水稻淡綠葉基因PGL11的鑒定與精細(xì)定位

涂政軍 鄒國(guó)興 黃李超 陳龍 代麗萍 高易宏 冷語(yǔ)佳 朱麗 張光恒胡江 任德勇 高振宇 董國(guó)軍 陳光 郭龍彪 錢前,* 曾大力,*

(1中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所, 南昌 330200;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

水稻淡綠葉基因PGL11的鑒定與精細(xì)定位

涂政軍1,#鄒國(guó)興2,#黃李超1陳龍1代麗萍1高易宏1冷語(yǔ)佳1朱麗1張光恒1胡江1任德勇1高振宇1董國(guó)軍1陳光1郭龍彪1錢前1,*曾大力1,*

(1中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006；2江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所, 南昌 330200;#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【目的】葉片是水稻進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，葉片顏色的變化與水稻的生長(zhǎng)發(fā)育直接相關(guān)。發(fā)掘水稻葉色突變體，是水稻功能基因組學(xué)研究的重要遺傳基礎(chǔ)。【方法】利用EMS誘變?nèi)毡厩绔@得一個(gè)能穩(wěn)定遺傳的淡綠葉突變體，暫命名為pgl11(pale green leaf 11)。在不同生育期測(cè)定野生型與突變體的葉綠素含量。在苗期，取野生型與突變體葉片進(jìn)行葉綠體結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察。在分蘗期，測(cè)定野生型與突變體的光合參數(shù)并觀察氣孔結(jié)構(gòu)。在成熟期，測(cè)定野生型和pgl11的主要農(nóng)藝性狀。以pgl11為母本，南京6號(hào)為父本構(gòu)建相應(yīng)的F2群體，采用圖位克隆的方法，對(duì)該基因進(jìn)行定位?！窘Y(jié)果】從苗期開(kāi)始，突變體pgl11的每一片新葉均表現(xiàn)為淡綠色，葉綠素含量顯著降低，葉綠體發(fā)育異常。隨著葉片的生長(zhǎng)，葉色由淡綠逐漸轉(zhuǎn)綠，至抽穗期時(shí)葉綠素含量亦無(wú)明顯差異。pgl11還表現(xiàn)光合速率、氣孔導(dǎo)度明顯下降，胞間CO2濃度上升。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體pgl11的氣孔發(fā)育異常。與野生型相比，突變體的農(nóng)藝性狀如株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重以及結(jié)實(shí)率等均顯著降低。對(duì)葉綠素合成、光合作用以及質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量測(cè)定表明，突變體pgl11中參與葉綠體轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)基因的表達(dá)量顯著升高，而葉綠素合成和光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下降。遺傳分析表明，該突變表型受一對(duì)隱性核基因控制。通過(guò)圖位克隆的方法將該基因定位于第1染色體上的C6和C8標(biāo)記之間，物理距離約為110 kb?！窘Y(jié)論】該定位區(qū)間內(nèi)未見(jiàn)有葉色相關(guān)基因報(bào)道，推測(cè)PGL11基因可能是一個(gè)新的水稻葉色基因。

水稻；淡綠葉；葉綠體；遺傳分析；基因定位

葉綠素是光合器官的重要組成部分，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1]。除了為植物提供綠色的外觀之外，葉綠素在光合作用中負(fù)責(zé)接收捕獲光能，同時(shí)驅(qū)動(dòng)電子通過(guò)電子傳遞鏈轉(zhuǎn)移到光合反應(yīng)中心[2]，完成光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過(guò)程[3]。水稻葉綠素含量的增加可以提高光合作用率[4]，增加光合有機(jī)物的積累，并最終提高水稻的產(chǎn)量[5-6]。葉色相關(guān)基因的突變，會(huì)引起葉綠素的含量及葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終形成白化、黃化、條紋、淺綠和斑點(diǎn)等類型的突變[7]。目前，在水稻[8-9]、擬南芥[10]、玉米[11]、棉花[12]，小麥[13]、油菜[14]等多種植物葉均發(fā)現(xiàn)有葉色突變體的存在。

迄今為止，已有不少于80個(gè)水稻葉色突變體得到鑒定，且多個(gè)已被克隆。其中包括NTRC[15]、OsClpP5[16]、SGR[17]、OsDVR[18]、OsChlH/I/D[19-20]、YGL1[21]、OsCAO1[22]、OsCAO2[23]、YSA[24]、OsRpoTp[25]、OsCHR4[26]、OsPPR1[27]以及OsPDS[28]等。這些基因克隆和功能分析豐富了水稻葉色相關(guān)遺傳調(diào)控機(jī)理的闡述，水稻葉色突變體的表型一般是受核基因或細(xì)胞質(zhì)基因控制，其中，以隱性核基因控制的情況居多[29-31]。根據(jù)水稻葉色突變體的形成機(jī)制可分為葉綠素代謝途徑受阻[22,23]、葉綠體發(fā)育進(jìn)程受阻[9,25]、光敏色素調(diào)控受阻[32]、血紅素反饋調(diào)節(jié)紊亂等[33]，而以葉綠素合成途徑的研究報(bào)道最為深入。通過(guò)對(duì)雙子葉植物(如擬南芥)的研究發(fā)現(xiàn)，高等植物葉綠素生物合成通常需要通過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)[34]，參與葉綠素合成的27個(gè)基因及其編碼的酶都已被鑒定[35]。水稻中目前也已克隆9個(gè)編碼葉綠素合成途徑相關(guān)酶的基因，分別為編碼鎂離子螯合酶三個(gè)D、I、H小亞基的OsChlD、OsChlI和OsChlH基因[19,20]、編碼聯(lián)乙烯還原酶的OsDVR基因[18]、編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶A和B的OsPORA和OsPORB基因[36,37]、編碼葉綠素合酶的YGL1基因[21]以及編碼葉綠素酸酯a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2基因[22,23]。這些基因的突變都會(huì)對(duì)水稻葉色及生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

目前，對(duì)葉色突變體形成的分子機(jī)制的研究仍然不是十分清楚，主要是因?yàn)槠湫纬蛇^(guò)程十分復(fù)雜，牽涉到多方面的生理生化反應(yīng)。與葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的突變不僅直接影響葉綠體的發(fā)育，同時(shí)也會(huì)間接影響葉綠素的合成。水稻葉色基因V2的突變導(dǎo)致葉綠體的分化受到抑制，尤其在葉片發(fā)育早期破壞了葉綠體的轉(zhuǎn)錄/翻譯機(jī)制，最終造成葉綠體發(fā)育遲滯，葉綠素含量降低，表現(xiàn)出白化表型[38]。V3和St1分別編碼核糖核酸還原酶RNR的大、小亞基，其突變體植株的核糖核苷酸還原酶活性顯著下降，導(dǎo)致與質(zhì)體發(fā)育及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生了改變，進(jìn)而影響葉綠體的發(fā)育[39]。三角狀五肽重復(fù)區(qū)蛋白(PPR)在水稻葉綠體發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，OsPPR1是第一個(gè)報(bào)道的參與水稻葉綠體形成的PPR蛋白。抑制該基因的表達(dá)，植株表現(xiàn)出缺綠的突變表型，甚至還會(huì)出現(xiàn)白化致死現(xiàn)象[27]。

本研究從粳稻日本晴EMS突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)能夠穩(wěn)定遺傳的淡綠葉突變體，暫命名為pgl11。從表型、生理、遺傳和基因表達(dá)等方面分析了pgl11的特征，圖位克隆將pgl11定位在第1染色體上110 kb的物理距離。這些結(jié)果將為最終分離PGL11基因，闡明其遺傳調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 突變體來(lái)源及種植

EMS誘變粳稻品種日本晴，經(jīng)多代自交性狀穩(wěn)定，獲得淡綠葉突變體pgl11。pgl11與培矮64S和南京6號(hào)雜交獲得的F1及F2群體用于基因的遺傳分析與精細(xì)定位。所有材料(包括野生型日本晴)均種植于中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)和海南試驗(yàn)基地。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在水稻抽穗期測(cè)定野生型和突變體pgl11的劍葉長(zhǎng)、劍葉寬，在完熟期測(cè)定野生型和突變體pgl11的株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重與結(jié)實(shí)率等主要農(nóng)藝性狀，每個(gè)性狀10次重復(fù)，并采用t檢驗(yàn)法分析突變體與野生型之間的差異顯著性。

1.3 葉綠素含量的測(cè)定取相同生長(zhǎng)時(shí)期野生型和突變體的葉片0.05 g，浸入5 mL的丙酮提取液(v95%丙酮∶v無(wú)水乙醇=2∶1)中，在26℃黑暗條件下充分浸提24 h[40]。利用 DU800UV/Vis分光光度計(jì)分別測(cè)定三個(gè)不同波長(zhǎng)(470 nm、645 nm和663 nm)下浸提液的吸光度值，根據(jù)公式[41]計(jì)算出對(duì)應(yīng)的葉綠素a、葉綠素 b及類胡蘿卜素含量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4 光合參數(shù)的測(cè)定

水稻分蘗盛期，在晴好天氣的上午9點(diǎn)到11點(diǎn)時(shí)間段內(nèi)，用便攜式光合測(cè)定儀Li-6400到田間對(duì)野生型及突變體的劍葉進(jìn)行光合測(cè)定。選取位于種植小區(qū)中間部分且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的野生型和突變體pgl11植株，分別測(cè)定其凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率等參數(shù)，測(cè)定部位為劍葉中上部，共測(cè)定5個(gè)重復(fù)。結(jié)果取平均值。

1.5 葉片的掃描電鏡觀察

為了觀察葉綠體的結(jié)構(gòu)，分別取野生型和突變體幼苗的新出葉，剪成小片，于2.5%的戊二醛溶液中抽真空。固定后分別用 50%、70%、80%、95%和100%的乙醇和丙酮進(jìn)行逐級(jí)脫水，最后用環(huán)氧化樹(shù)脂包埋，樣品經(jīng)過(guò)切片、醋酸鈾染色后，在透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察[42]。

1.6 突變體pgl11的遺傳分析與基因定位

當(dāng)年夏季，將突變體pgl11與培矮64和南京6號(hào)雜交，同年冬季，將雜交種F1種植于海南陵水基地，并觀察兩個(gè)組合的F1表型，自交獲得F2種子。次年夏季將這兩個(gè)F2群體種植于浙江杭州富陽(yáng)實(shí)驗(yàn)基地，并分別調(diào)查野生型表型和突變體表型植株的數(shù)目，考查性狀的分離比并通過(guò)卡方檢驗(yàn)驗(yàn)證，完成遺傳分析。

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的均勻分布于12條染色體的232對(duì)引物對(duì)雙親和F1進(jìn)行多態(tài)性篩選，從中獲得136對(duì)多態(tài)性的標(biāo)記用于pgl11的連鎖分析和初定位。并利用秈稻9311序列(http://www.rise. genomics.org.cn)和粳稻日本晴(NPB)序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)，在目標(biāo)區(qū)間開(kāi)發(fā)多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)一步擴(kuò)大pgl11與南京6號(hào)的F2群體，進(jìn)行精細(xì)定位。

1.7 RNA的提取及定量RT-PCR

利用Qiagen公司的總RNA提取試劑盒(RNeasy plant mini kit)對(duì)野生型和突變體pgl11的總RNA進(jìn)行提取，并以RNase-free DNaseⅠ處理過(guò)的總RNA為模板，采用ToYoBo公司的cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用Applied Biosystems公司的ABI7900對(duì)野生型和突變體中相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。以基因Ubiqutin作為內(nèi)參基因。10 μL RT-PCR體系包括cDNA模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix(ToYoBo) 5 μL，正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。RT-PCR擴(kuò)增程序如下：95℃下預(yù)變性1.5 min；95℃下10 s，60℃下30 s，72℃下20 s，共40個(gè)循環(huán)。以2－ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量[43]。RT-PCR中相關(guān)基因檢測(cè)所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1. Primers used in real-time PCR.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體pgl11表型及農(nóng)藝性狀分析

在自然生長(zhǎng)條件下，突變體pgl11從出芽開(kāi)始葉片即表現(xiàn)淡綠(圖1-A)，隨著葉片的發(fā)育，新葉從葉尖到葉基部逐漸變綠(圖1-B)，到抽穗期葉片顏色完全恢復(fù)綠色(圖1-C)。調(diào)查結(jié)果顯示，突變體的抽穗期較野生型推遲一周，其農(nóng)藝性狀除分蘗數(shù)、劍葉長(zhǎng)、穗長(zhǎng)及一次枝梗數(shù)未發(fā)生明顯變化外，株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒寬、千粒重以及結(jié)實(shí)率等性狀均存在極顯著差異(表2)。

2.2 突變體pgl11葉綠素含量的變化

由于突變體pgl11葉片顏色在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)轉(zhuǎn)綠現(xiàn)象，因此，我們對(duì)野生型和突變體pgl11苗期、分蘗期和抽穗期葉片的葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，在苗期突變體葉綠素含量顯著下降；到分蘗期，二者差異減小；抽穗期時(shí)，野生型與突變體的葉綠素含量則無(wú)明顯差異。其中，突變體pgl11苗期的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量分別較野生型下降了77.25%、80.06%和51.88%(圖2-A)。在分蘗期，突變體pgl11的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量則分別降低了22.2%、28.7%和12.5%(圖2-B)。而到了抽穗期，野生型與突變體pgl11的光合色素含量差異不顯著(圖2-C)。

2.3 突變體pgl11的光合參數(shù)分析

圖1 野生型和突變體pgl11在不同生育期的表型Fig. 1. Phenotypes of the wild type(WT) and the pgl11 mutant at various growth stage.

表2 野生型WT和突變體pgl11的基本農(nóng)藝性狀(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)Table 2．Agronomic traits of the wild type(WT) and pgl11 mutant(Mean±SD, n=3).

為了分析突變體pgl11光合作用是否受到影響，我們對(duì)分蘗期野生型和突變體pgl11劍葉的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速度等4個(gè)光合指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，突變體除了胞間CO2濃度有所增加外，其余3個(gè)參數(shù)均出現(xiàn)顯著下降。其中，突變體pgl11劍葉凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度分別下降了約32.3%、34.3%和21.9%，差異均達(dá)極顯著水平，而胞間CO2濃度上升了16.84%(表3)。掃描電鏡觀察野生型和突變體pgl11葉片氣孔結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突變體pgl11的氣孔收縮并呈帶狀下陷，且下陷的氣孔口周圍沒(méi)有硅質(zhì)化乳突，部分氣孔發(fā)育不完全(圖3)。說(shuō)明PGL11突變后導(dǎo)氣孔發(fā)育異常，光合作用受到明顯影響，主要體現(xiàn)在胞間CO2濃度顯著提高，而凈光合速率和氣孔導(dǎo)度顯著降低。

表3 分蘗盛期野生型和突變體pgl11的劍葉光合參數(shù)(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差, n=5)Table 3．Photosynthetic parameters of flag leaf of wild type(WT) and pgl111 mutant at the tillering stage(Mean±SD, n=5).

圖2 野生型與突變體pgl11的葉綠素含量比較Fig. 2. Comparison of chlorophyll contents between WT and pgl11.

圖3 分蘗盛期野生型和突變體pgl11葉片氣孔結(jié)構(gòu)Fig. 3. Leaf stomatal structure of wild type(WT) and pgl11 at the tillering stage.

2.4 葉綠體結(jié)構(gòu)的顯微觀察

為了進(jìn)一步確定突變體pgl11葉綠體發(fā)育是否異常，我們分別對(duì)野生型與突變體pgl11的4葉期葉片進(jìn)行透射電鏡觀察。結(jié)果表明，野生型葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目較多且體積較大，基質(zhì)較濃厚，基粒片層垛疊正常，具有正常的片層結(jié)構(gòu)(圖4-A,B)，而突變體pgl11中葉肉細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目明顯減少且體積減小，沒(méi)有正常的基粒垛疊及成形的淀粉粒堆積，甚至有的細(xì)胞中沒(méi)有葉綠體結(jié)構(gòu)(圖4-C,D)。該結(jié)果表明PGL11基因突變影響了水稻葉肉細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育。

2.5 PGL11的遺傳分析和基因定位

為了進(jìn)一步明確突變體pgl11的遺傳特性，將突變體pgl11分別與秈稻品種培矮64和南京6號(hào)進(jìn)行雜交。結(jié)果表明，突變體pgl11與培矮64的F1為正常表型，F(xiàn)2分離出的正常表型和淡綠葉表型植株分別為413株和141株，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3∶1(χ2=0.0602＜；與南京6號(hào)雜交后，F(xiàn)1為正常表型，F(xiàn)2分離出正常表型和淡綠葉表型植株分別為504株和167株，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3∶1(χ2=0.0045＜(表4)，表明突變體pgl11的淡綠葉表型受一對(duì)隱性核基因控制。

圖4 野生型和突變體pgl11葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu). Fig. 4. Chloroplast ultrastructure of wild type and pgl11.

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的均勻分布在水稻12條染色體上的232對(duì)SSR和STS標(biāo)記對(duì)雙親和F1進(jìn)行多態(tài)性分析，從中獲得136對(duì)多態(tài)性的標(biāo)記用于pgl11的初定位。根據(jù)連鎖分析，將目標(biāo)基因初步定位在第1染色體短臂上的M1和M2兩個(gè)標(biāo)記之間。為了對(duì)PGL11進(jìn)行精細(xì)定位，我們擴(kuò)大pgl11與南京6號(hào)的F2群體，并挑選出1 328株有突變表型的單株。根據(jù)水稻粳稻品種日本晴及秈稻品種93-11的序列差異，在M1與M2之間開(kāi)發(fā)了多個(gè)在雙親具有多態(tài)性的標(biāo)記(表5)。根據(jù)染色體步移的方法，最終將PGL11定位于標(biāo)記C6和C8之間，物理距離約為110 kb的范圍內(nèi)，此區(qū)間包含2個(gè)BACs(AP000836和AP000837)(圖5)。該范圍內(nèi)共有10個(gè)開(kāi)放閱讀框，包括8個(gè)編碼假定蛋白、1個(gè)編碼表達(dá)蛋白的基因及1個(gè)已被克隆的基因。已被克隆的基因?yàn)橐粋€(gè)編碼MYB結(jié)構(gòu)域蛋白的CSA基因。

2.6 葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)

由于突變體葉片表現(xiàn)出明顯的淡綠葉表型, 且色素含量及光合速率均下降，葉綠體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出異常。因此，葉綠素合成、光合作用及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)可能會(huì)受到一定程度的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)突變體pgl11及野生型中與葉綠素合成相關(guān)基因HEMA1(谷氨酰-tRNA還原酶)、CHLH(鎂離子螯合酶)、PORA(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶a)、PORB(NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶b)、CAO1(葉綠素酸酯氧化酶)、光合作用相關(guān)基因LhcP2(捕光復(fù)合蛋白)、LhcB1/B4(葉綠素a/b結(jié)合光捕獲蛋白)、葉綠體發(fā)育過(guò)程相關(guān)基因PsaA(光系統(tǒng)Ⅰ葉綠素脫輔基蛋白)、PsbA(光系統(tǒng)Ⅱ醌結(jié)合蛋白)、Rps15(核糖體小亞基蛋白15)、OsSig2A(質(zhì)體RNA聚合酶)的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定(圖6)。結(jié)果表明，與野生型相比，突變體的葉綠素代謝相關(guān)基因CHLH和HEMA的表達(dá)量明顯上升，而PORA、PORB及CAO1的表達(dá)水平顯著下降。光合作用相關(guān)基因LhcB1、LhcP2的表達(dá)量無(wú)明顯變化，而LhcB4的表達(dá)量則顯著降低。葉綠體發(fā)育相關(guān)基因PsaA、PsbA的表達(dá)量顯著降低。與葉綠體轉(zhuǎn)錄/翻譯相關(guān)基因Rps15和OsSig2A的表達(dá)量則顯著上升。這些結(jié)果表明，PGL11的突變導(dǎo)致與葉綠素合成、光合作用以及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變。

表4 突變體基因PGL11的遺傳分析Table 4．Genetic analysis of PGL11.

表5 本研究中精細(xì)定位所用引物Table 5．Primers used for fine mapping in the study.

圖5 PGL11基因的分子定位Fig. 5. Molecular mapping of PGL11.

圖6 野生型(WT)與突變體pgl11中葉綠素合成、光合作用及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 6. Expression analysis of genes associated with chlorophyll biosynthesis, photosynthesis and chloroplast development in the wild type(WT) and pgl11 mutant.

3 討論

水稻是一種重要的單子葉模式植物，隨著水稻全基因組測(cè)序的完成，通過(guò)水稻葉色突變體來(lái)研究水稻的功能基因組學(xué)越來(lái)越受到大家的關(guān)注。葉色突變體是水稻突變體中十分常見(jiàn)且容易通過(guò)觀察辨別的突變類型，是研究水稻葉綠體功能、葉綠素代謝及高光效育種的重要的遺傳材料。在已經(jīng)報(bào)道的水稻葉色突變體中，存在著許多轉(zhuǎn)綠類型的突變體。如突變體v4在3葉期表現(xiàn)出白化表型，葉綠體發(fā)育異常，4葉期后，葉片則逐漸變綠[44]。白化突變體ysa在3葉期前生長(zhǎng)白化葉，之后葉片逐漸變綠，直到6葉期葉片完全恢復(fù)成正常綠色[24]。YGL1基因編碼葉綠素合成酶，水稻黃綠葉突變體ygl1生長(zhǎng)發(fā)育前期葉片為黃色，中期葉色開(kāi)始轉(zhuǎn)綠，后期葉色則接近野生型[21]。與以上突變體表型相似，本研究的pgl11突變體也是一個(gè)典型的水稻轉(zhuǎn)綠類型的突變體。生長(zhǎng)前期，葉片淡綠甚至黃化，中期葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，后期葉片恢復(fù)為正常綠色。

基因PGL11定位于水稻第1染色體上，而在前人的研究中，水稻第1染色體上已克隆的葉色基因只有4個(gè)，分別是NYC1[45]、WLP1[46]、YGL8[47]和OsHAP3A[48]。NYC1編碼葉綠素b還原酶基因。NYC1的突變?cè)斐扇~綠素降解途徑受抑制，突變體nyc1的葉片在衰老時(shí)仍然保持綠色。WLP1編碼一個(gè)葉綠體核糖體L13蛋白，是葉綠體核糖體的主要組成成分。低溫條件下，wlp1突變體葉綠素合成受阻，在4葉期前葉片白化，4葉期以后轉(zhuǎn)為綠色，且wlp1的株高較野生型更高。YGL8基因編碼鎂原卟啉Ⅸ單酯環(huán)化酶(MgPME)的一個(gè)催化亞基。ygl8突變體在幼苗期、分蘗期和抽穗期均表現(xiàn)出明顯的黃綠葉表型，葉片中葉綠素含量降低，生長(zhǎng)后期葉片逐漸轉(zhuǎn)綠，抽穗期遲滯，分蘗數(shù)、千粒重與結(jié)實(shí)率等產(chǎn)量性狀顯著降低。OsHAP3A編碼一個(gè)CAAAT-box結(jié)合復(fù)合體HAP3亞基。反義表達(dá)OsHAP3A的植株葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量降低，葉綠體降解，葉片出現(xiàn)淺綠色表型。其中只有ygl8突變體在整個(gè)生育期的表型與pgl11較為相似，但二者在染色體上的位置完全不同。進(jìn)一步將基因PGL11定位在標(biāo)記C6與C8之間，遺傳距離約為110 kb。該范圍內(nèi)共含有10個(gè)開(kāi)放閱讀框。其中已被克隆的基因?yàn)橐粋€(gè)編碼MYB結(jié)構(gòu)域蛋白的CSA基因[49]。CSA是一個(gè)在水稻雄性生殖發(fā)育過(guò)程中調(diào)控糖分配的重要的轉(zhuǎn)錄因子，該基因突變最終導(dǎo)致植株雄性不育。另外，LOC_Os01g16730編碼一個(gè)C端催化域包含蛋白質(zhì)，該蛋白屬于類泛素(ulp1)蛋白酶家族，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解；LOC_Os01g16750預(yù)測(cè)為編碼一個(gè)黃素單氧酶，參與水稻IAA的生物合成；LOC_Os01g16770預(yù)測(cè)編碼一個(gè)擴(kuò)增前體蛋白，參與細(xì)胞的擴(kuò)增；LOC_Os01g16840預(yù)測(cè)編碼一個(gè)微線蛋白sm70；LOC_Os01g16800編碼一個(gè)表達(dá)蛋白；另外4個(gè)為編碼轉(zhuǎn)座蛋白的基因。在前人的研究中，在該區(qū)間內(nèi)尚未報(bào)道過(guò)與控制pgl11突變表型相似的基因，這進(jìn)一步說(shuō)明了PGL11可能是一個(gè)控制水稻葉色的新基因。

本研究的突變體材料pgl11的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，結(jié)合其葉色的變化，推測(cè)可能是由于其葉綠體發(fā)育過(guò)程與野生型不同，突變體的葉綠體可能經(jīng)歷了前質(zhì)體到白色體再到葉綠體這樣一個(gè)較長(zhǎng)的發(fā)育過(guò)程[50]，所以突變體在生長(zhǎng)前期，葉綠體發(fā)育緩慢、滯后。到生長(zhǎng)后期，葉綠體逐漸發(fā)育完全，葉色開(kāi)始轉(zhuǎn)綠。同時(shí)我們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平分析突變基因?qū)χ仓甑挠绊?。RT-PCR結(jié)果表明，葉綠素合成途徑的前期參與基因HEMA、CHLH的表達(dá)量上升，而合成后期的基因PORA、PORB、CAO1的表達(dá)量則顯著下降，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是基因突變引起了這個(gè)過(guò)程的某一個(gè)酶的活性改變，從而影響了葉綠素合成的進(jìn)程，這與葉綠素含量的測(cè)定值相吻合。質(zhì)體內(nèi)存在兩種類型的RNA酶：質(zhì)體編碼的RNA聚合酶(PEP)與核編碼的RNA聚合酶(NEP)。核基因OsSig2A編碼質(zhì)體RNA聚合酶的一個(gè)調(diào)控亞基，參與質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。質(zhì)體基因Rps15編碼葉綠體核糖體S15小亞基，負(fù)責(zé)質(zhì)體翻譯過(guò)程中的識(shí)別功能。結(jié)果表明，基因OsSig2A與rps15的表達(dá)水平顯著上升，特別是基因rps15，其表達(dá)水平增加了約5.4倍，表明基因PGL11的突變影響質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。葉綠體編碼的基因PsaA、PsbA、LhcB1/B4及LhcP2與葉綠體的光合器官形成有關(guān)。這些基因的表達(dá)能夠激活葉綠體內(nèi)光合器官的光合作用能力，促進(jìn)葉綠體的發(fā)育成熟。除LhcB1表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化外，其他4個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著降低，這也很好地解釋了突變體葉綠體發(fā)育的異常及光合速率的下降。

突變體pgl11不僅有葉色的變化，也有株高、劍葉寬、二次枝梗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒寬、千粒重以及結(jié)實(shí)率等性狀的變化，說(shuō)明基因PGL11的突變是一因多效的。pgl11植株的抽穗期較野生型晚約一周，可能是由于基因突變使水稻的葉色變淺，葉綠體發(fā)育異常，光合速率下降，導(dǎo)致源器官的能量供給不足，從而引起抽穗期的延后。氣孔是植物體與外部環(huán)境進(jìn)行水和氣體交換的重要通道，能夠維持植物體的溫度、代謝穩(wěn)定及光合作用的正常進(jìn)行。突變體pgl11葉片的氣孔形態(tài)與結(jié)構(gòu)異常，局部的氣孔出現(xiàn)成片的下陷，這些氣孔周圍沒(méi)有任何的乳突結(jié)構(gòu)。氣孔的發(fā)育直接影響葉片中的碳同化進(jìn)程，這可能是其光合作用下降的重要原因。本研究的突變體材料可為研究水稻葉片葉綠素合成、葉綠體發(fā)育及提高水稻光合效率與產(chǎn)量提供重要的種質(zhì)資源，同時(shí)為該基因的最終克隆提供參考。

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Identification and Fine Mapping of Pale Green Leaf PGL11 in Rice

TU Zhengjun1,#, ZOU Guoxing2,#, HUANG Lichao1, CHEN Long1, DAI Liping1, GAO Yihong1, LENG Yujia1, ZHU Li1, ZHANG Guangheng1, HU Jiang1, REN Deyong1, GAO Zhenyu1, DONG Guojun1, CHEN Guang1, GUO Longbiao1, QIAN Qian1,*, ZENG Dali1,*

(1State Key Laboratory for Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【Objective】 Leaf is the main site of photosynthesis in rice. The change of leaf color is directly related to the growth and development of rice. The research of leaf color mutants is an important genetic basis for the study of rice functional genomics. 【Method】We identified a pale green leaf mutant termed pgl11(pale green leaf 11) from japonica cultivar Nipponbare by ethyl methylsulfonate (EMS) treatment. The chlorophyll content of wild type(WT) and mutant was measured at different growth stages. At the seedling stage, the chloroplast structure of the leaves of the WT and the mutant were observed with a transmission electron microscopy. At the tillering stage, the photosynthetic parameters of WT and pgl11 were measured and the stomatal structure was observed. At the mature stage, the main agronomic traits of WT and pgl11 were determined. F2population derived from pgl11/Nanjing 6 was used to map this gene by position cloning approach.【Result】At seedling stage, every new leaf of the mutant pgl11 was pale green. As the leaves matured, the leaf color gradually turned green. Compared with wild type, the chlorophyll content in pgl11 decreased at seedling stage. However, there was no significant difference at heading stage. In addition, the photosynthetic rate and stomatal conductance of pgl11 were significantly decreased, but the intercellular CO2concentration was apparently increased. The

stomata was abnormal in pgl11. The agronomic traits including plant height, flag leaf width, secondary rachis branch number, grain number per panicle, grain length, grain width, 1000-grain weight and seed setting rate decreased significantly in pgl11 compared with wild type. The expression of genes associated with chloroplast transcription and translation were upregulated in pgl11, while the expression of chlorophyll synthesis and photosynthesis related genes were downregulated. Genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene, and PGL11 was mapped to a 110kb region between the markers C6 and C8 on the short arm of chromosome 1. 【Conclusion】It was suggested that PGL11 gene would be a putative novel pale green leaf gene.

rice; pale green leaf; chloroplast; genetic analysis; gene mapping.

Q755; S511.03

A

1001-7216(2017)05-0489-11

2017-04-11; 修改稿收到日期：2017-05-12。

中央級(jí)公益性科研院所專項(xiàng)；中國(guó)農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31661143006，91435105)。