質(zhì)檢合格后對樣品總RNA中的mRNA進行放大和熒光染料標(biāo)記并純化標(biāo)記后的aRNA。產(chǎn)物純化后與Phalanx OneArrayTM進行雜交反應(yīng)，經(jīng)清洗及訊號偵測后進入分析流程。

1.4.3 芯片掃描及數(shù)據(jù)分析

芯片雜交結(jié)果用安捷倫微陣列芯片掃描儀進行掃描，再利用GenePixTM4進行影像數(shù)據(jù)擷取，然后應(yīng)用Rosetta Resolver?系統(tǒng)(Rosetta Biosoftware)進行數(shù)據(jù)前處理(含數(shù)據(jù)篩選、校正)與統(tǒng)計計算等過程，根據(jù)|log2(Ratio)| ≥ 1與差異表達的P值≤ 0.05篩選差異有顯著性的基因。并對差異基因進行GO功能富集和Pathway分析。

2 結(jié)果

2.1RNA的質(zhì)檢結(jié)果

紫外線分光光度計結(jié)果顯示：A260/A280均大于或等于1.8；A260/A230均大于或等于1.5，表明總RNA純度高且總含量均在5 μg以上，毛細管電泳RIN均大于或等于6(圖1、圖2)，證明總RNA的完整性較好，符合基因芯片的實驗要求。

圖1 正常組大鼠舌頭RNA質(zhì)檢結(jié)果Fig.1 Results of quality inspection of the tongue RNA in normal rats

圖2 高脂+慢性刺激組大鼠舌頭RNA質(zhì)檢結(jié)果Fig.2 Results of quality inspection of the tongue RNA in rats treated with high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress

2.2芯片雜交結(jié)果

2.2.1 芯片掃描圖

圖中熒光點亮度的強弱代表了樣品中基因表達的強弱，越亮表示基因表達越強；信號很弱，甚至不明顯的點是表達很弱甚至不表達的基因。圖中芯片雜交信號清晰、均衡，從中可以看出，用一張芯片、一次雜交反應(yīng)就能在全基因組范圍內(nèi)同時檢測近萬個基因的表達情況以及它們之間相互調(diào)節(jié)的關(guān)系(圖3、圖4)。

圖3 正常組大鼠基因芯片掃描圖Fig.3 Gene chip scanning of the normal rats

2.2.2 差異基因的篩選結(jié)果

本實驗應(yīng)用全基因組表達譜芯片對正常組大鼠與氣滯血瘀證大鼠味蕾中基因進行分析，高脂+慢性刺激組與正常組相比有277個基因差異表達，其中上調(diào)基因68個，下調(diào)基因209個，部分差異表達基因見表1、2。以差異倍數(shù)(log2|Fold change|)為橫坐標(biāo)，以-lg(P值)為縱坐標(biāo)作圖。紅/綠色虛線分別代表P值及倍數(shù)篩選的閾值，即|Fold change| ≥ 1且P< 0.05。圖中每一個點為一個檢出的基因探針(不含控制探針及flagged探針)，差異探針標(biāo)示為藍色點，見圖5。

圖5 高脂+慢性刺激組/正常組火山圖Fig.5 Volcano figure of the rats treated with high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress vs.the normal rats

2.2.3 差異基因GO聚類及Pathway分析結(jié)果

GO將基因功能劃分為生物過程、分子功能和細胞組成三個方面，通過GO分析可以找到差異基因出現(xiàn)富集的GO分類條目，尋找不同組別的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。GO分析結(jié)果顯示，涉及54項生物過程，20項分子功能，5項細胞組成，其中血瘀證的發(fā)生與脂代謝、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多個生物過程有關(guān)，部分結(jié)果見表3。Pathway分析結(jié)果顯示，以上差異基因主要涵蓋了7條通路，主要涉及免疫、脂代謝方面，具體見表4。

表1 部分上調(diào)表達基因

表2 部分下調(diào)表達基因

表3 差異基因的部分GO功能注釋

表4 Pathway功能分析結(jié)果

3 討論

血瘀證診斷是中醫(yī)傳統(tǒng)特色診斷之一，多由血行不暢或血流瘀滯形成，傳統(tǒng)觀點認為久病多瘀、慢病多瘀，血瘀為百病之源[3]，臨床主要表現(xiàn)特征包括舌暗、有瘀點或瘀斑、舌下靜脈曲張、唇痿舌青、口燥但欲漱水不欲咽、疼痛夜甚或痛處不移、脈微大來遲或澀等[1]。舌象臨床表征是臨床診斷血瘀的重要依據(jù)[6]，中醫(yī)舌診專家系統(tǒng)根據(jù)計算機色彩視覺理論，運用色彩分析技術(shù)，對舌質(zhì)、舌苔進行量化診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血瘀舌象變化以舌質(zhì)暗紫、瘀斑瘀點，舌脈曲張青紫為主，舌苔也有一定變化[7]。同時，整體動物研究也提供了相關(guān)依據(jù)。吳晏等人在構(gòu)建的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)模型大鼠較正常大鼠舌色鮮紅比率、舌干少津比率升高[8]。郭淑貞等[9]采用舌苔RGB值(三基色，R為紅色，G為綠色，B為藍色)定量分析氣虛血瘀證小型豬舌色變化的方法，發(fā)現(xiàn)差異蛋白Spot20、Spot6、Spot20分別與舌R、G、B值呈線性相關(guān)。舌象臨床表征的變化體現(xiàn)的是血瘀證的內(nèi)在病理變化，必然存在其內(nèi)在的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，因此觀察舌的生物學(xué)物質(zhì)變化可能是研究血瘀證以及相關(guān)治療藥物的切入點。

本課題組前期采用高脂膳食負荷慢性不可預(yù)知性刺激建立了擬臨床氣滯血瘀證變化的大鼠模型，該模型表現(xiàn)出行為學(xué)、血液黏度、心臟功能、血脂等指標(biāo)的異常，同時采用色度分析觀測到大鼠的舌質(zhì)出現(xiàn)瘀斑、暗紫等變化?；蛐酒?gene chip)技術(shù)是用于檢測大數(shù)據(jù)量核酸的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，該技術(shù)是利用已知的DNA片段排列于固相載體，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄原理擴增樣品中的未知DNA并與芯片結(jié)合，從而推測樣品DNA種類的技術(shù)。本技術(shù)的特點就是高通量篩選出與疾病關(guān)系最密切的候選基因。本研究觀察到氣滯血瘀證大鼠與正常大鼠比較，舌部的顯著差異基因有277個，與炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、免疫反應(yīng)、細胞黏附等病理過程有關(guān)，反映了舌部的基因所體現(xiàn)的病理過程與血瘀證的病理過程高度一致。同時，這些差異基因的通路功能主要集中在補體與凝血級聯(lián)通路、細胞色素P450物質(zhì)代謝通路、PPAR信號通路等7條通路，為深入研究血瘀證發(fā)生時舌部的生物信號網(wǎng)絡(luò)變化提供了依據(jù)。詳述如下：

補體系統(tǒng)由三個相互獨立但相互作用的途徑組成，即經(jīng)典、替代和凝集素途徑[10]，除了增強適應(yīng)性免疫反應(yīng)外，在先天免疫中起著基礎(chǔ)性的作用[11]。Nijmeijer等[12]研究發(fā)現(xiàn)C反應(yīng)蛋白可以作為激活補體經(jīng)典途徑的激動劑，在急性心肌梗死疾病中可能是通過激活補體起到促炎介質(zhì)的作用。此外多項研究表明動脈粥樣硬化的加速發(fā)展和血栓形成的易感性增加與替代補體調(diào)節(jié)的缺陷有關(guān)[13-15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，新的分子在補體和凝血級聯(lián)通路中發(fā)揮著重要作用，這是由于C1抑制物既是補體經(jīng)典和凝集素途徑的主調(diào)節(jié)因子，同時也是接觸激活系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子[16-19]。在本實驗中我們可以發(fā)現(xiàn)舌部位補體與凝血級聯(lián)通路的改變最為明顯，這提示我們血瘀證的發(fā)病可能與該通路的改變有密切關(guān)系，至于具體的機制有待進一步研究。

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)最初僅在肝臟中發(fā)現(xiàn)，后陸續(xù)在其他組織器官中發(fā)現(xiàn)，并且隨著研究的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)CYP家族中的成員的功能與疾病的發(fā)生與治療密切相關(guān)。Edin等[20]研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞中細胞色素P4502J2的表達對于缺血再灌注損傷起到保護作用，但內(nèi)皮細胞CYP2J2的表達對于缺血再灌注損傷幾乎是沒有任何作用的。而內(nèi)皮細胞CYP2C8的表達增加了活性氧的生成，使冠狀動脈血管收縮增強，梗死面積增加并減少了左心室功能恢復(fù)。此外，Pingili等[21]研究發(fā)現(xiàn)在雄性小鼠中，CYP1B1的睪酮代謝物可能是高血壓的一個致病因素，并且與心肌肥厚、纖維化、NADPH氧化酶活性增加、氧化應(yīng)激有關(guān)。在本實驗中可以發(fā)現(xiàn)藥物代謝通路、視黃醇代謝通路、細胞色素P450物質(zhì)代謝通路以及花生四烯酸代謝通路中均涉及到CYP450家族成員CYP2A3，CYP2B21，CYP2F4，CYP3A2，Cyp3A9以及未富集到通路中的差異基因CYP2C7，可以推測CYP450可能與血瘀證的發(fā)生有密切關(guān)系，需要進一步實驗驗證。

過氧化物酶體增值劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)基因?qū)儆陬惞檀?甲狀腺/維甲酸受體超家族，有3個亞型：PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ，具有多種生物學(xué)功能，尤其在脂肪分化、生成等多方面起到重要調(diào)節(jié)作用[22]。PPAR-γ在脂肪分化中起著關(guān)鍵作用，是脂質(zhì)和碳水化合物代謝的主要調(diào)節(jié)劑[23]。采用網(wǎng)絡(luò)分析方法從化學(xué)成分、靶點、疾病三個層面對補陽還五湯進行研究，挖掘補陽還五湯作用的關(guān)鍵靶點，得到COX-2與PPAR-γ兩個重要靶點，這兩個靶點可能是參與氣虛血瘀型疾病病理過程的重要靶點[24]。在本實驗中，差異基因富集到PPAR信號通路，可以推測PPAR信號通路可能與血瘀證的發(fā)生有密切關(guān)系，在該通路中的差異基因可能是其主要病變因素，至于具體機制有待進一步研究。

綜上，本研究采用全基因芯片技術(shù)，初步探討氣滯血瘀證發(fā)病過程中可能存在的差異基因，闡明氣滯血瘀證的發(fā)病機制并尋找到藥物改善疾病潛在的作用靶點。至于具體機制有待進一步研究。

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PreliminarystudyonchangesingenomeexpressionprofilesofthetongueinratswithQi-stagnationandbloodstasis

LIANG Yao-yue， DONG Shi-fen， CHENG Long， SONG Jing-yi， SHI Jia-chen， MA Dan， SUN Jian-ning*

(Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo study the changes in whole genome expression profiles of the tongue in a rat model of Qi-stagnation and blood stasis by gene chip microarray as well as the biological processes and pathways related to the differentially expressed genes, and to provide scientific evidence for studies of the related theories and drug therapies of blood stasis syndrome.MethodsThe rat model of Qi-stagnation and blood stasis was established by high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress (CUMS). Changes of the whole genome expression profiles of the tongue in normal rats and model rats and the involved pathways were analyzed by gene chip microarray.ResultsCompared with the normal rats, the rats with Qi-stagnation and blood stasis showed 277 differentially-expressed genes, including 68 up-regulated and 209 down-regulated genes. Gene ontology (GO) and pathway analysis showed that the syndrome of Qi-stagnation and blood stasis is related to biological processes such as inflammation, lipid metabolism and immune responses, as well as the alterations in 7 pathways including the complement and coagulation cascade pathway, the PPAR signaling pathway, and the pathway of xenobiotic metabolism by cytochrome P450.ConclusionsThe differentially-expressed genes, which are involved in CYP450 and complement and coagulation cascade pathway and PPAR signal pathway, may be related to the pathogenesis of blood stasis syndrome, and provide evidence for studies of blood stasis and related drug development.

Syndrome of Qi-stagnation and blood stasis; Tongue; Gene chip; Rats

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0011-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.003

2017-01-13

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81503287，81430094)；教育部博士點基金(編號：20130013120002)。

梁耀月(1989 -)，女，碩士，研究方向：中藥防治心腦血管疾病的研究。E-mail: lyy2610@163.com

孫建寧(1952 -)，女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail： jn_sun@sina.com