轉(zhuǎn)基因小鼠常見傳染病血清學(xué)液相芯片技術(shù)多重檢測方法的建立

陳 誠，朱科燕，褚燕青，齊月寒，蔡月琴

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053)

轉(zhuǎn)基因小鼠常見傳染病血清學(xué)液相芯片技術(shù)多重檢測方法的建立

陳 誠，朱科燕，褚燕青，齊月寒，蔡月琴*

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，建立轉(zhuǎn)基因小鼠傳染病抗體的xMAP多重檢測方法。方法將熒光微球分別與小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，并且對最佳蛋白偶聯(lián)量、檢測抗體最佳工作濃度和Streptavidin-PE最佳工作濃度進(jìn)行優(yōu)化，制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行xMAP多重檢測。并應(yīng)用傳統(tǒng)的ELISA方法對xMAP檢測結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果1)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯(lián)量分別為20 μg、20 μg、40 μg和20 μg，檢測抗體最佳濃度分別為2 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL；Streptavidin-PE抗體最佳濃度均為2 μg/mL；(2)xMAP檢測結(jié)果顯示，14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清MHV MFI值和index值均高于質(zhì)控血清，其余小鼠血清的MFI值和index值均低于質(zhì)控血清，表明14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性，其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗體陰性；(3)ELISA檢測結(jié)果顯示，14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHVA450值和index值均高于質(zhì)控血清，其余小鼠血清的A450值和index值均低于質(zhì)控血清，表明14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性，其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗體陰性，該ELISA檢測結(jié)果與xMAP檢測結(jié)果相一致。結(jié)論建立的xMAP多重檢測技術(shù)可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠的傳染病檢測。

轉(zhuǎn)基因小鼠；傳染??；xMAP技術(shù)；液相芯片

xMAP技術(shù)(flexible multi-analyte profiling)，又稱液相芯片技術(shù)，該技術(shù)的核心是將微球用熒光染色進(jìn)行編碼，然后將每種編碼微球共價交聯(lián)上針對特定檢測物的抗原、抗體或核酸探針等捕獲分子，把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯(lián)的捕獲分子發(fā)生特異性結(jié)合，最后通過儀器的激光分別識別微球的編碼和檢測微球上報告分子的熒光強(qiáng)度[1, 2]。

轉(zhuǎn)基因動物已成為當(dāng)今生命科學(xué)中一個發(fā)展最快、最熱門的領(lǐng)域，用轉(zhuǎn)基因動物的方法構(gòu)建人類疾病模型可為研究提供理想的動物模型，但是目前轉(zhuǎn)基因小鼠的微生物質(zhì)量不容樂觀，這將嚴(yán)重危害人類健康和科研實驗[3, 4]。根據(jù)對實驗小鼠的致病性和對實驗人員的危害來看，必須對小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCM)、鼠痘病毒(ectromilia virus，ECT)、漢坦病毒(Hantaan virus，HANT)進(jìn)行監(jiān)測，排除此類病原體[5-8]。本研究擬通過制備MHV、LCM、ECT和HANT蛋白芯片，建立快速、高通量的血清學(xué)多重xMAP技術(shù)，并用ELISA方法驗證，為最終建立轉(zhuǎn)基因小鼠的傳染病監(jiān)測體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實驗動物

56只轉(zhuǎn)基因小鼠，其中1～22號于2016年3月從國內(nèi)某動物研究所引進(jìn)，23～56號于2015年分批從國外實驗室引進(jìn)，均飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗研究中心屏障級轉(zhuǎn)基因動物隔離飼養(yǎng)室 [SYXK (浙) 2013-0184]，溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%。1.2實驗試劑

體外重組的MHV、LCM、ECT和HANT蛋白以及biotin標(biāo)記的MHV、LCM、ECT和HANT抗體均購自武漢華美公司；熒光標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-PE)購自Invitrogen公司；活化劑EDC、Sulfo-NHS購自Thermo公司；96孔PVDF濾膜板購自Millipore公司；熒光微球、鞘液、Bio-Plex校正試劑盒均購自Bio-Rad公司；小鼠MHV、LCM、ECT和HANT陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清以及ELISA試劑盒均購自Smart公司。

1.3實驗方法

1.3.1 樣品制備

分別從新引進(jìn)的轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴取適量血，置于1.5 mL離心管中，4℃，3000 r/min，離心10 min，分離血清，-20℃凍存。

1.3.2 小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片的制備

一種編碼的熒光微球?qū)?yīng)偶聯(lián)一種蛋白，30號、36號、47號和56號4種熒光微球，分別與體外重組親和純化的MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，每種蛋白設(shè)置4個梯度(分別為10、20、40和80 μg)。熒光微球經(jīng)S-NHS、EDC活化液室溫避光活化30 min，分別與10、20、40和80 μg的MHV蛋白偶聯(lián)，在垂直旋轉(zhuǎn)儀上室溫避光偶聯(lián)2 h，已偶聯(lián)蛋白的微球加1% BSA封閉1 h，該微球即為制備的小鼠MHV單重液相芯片，于4℃避光保存，用于后期效率驗證。

按照以上制備方案，將36號熒光微球與LCM蛋白偶聯(lián)，47號熒光微球與ECT蛋白偶聯(lián)，56號熒光微球與HANT蛋白偶聯(lián)制備液相芯片。

1.3.3 小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備的驗證及蛋白最佳偶聯(lián)量的確定

將制備的小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片與PE抗體直接反應(yīng)，陰性孔加入未偶聯(lián)蛋白的微球作為陰性對照，在Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測熒光值。MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片的熒光值超過2000熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity，MFI)，陰性對照孔低于100 MFI，即可認(rèn)為偶聯(lián)成功。每組芯片中，選取與最高蛋白濃度差異無顯著性的蛋白量作為最佳偶聯(lián)量。

1.3.4 檢測抗體和Streptavidin-PE最佳工作濃度的確定

用1% PBSB溶液分別將biotin標(biāo)記的MHV、LCM、ECT和HANT抗體稀釋成4個濃度組，分別為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，Streptavidin-PE稀釋成3個濃度組，分別為1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，每組3個復(fù)孔，采用棋盤滴定法確定最佳檢測抗體濃度和Streptavidin-PE工作濃度。

1.3.5 小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的xMAP檢測

用制備的MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行xMAP檢測。取PVDF濾膜板，同一反應(yīng)孔分別加入100 μL(1×104個)MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片微球，用PBST溶液洗滌兩次，25 μL小鼠血清，室溫避光慢搖(450 r/min)60 min，洗滌3次，加入混合的biotin標(biāo)記的MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體，100 μL/孔，室溫避光慢搖(450 r/min)60 min，洗滌3次，每孔加入100 μL Streptavidin-PE，室溫避光慢搖(450 r/min)30 min，洗滌3次，在液相懸浮芯片系統(tǒng)上機(jī)檢測熒光值，得到每個樣品的MFI值，小鼠血清樣品的index=血清樣品的MFI值/質(zhì)控血清的MFI值。

1.3.6 小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的ELISA驗證

分別用MHV、LCM、ECT和HANT進(jìn)口ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行檢測。分別取50 μL陰性血清、陽性血清、稀釋后的小鼠血清樣品和質(zhì)控血清加入到包被MHV抗體的酶標(biāo)板孔中，按照MHV試劑盒說明書操作，最后在多功能酶標(biāo)儀上檢測A450。按照以上操作方法，用LCM、ECT和HANT ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法和結(jié)果判定

2 結(jié)果

2.1小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備的驗證和最佳偶聯(lián)量的確定

MHV、LCM、ECT和HANT陰性孔的熒光值分別為16.2 MFI、10.5 MFI、12.0 MFI和9.8 MFI，均低于100 MFI。表1顯示，在MHV、LCM、ECT和HANT中，4組偶聯(lián)量的熒光值均大于2000 MFI，表明MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備成功。

表1可以看出，在MHV、LCM和HANT芯片中，20 μg組、40 μg組、80 μg捕獲抗體組的MFI值均顯著高于10 μg組(P< 0.01)，40 μg組、80 μg組與20 μg組比較差異無顯著性(P> 0.05)；在ECT芯片中，40 μg組、80 μg捕獲抗體組的MFI值均顯著高于10 μg組和20 μg組(P< 0.05，P< 0.01)，40 μg組與80 μg組差異無顯著性(P> 0.05)。根據(jù)以上優(yōu)化試驗，MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯(lián)量分別為20、20、40和20 μg捕獲抗體。

2.2小鼠MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度的確定

Biotin標(biāo)記的MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體稀釋為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 4組，表2結(jié)果顯示，在MHV、LCM和ECT中，4 μg/mL組、2 μg/mL組的MFI值均顯著高于0.5 μg/mL、1 μg/mL組(P< 0.01)，4 μg/mL組與2 μg/mL組差異無顯著性(P> 0.05)；在HANT中，4 μg/mL組的MFI值最高，顯著高于0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL組(P< 0.05，P< 0.01)。據(jù)此，MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度分別為2 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL。

表1 MHV、LCM、ECT和HANT不同蛋白偶聯(lián)量的熒光值(MFI)

注：與10 μg蛋白偶聯(lián)量組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與20 μg蛋白偶聯(lián)量組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the group of 10 μg-captured antibody,*P< 0.05,**P< 0.01; Compared with the group of 20 μg-captured antibody,#P< 0.05,##P< 0.01.

表2 MHV、LCM、ECT和HANT不同檢測抗體濃度的熒光值(MFI)

注：與0.5 μg/mL檢測抗體組相比，**P< 0.01；與1 μg/mL檢測抗體組相比，##P< 0.01；與2 μg/mL檢測抗體組相比，△P< 0.05。

Note. Compared with the group of 0.5 μg/mL detection antibody,**P< 0.01; Compared with the group of 1 μg/mL detection antibody,##P< 0.01; Compared with the group of 2 μg/mL detection antibody,△P< 0.05.

表3 MHV、LCM、ECT和HANT不同Streptavidin-PE抗體濃度的熒光值(MFI)

注：與1 μg/mL Streptavidin-PE組相比，**P< 0.01；與2 μg/mL Streptavidin-PE組相比，##P< 0.01。

Note. Compared with 1 μg/mL Streptavidin-PE,**P< 0.01; Compared with 2 μg/mL Streptavidin-PE,##P< 0.01.

2.3Streptavidin-PE最佳工作濃度的確定

Streptavidin-PE濃度有1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 3組，由表3可見，在MHV、LCM、ECT和HANT中，2 μg/mL、4 μg/mL組的MFI值均顯著高于1 μg/mL組(P< 0.01)，4 μg/mL組與2 μg/mL組相比差異無顯著性(P> 0.05)。表明，MHV、LCM、ECT和HANT的最佳Streptavidin-PE抗體濃度均為2 μg/mL。

2.4小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的xMAP檢測結(jié)果

14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的MHV MFI值分別為18813.88、16924.57、20780.34和13659.18，index值分別為2.6823、2.4130、2.9627和1.9474，均高于質(zhì)控血清的MFI值(7014.04)和index值(1.0000)，表明14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性；1～13號、15～22號、24～54號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的MHV MFI值和index值均低于質(zhì)控血清的MFI值和index值，表明這些轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陰性。1～56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的LCM、ECT和HANT的MFI值和index值均低于質(zhì)控血清的MFI值和index值，表明這些轉(zhuǎn)基因小鼠LCM、ECT和HANT抗體陰性。

2.5小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的ELISA方法驗證

分別用進(jìn)口MHV、LCM、ECT和HANT ELISA試劑盒對同一批56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行檢測，得到每個樣品的A450值，小鼠血清樣品的index=血清樣品的A450值/質(zhì)控血清的A450值。14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的MHVA450值分別為3.3127、3.0113、3.6234和2.4365，index值分別為2.5437、2.3122、2.7822和1.8709，均高于質(zhì)控血清的A450值(1.3023)和index值(1.0000)，表明14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性；1～13號、15～22號、24～54號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的MHVA450值和index值均低于質(zhì)控血清的A450值和index值，表明這些轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陰性。1～56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清的LCM、ECT和HANT的MFI值和index值均低于質(zhì)控血清的A450值和index值，表明這些轉(zhuǎn)基因小鼠LCM、ECT和HANT抗體陰性。

由此表明，轉(zhuǎn)基因小鼠血清的MHV、LCM、ECT和HANT抗體ELISA結(jié)果與xMAP檢測結(jié)果相一致。

3 討論

在醫(yī)學(xué)研究中，利用轉(zhuǎn)基因動物建立各種人類疾病的動物模型，為深入研究疾病的發(fā)病機(jī)理以及基因治療創(chuàng)造了前所未有的條件[9, 10]。目前，國內(nèi)使用的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游镏饕孕∈鬄橹鳎蟛糠洲D(zhuǎn)基因小鼠通過代購或者自行攜帶方式從國外輸入，由于受飼養(yǎng)環(huán)境控制條件不同等限制，轉(zhuǎn)基因小鼠的微生物質(zhì)量存在著嚴(yán)重的問題。由于多數(shù)感染病毒的轉(zhuǎn)基因小鼠早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，必須依賴實驗室進(jìn)行診斷，常用的血清學(xué)檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[11, 12]。ELISA這種傳統(tǒng)檢測方法的主要缺點在于每個反應(yīng)僅能對標(biāo)本的一種傳染病指標(biāo)進(jìn)行檢測，且操作耗時較長、成本較高、血清樣本使用量較大，不適用于轉(zhuǎn)基因小鼠多種傳染病的多重檢測和快速診斷。

xMAP技術(shù)即多功能多指標(biāo)同步分析技術(shù)，提供了一個高通量的多重分子檢測技術(shù)平臺[13]。xMAP技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA檢測方式有很大的區(qū)別，該技術(shù)可以在一種反應(yīng)體系中放入許多不同編碼的熒光微球，多種微球可以標(biāo)記上多種不同的蛋白，每種熒光微球?qū)?yīng)一種傳染病待測指標(biāo)，因此xMAP技術(shù)同時可對一份血清樣品進(jìn)行多種分析指標(biāo)的檢測，標(biāo)本利用率大大提高，從而實現(xiàn)樣品量少的轉(zhuǎn)基因動物血清的高通量分析[14, 15]。本研究應(yīng)用了30號、36號、47號和56號4種微球，分別與MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進(jìn)行共價偶聯(lián)，并且對小鼠MHV、LCM、ECT和HANT懸浮芯片制備中的最佳蛋白偶聯(lián)量進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯(lián)量分別為20 μg、20 μg、40 μg和20 μg，表明每種蛋白的最佳偶聯(lián)量存在差異，因此每個蛋白必須確定其最佳偶聯(lián)量。此外本研究對小鼠MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度和Streptavidin-PE最佳工作濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取與最高M(jìn)FI值組無顯著性差異的抗體濃度作為檢測抗體和Streptavidin-PE的最佳工作濃度。

根據(jù)上述優(yōu)化的條件，制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行xMAP檢測，發(fā)現(xiàn)陰性血清MHV、LCM、ECT和HANT中的index值均低于1.0，陽性血清的index值均高于1.0，表明該xMAP檢測結(jié)果可信。從結(jié)果中看出，只有14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠血清MHV的index值均高于1.0，表明14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性。此外分別用進(jìn)口小鼠MHV、LCM、ECT和HANT的ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質(zhì)控血清進(jìn)行一一檢測，發(fā)現(xiàn)只有14號、23號、55號和56號轉(zhuǎn)基因小鼠MHV抗體陽性，其余為陰性，該ELISA檢測結(jié)果與xMAP檢測結(jié)果相一致。

這些結(jié)果表明本研究建立的xMAP多重檢測技術(shù)可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠的傳染病檢測，可對一份少量的血清樣品進(jìn)行多種傳染病指標(biāo)的檢測，克服了ELISA每個反應(yīng)僅能檢測一種傳染病指標(biāo)的缺點，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠傳染病抗體的高通量分析，為建立轉(zhuǎn)基因小鼠的傳染病監(jiān)測體系奠定基礎(chǔ)。

[1] Simonova MA, Valyakina TI, Petrova EE, et al. Development of xMAP assay for detection of six protein toxins [J]. Anal Chem, 2012, 84(15): 6326-6330.

[2] Thierry S, Derzelle S. Multiplexed genotyping ofBacillusanthracisby Luminex xMAP suspension array [J]. Methods Mol Biol, 2015, 1247: 401-412.

[3] Li W, Shuai L, Wan H, et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice [J]. Nature, 2012, 490(7420): 407-411.

[4] Li LP, Lampert JC, Chen X, et al. Transgenic mice with a diverse human T cell antigen receptor repertoire [J]. Nat Med, 2010, 16(9): 1029-1034.

[5] Van Cuong N, Carrique-Mas J, Vo Be H, et al. Rodents and risk in the Mekong Delta of Vietnam: seroprevalence of selected zoonotic viruses in rodents and humans [J]. Vector Borne Zoonotic Dis, 2015, 15(1): 65-72.

[6] Parker S, Crump R, Foster S, et al. Co-administration of the broad-spectrum antiviral, brincidofovir (CMX001), with small-pox vaccine does not compromise vaccine protection in mice challenged with ectromelia virus [J]. Antiviral Res, 2014, 111: 42-52.

[7] Islam MM, Toohey B, Purcell DF, et al. Suppression subtractive hybridization method for the identification of a new strain of murine hepatitis virus from xenografted SCID mice [J]. Arch Virol, 2015, 160(12): 2945-2955.

[8] Ma C, Wang Z, Li S, et al. Analysis of an outbreak of hemorrhagic fever with renal syndrome in college students in Xi’an, China [J]. Viruses, 2014, 6(2): 507-515.

[9] Todd JA. Intolerable secretion and diabetes in tolerant transgenic mice, revisited [J]. Nat Genet, 2016, 48(5): 476-477.

[10] 葉廷巧, 馬雙陶, 李丹, 等. 鈣蛋白酶抑制蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建和鑒定 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2014, 22(4): 47-51.

[11] Plastino M, Fava A, Pirritano D, et al. Effects of insulinic therapy on cognitive impairment in patients with Alzheimer disease and diabetes mellitus type-2 [J]. J Neurol Sci, 2010, 288 (1-2): 112-116.

[12] Sims-Robinson C, Kim B, Rosko A, et al. How does diabetes accelerate Alzheimer disease pathology? [J]. Nat Rev Neurol, 2010, 6(10): 551-559.

[13] Bongoni AK, Lanz J, Rieben R, et al. Development of a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of porcine inflammation markers using xMAP technology [J]. Cytometry A, 2013, 83(7): 636-647.

[14] Wang LS, Leung YY, Chang SK, et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease [J]. J Alzheimers Dis, 2012, 31(2): 439-445.

[15] Codorean E, Nichita C, Albulescu L, et al. Correlation of XMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studiesinvitro[J]. Roum Arch Microbiol Immunol, 2010, 69(1): 13-19.

Establishmentofaflexiblemulti-analyteprofilingassaytodetectcommoninfectiousdiseaseantibodiesintheserumoftransgenicmice

CHEN Cheng， ZHU Ke-yan， CHU Yan-qing， Qi Yue-han， CAI Yue-qin*

(Animal Experiment Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

ObjectiveTo establish a multiplex xMAP assay for detection of infectious disease antibodies in the serum of transgenic mice by liquid chips of mouse MHV, LCM, ECT and HANT proteins.MethodsThe fluorescent microspheres were conjugated with mouse MHV, LCM, ECT and HANT proteins, and the amount of protein-conjugates and the working concentrations of antibodies and Streptavidin-PE were optimized, respectively. The liquid chips of mouse MHV, LCM, ECT and HANT were prepared and used to detect the antibodies in the serum samples from 56 transgenic mice, together with the negative, positive and control serum, by the multiplex xMAP assay. The results of xMAP assay were verified by traditional ELISA.Results(1) The optimal conjugated amount of mouse MHV, LCM, ECT and HANT protein was 20 μg, 20 μg, 40 μg and 20 μg, respectively. The optimal concentration of their detection antibodies was 2 μg/mL, 2 μg/mL, 2 μg/mL and 4 μg/mL, and the optimal concentration of Streptavidin-PE for all of them was 2 μg/mL. (2) The results of xMAP assay showed that the MFI and index values of the serum samples from the No. 14, No. 23, No. 55 and No. 56 transgenic mice detected with the liquid chip of MHV were higher than those of the control serum, while other MFI and index values were lower than those of the control serum, indicating that the antibodies of MHV were positive in the No. 14, No. 23, No. 55 and No. 56 transgenic mice and negative in the other mice, and the antibodies of LCM, ECT and HANT were negative in all of the mice. (3) The results of ELISA showed that theA450 and index values of MHV in the No.14, No.23, No.55 and No.56 transgenic mice were higher than those of the control serum, while otherA450 and index values were lower than those of the control serum, indicating that the antibodies of MHV were positive in the No.14, No.23, No.55 and No.56 transgenic mice and negative in the other mice, and the antibodies of LCM, ECT and HANT were negative in all of the mice. These ELISA results were consistent with the results of the xMAP assay.ConclusionsThe multiplex xMAP assay established in this study can be used in the detection of infectious disease antibodies in transgenic mice.

Transgenic mice; Infectious diseases; Flexible multi-analyte profiling, xMAP; Liquid chip

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0030-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.006

2017-01-04