雷公藤多苷肝毒性血清藥物化學(xué)的初步研究△

王曉東，葉桃，金城，肖小河，趙奎君，蒲仕彪，馬致潔*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

·中藥基礎(chǔ)·

雷公藤多苷肝毒性血清藥物化學(xué)的初步研究△

王曉東1，葉桃2，金城2，肖小河2，趙奎君1，蒲仕彪3*，馬致潔1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

目的：通過對雷公藤多苷引起肝毒性入血成分的分析研究，探討雷公藤潛在的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：觀察雷公藤多苷臨床20倍等效劑量給藥大鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)、血清AST和ALT來評價雷公藤多苷造成肝損傷的客觀真實性；采用血清藥物化學(xué)研究方法，在MSE質(zhì)譜正負模式下，建立雷公藤多苷UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜和其大鼠血清指紋圖譜，比較確定雷公藤多苷的入血原型成分。結(jié)果：正常組與給藥組大鼠肝組織病理切片指標(biāo)、血清AST和ALT差異有統(tǒng)計學(xué)意義，血清指紋圖譜的研究共鑒定Othosphenic Acid、Triptotriterpenic Acid、Demethylregelin、Wilforlide、Cangoronine 5個原型成分。結(jié)論：初步確定了雷公藤多苷引起肝毒性的入血成分，為其肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明奠定了基礎(chǔ)。

雷公藤多苷；肝毒性；血清藥物化學(xué)；指紋圖譜

雷公藤是我國一味傳統(tǒng)中藥，性溫，味苦澀，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒等功效，在臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎病綜合征等自身免疫性疑難病證有良好的效果，然而其毒副作用也越來越受到人們關(guān)注，特別是肝毒性作用報道頗多[1-3]。雷公藤提取物雷公藤多苷廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代中藥制劑，在臨床上治療各類難治自身免疫性疾病，然而，其不良反應(yīng)涉及包括肝臟在內(nèi)的多種器官和系統(tǒng)損害，且毒性成分不清，嚴重影響了臨床用藥的安全性。

中藥血清藥物化學(xué)是以經(jīng)典的藥物化學(xué)研究手段和方法為基礎(chǔ)，運用現(xiàn)代分離技術(shù)及多維聯(lián)用技術(shù)，分析鑒定口服中藥后人或動物血清中移行成分，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并研究其體內(nèi)過程的應(yīng)用學(xué)科[4]。近年來，血清藥物化學(xué)研究方法引起了眾多研究者的重視，在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面也發(fā)揮了很大作用[5-9]。本文在表征雷公藤多苷產(chǎn)生肝毒性的客觀真實性的基礎(chǔ)上，采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)技術(shù)，通過研究口服雷公藤多苷的大鼠血清中移行成分來探索分析雷公藤肝毒性的可能成分，為雷公藤肝損傷的合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

自動生化儀(mindray BS-300)；冷凍離心機(Sigma，德國)；超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF，Acquity-Q-TOF Premier，美國Waters 公司)；微量分析天平(Mettler Toledo AL204 瑞士)；渦旋混勻器(HYQ 2121A)；Masslynx 4.1工作站Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國Millipore 公司)；Ostra TM 96-well plate固相萃取柱(25 mg 1/pkg，Waters)。

1.2 試劑與藥品

雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號：0507101)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號：140111011)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(批號：140211019)，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；甲醇(色譜級，德國Merck公司)；乙腈(色譜級，德國Merck公司)；甲酸(色譜級，德國Merck公司)；去離子水經(jīng)(18.2 MΩ)Millipore Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Co.，美國)超純水器凈化；亮氨酸-腦啡肽(Leucine-enkephalin，LE)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 公司，USA)；其他試劑為市售分析純。

1.3 動物

SD大鼠，28只，SPF級，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量(150±20)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK-(軍)2007-004]，實驗動物分籠飼養(yǎng)于解放軍302醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(軍)2002-00500]，自由進食及飲水。實驗室溫度(21±2)℃，濕度65%～85%，具有控溫定時排氣通風(fēng)設(shè)備。人工光照約12 h∶12 h的明暗周期。

2 方法

2.1 大鼠給藥方法

空白組12只，給藥組16只。將雷公藤多苷片研磨成粉末加0.9%氯化鈉溶液充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為15 mg·mL-1(在前期試驗基礎(chǔ)上篩選出該質(zhì)量濃度為雷公藤多苷的致毒質(zhì)量濃度，人臨床20倍等效劑量)的混懸液。按1 mL·(100g)-1·d-1，每天上午9：00—10：00灌胃，空白組每天灌以等量0.9%氯化鈉溶液，給藥周期為4周。每周稱重1次，按實際體質(zhì)量調(diào)整劑量。

2.2 大鼠生活生長行為狀況觀察

觀察記錄大鼠采食量、喝水量、皮毛色澤、精神、死亡等情況。

2.3 血清肝酶實驗方法

每周在灌胃30 min后靜脈眼眶取血，靜置一段時間后4 ℃冷凍離心分離血清，全自動生化儀檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。

2.4 肝組織HE染色病理組織形態(tài)學(xué)檢查

大鼠最后一次取血后處死，立即取肝組織，0.9%氯化鈉溶液清洗。取肝右葉外側(cè)下部大約1.5 cm×1.5 cm的肝臟組織(厚度不超過0.5 cm)，放入預(yù)先配好4%的中性甲醛溶液固定24 h，從肝臟邊緣向內(nèi)切7～12塊薄片，10%的中性甲醛溶液繼續(xù)固定72 h，使組織保持本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)。再經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟HE染色、脫水透明和封固過程，Oymptls光學(xué)顯微鏡觀察，拍照。

2.5 色譜條件

色譜柱：Waters UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)；流動相梯度洗脫順序：0～1 min，5%～20%B；1～2 min，20%～30%B；2～4 min，30%～35%B；4～5 min，35%～40%B；5～20 min，40%～100%B。流速：0.3 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；樣品溫度：4 ℃。

2.6 質(zhì)譜條件

離子源：ESI±；離子源電壓：Capillary 3.2 kV；Sampling Cone 50 V；Extraction Cone 3 V；離子源溫度：Source 100 ℃，Desolvation 350 ℃；去溶劑氣：Desolvation，700 L·h-1；掃描范圍：m/z50～1000；亮氨酸-腦啡肽(200 μg·L-1Lock mass)在線校正。

2.7 雷公藤制劑供試品溶液的制備

取雷公藤多苷片10片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，取細粉約0.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加無水乙醇約20 mL，密塞，超聲處理(120 W，40 kHz)60 min，冷至室溫，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過。

2.8 血清藥物化學(xué)樣品的處理

大鼠血清保存在-80 ℃冰箱中，取出復(fù)融后，取大鼠血清200 μL加入到OstraTM96-well plate固相萃取柱(25 mg 1/pkg，Waters)中，加入1.5 mL 5%甲醇淋洗后，加入600 μL 1%甲酸乙腈，混勻，靜置，在負壓的條件下，抽取液體，4 ℃冷凍離心(18 000 r·min-1，10 min)，取上清液。

2.9 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 雷公藤的肝毒性

3.1.1 大鼠的生活生長行為 空白組大鼠采食量、喝水量正常，皮毛顏色和光澤正常，生活行為正常。給藥3周后，給藥組大鼠出現(xiàn)活動明顯的減少，食量下降，雌性大鼠甚至不采食，精神不濟、呆滯，皮毛雜亂沒有光澤，并伴有呼吸不順的現(xiàn)象，雌性鼠比雄性鼠情況嚴重。

3.1.2 大鼠體質(zhì)量 從圖1可知，雷公藤多苷灌胃3周后，與空白組的大鼠相比，給藥組大鼠體質(zhì)量增長出現(xiàn)抑制(P<0.05)；灌胃4周后，與空白組的大鼠相比，給藥組體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)。提示雷公藤多苷灌胃后，給藥3、4周后給藥組大鼠體質(zhì)量降低。

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 雷公藤多苷對大鼠體質(zhì)量的影響

3.1.3 大鼠肝組織病理切片 從HE染色肝組織病理切片中可看出(見圖2)，空白組的大鼠肝組織切片結(jié)構(gòu)正常，肝細胞大小一致，中央靜脈周圍的肝細胞索排布，無脂肪變性細胞，細胞質(zhì)豐富，細胞核位于細胞中央；給藥組的大鼠肝細胞大小不一，明顯脂肪病變。

注：A.空白組(×100)；B.空白組(×400)；C.給藥組(×100)；D.給藥組(×400)。圖2 HE染色肝組織病理切片圖

3.1.4 大鼠血清ALT、AST 從圖3、圖4可看出，與空白組的大鼠相比，給藥3周后，給藥組ALT顯著升高(P<0.01)，AST也明顯升高(P<0.05)。給藥4周后，給藥組與空白組的大鼠相比，ALT和AST都非常顯著升高(P<0.001)。提示，血清中肝酶活性增加，說明肝組織出現(xiàn)損傷而將ALT、AST釋放入血。

3.2 雷公藤肝毒性入血原型成分分析

在MSE質(zhì)譜正負模式下，以化合物的質(zhì)譜特征為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，以保留時間為對比序列，對含藥血清和空白血清進行指紋圖譜鑒定，兩組血清再與雷公藤體外樣品的色譜峰進行比對，各級色譜行為相同的色譜峰即為雷公藤血中移行原型成分(見圖4和圖5)。

注：與空白組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖3 雷公藤多苷對大鼠血清ALT的影響

本實驗在大鼠血清中總共指認了5個雷公藤大鼠血中移行原型成分S1、S2、S3、S4和S5。原型成分S1～S5與雷公藤體外樣品的高低碰撞能下的色譜行為相同(見表1)。其中正離子模式下指認了S1、S2、S4、S5(見圖5)，負離子模式下指認了S1、S2、S3(見圖6)。從表1所知，血中移行成分可能是雷公藤木栓烷型、齊墩果烷型和烏蘇烷型三萜類化合物。提示雷公藤三萜類成分易被機體吸收，易被獲取檢測。

注：與空白組相比，*P<0.05，***P<0.001。圖4 雷公藤多苷對大鼠血清AST的影響

對總離子流圖中所獲得的峰進行掃描，獲得了S1、S2、S3、S4和S5指認化合物保留時間上的空白組血清、給藥組含藥血清和雷公藤多苷片的提取離子圖的質(zhì)譜圖，見圖7～14。

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖5 ESI+模式下各組血清總離子流圖(BPI圖)

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖6 ESI-模式下各組血清總離子流圖(BPI圖)

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖7 S1在ESI+模式下13.84 min的一級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖8 S1在ESI+模式下13.84 min的二級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖9 S2在ESI+模式下15.40 min的一級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖10 S2在ESI+模式下15.40 min的二級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖11 S3在ESI-模式下12.09 min的一級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖12 S3在ESI-模式下12.09 min的二級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖13 S4在ESI+模式下11.2 min的一級質(zhì)譜圖

注：A.空白血清；B.給藥組含藥血清；C.雷公藤多苷片。圖14 S5在ESI+模式下15.09 min的一級質(zhì)譜圖

表1 雷公藤多苷血中移行成分—原型成分

4 討論

雷公藤作為臨床常用藥，在治療免疫疾病方面具有不可被替代的獨特功效，然而雷公藤的主要活性成分也往往是其產(chǎn)生毒性的成分，雷公藤小鼠半數(shù)致死量均<2 mg·kg-1[10]。據(jù)臨床觀察[11]，雷公藤及其制劑的毒副作用發(fā)生率為58.1%。其中有關(guān)雷公藤及其制劑(包括有雷公藤多苷片等)不良反應(yīng)的報道大幅上升。雷公藤多苷是從雷公藤中提取的有效成分，其生理活性由二萜內(nèi)酯、生物堿、三萜等成分協(xié)同產(chǎn)生。本實驗在給予臨床20倍等效劑量3周和4周后，大鼠出現(xiàn)明顯體質(zhì)量下降、血清AST和ALT異常升高的現(xiàn)象，表明雷公藤多苷可致肝損害。提示雷公藤制劑可致藥源性肝損害，且與給藥時間呈正相關(guān)。

目前，針對雷公藤藥物單體成分的研究較多[12]，但鮮見雷公藤其他成分或代謝成分的毒性報道。實驗研究中，對于毒性成分的篩選大多數(shù)還停留在體外肝細胞、肝組織實驗的基礎(chǔ)上[13]，且毒性檢測結(jié)果無法完全反映藥物在體內(nèi)的行為，對雷公藤肝毒性的進一步研究缺乏指導(dǎo)意義。同時，關(guān)于雷公藤多苷的動物毒理實驗的報道雖多，但是與臨床結(jié)合不夠緊密，不足以為臨床提供有利參考[14-15]。

中藥成分較為復(fù)雜，體外毒性成分不等于體內(nèi)毒性成分，且很多體外毒性成分不能被機體吸收。藥物無論經(jīng)何種途徑進入體內(nèi)，其毒性成分必須以血液為媒介輸送分布到作用部位或作用靶點，從而發(fā)揮產(chǎn)生作用。這些入血成分最真實地反應(yīng)了中藥化學(xué)成分在體內(nèi)的變化，能充分體現(xiàn)其對機體產(chǎn)生的協(xié)調(diào)和拮抗作用，可代表中藥作用的整體物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，血液中的中藥成分才可能是真正的體內(nèi)直接作用物質(zhì)[16]。

本實驗完成了UPLC-Q-TOF/MS含雷公藤多苷大鼠血清指紋圖譜的研究，共鑒定了血清中5個原型成分，即S1～S5，可能為雷公藤木栓烷型、齊墩果烷型和烏蘇烷型三萜類化合物。且雷公藤三萜類成分易被機體吸收，易被獲取檢測。對雷公藤多苷進行血清藥物化學(xué)研究，可初步確定血清中移行成分的來源，這些化合物可能包含雷公藤肝毒性物質(zhì)，有助于進一步探討研究確證雷公藤肝毒性成分。本實驗借鑒中藥血清藥物化學(xué)方法分析血清中移行成分，初步闡述雷公藤肝毒性可能的外源性物質(zhì)基礎(chǔ)，為臨床雷公藤安全用藥提供參考；嘗試建立中藥毒性成分辨識模式，為類似毒性中藥研究提供示例。

綜上所述，雷公藤肝毒性是客觀存在的，本文采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)首次在大鼠體內(nèi)血清中檢測到上述雷公藤原型成分，血清中原型成分S1～S5可能包含雷公藤肝毒性成分，其是否為雷公藤肝毒性成分還有待進一步研究和驗證。

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PreliminaryStudyonSerumPharmacochemistryofTripterygiumGlycosidesHeptotoxicity

WANGXiaodong1,YETao2,JINCheng2,XIAOXiaohe2,ZHAOKuijun1,PUShibiao3*，MAZhijie1*

(1.BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China；2.IntegrativeMedicalCenter, 302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.YunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：To study the blood components in tripterygium glycosides on liver toxicity and further explore its material basis.Methods：The objective authenticity of liver damage caused by tripterygium glycosides were evaluated by observing the liver histopathology and serum levels of AST，ALT.The fingerprint of Tripterygium glycosides UPLC-Q-TOF/MS was established by serum pharmacochemistry and MSEmode in a mass spectrometer，and the serum ingredients were identified.Results：Compared with the blank group，the rats showed statistically significant differences in liver pathomorphology and serum AST and ALT after administratedTripterygiumextract four weeks.The serum fingerprint identified 5 components include othosphenic acid，triptotriterpenic acid，demethylregelin，wilforlide and cangoronine.Conclusion： The constituents of liver toxicity of tripterygium glycosides absorbed into blood are preliminarily identified，which could lay the foundation for clarification of its materials basis.

Tripterygium glycosides；liver toxicity；serum pharmacochemistry；fingerprint

2016-04-26)

北京市中醫(yī)管理局項目(QN2014-18)；首都中醫(yī)藥研究專項(14ZY12)；北京友誼醫(yī)院院啟動項目(YYQDKT2014-20)

*

蒲仕彪，博士，講師，研究方向：肝病的中醫(yī)診療研究，E-mail：pushi511@126.com；馬致潔，博士，主管中藥師，研究方向：中藥肝毒性及臨床合理用藥，Tel：(010)63138562，E-mail：13811647091@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.012