諾麗多糖的單糖組成分析及體外抗氧化活性研究

, ,,,,,

(浙江工業(yè)大學(xué),浙江杭州 310014)

諾麗多糖的單糖組成分析及體外抗氧化活性研究

左麗敏,陸雨,江石平,晏永球,童應(yīng)鵬,陳素紅*,王平*

(浙江工業(yè)大學(xué),浙江杭州 310014)

諾麗多糖,分級(jí)醇沉,單糖組成,體外抗氧化活性

1 材料與方法

1.1材料與儀器

諾麗果干 海南萬(wàn)之堂生物科技有限公司,經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院王平教授鑒定為諾麗正品。

葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man) 成都植標(biāo)化純生物科技有限公司,均為對(duì)照品；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;濃硫酸 西隴科學(xué)股份公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚 阿拉丁試劑有限公司;氫氧化鈉、水楊酸、FeSO4天津市永大化學(xué)試劑有限公司;正丁醇、鹽酸 杭州雙林化工試劑廠;氯仿、乙酸、甲醇、H2O2上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇 安徽安特食品股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純?cè)噭?；脫色一?hào)樹(shù)脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司。乙腈、甲醇 Tedia公司,為色譜純?cè)噭?/p>

KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;Agilent1260型HPLC色譜儀 美國(guó)Agilent公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司;Sartorius BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜條件:Agilent C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸,梯度洗脫:0→6→20→40→50→54 min,乙腈濃度:8%→12%→18.5%→19.5%→23%→25%。柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.2.2 諾麗多糖樣品的制備和含量測(cè)定 精密配制10、20、30、40、50、60 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度后繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0125x+0.0348(R2=0.9991)。

諾麗果干粉碎,過(guò)40目篩，加入娃哈哈純凈水。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)中提取條件(300 g諾麗果干，提取溫度60 ℃、超聲功率80 W、提取時(shí)間40 min、液料比30 mL/g)超聲提取得到多糖溶液,過(guò)濾濃縮成800 mL,平均分成四份,分別加乙醇至濃度為30%、50%、70%、90%醇沉后離心冷凍干燥,得到四個(gè)諾麗粗多糖,用苯酚-硫酸法測(cè)定四個(gè)乙醇濃度的多糖得率。經(jīng)大孔樹(shù)脂[10]脫色和sevage法[11]脫蛋白后濃縮干燥得到A(30%)、B(50%)、C(70%)、D(90%)四個(gè)純化后多糖樣品,測(cè)定四個(gè)多糖樣品中多糖含量,多糖得率與含量計(jì)算方法見(jiàn)下列公式(1)和(2)。

多糖得率(%)=C1V1F1/W1×100

式(1)

多糖含量(%)=C2V2F2/W2×100

式(2)

C1-待測(cè)粗多糖濃度,V1-待測(cè)粗多糖溶液體積,F1-待測(cè)粗多糖稀釋倍數(shù),W1-諾麗果干重量;C2-脫色后待測(cè)多糖濃度,V2-脫色后待測(cè)多糖溶液體積,F2-脫色后多糖稀釋倍數(shù),W2-脫色后諾麗多糖樣品重量。

1.2.3 供試品的制備

1.2.3.1 多糖樣品水解及衍生化 參照文獻(xiàn)[12]中方法,分別稱(chēng)取10 mg A、B、C、D四個(gè)多糖樣品于具塞試管中,加入2 mL 2 mol/L硫酸溶液于110 ℃烘箱中完全水解4 h,冷卻后加入4 mol/L NaOH溶液2 mL中和,離心,取上清液。取1 mL水解樣液,加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液1 mL和0.3 mol/L NaOH溶液1 mL,在70 ℃下水浴反應(yīng)30 min,冷卻至室溫后加入0.3 mol/L HCl溶液1 mL,混勻后加入等體積氯仿萃取三次,棄去有機(jī)層,水層稀釋后過(guò)0.45 μm膜,供HPLC分析。

1.2.3.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化 分別配制2 mmol/L葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖對(duì)照品溶液,各取0.1 mL對(duì)照品溶液,按1.2.3.1中方法衍生化后供HPLC分析。

1.2.4 諾麗多糖的體外抗氧化活性

1.2.4.1 清除DPPH·能力 參照文獻(xiàn)[13]方法,用去離子水將A、B、C、D多糖樣品分別配成濃度0.5、1、2、4、8 mg/mL多糖樣品溶液,配制0.08 mg/mL DPPH·乙醇溶液。A0組2 mL去離子水+2 mL DPPH·溶液,A1組2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品溶液,A2組2 mL無(wú)水乙醇+2 mL樣品溶液,加樣后避光反應(yīng)30 min,在波長(zhǎng)517 nm測(cè)定其吸光度。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,每組重復(fù)3次,取其平均值。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4.2 清除OH·能力 參照文獻(xiàn)[14]方法,多糖樣品溶液濃度同1.2.4.1,配制3 mmol/L FeSO4、H2O2及水楊酸乙醇溶液。A0組1 mL去離子水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液混合,A1組1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液混合,A2組1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL去離子水混合,37 ℃水浴反應(yīng)30 min,在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定其吸光度。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,每組重復(fù)3次,取其平均值。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1四個(gè)多糖樣品的提取率及含量

四個(gè)多糖樣品經(jīng)硫酸-苯酚法含量測(cè)定后,其不同濃度乙醇對(duì)諾麗多糖的醇沉效果(即提取效果)和初步純化后四個(gè)多糖樣品中多糖的含量如表1所示。從表中可以看出乙醇濃度越高醇沉出的多糖越多,其提取效果越好;初步純化后得到的四個(gè)多糖樣品中多糖含量區(qū)別不大。

表1 四個(gè)多糖樣品的多糖得率和含量Table 1 The polysaccharide yield and content of four polysaccharide samples

2.2方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 混合單糖對(duì)照品衍生物分別進(jìn)樣2,4,6,8,10,20 μL進(jìn)行HPLC 分析,以單糖的含量為橫坐標(biāo),單糖衍生物峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)表2。

表2 七種單糖衍生物的線性關(guān)系Table 2 Linear relationship for precolumn derivation product of seven monosaccharides

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 混合單糖對(duì)照品溶液按1.2.3.2方法衍生化后,進(jìn)樣量10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為:0.74%,0.53%,0.50%,1.79%,1.75%,0.35%,0.69%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取混合單糖對(duì)照品溶液6份,依照1.2.3.2方法進(jìn)行衍生化后進(jìn)行HPLC分析,進(jìn)樣量10 μL,計(jì)算各單糖衍生物峰面積的RSD。Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的RSD 分別為:0.40%,1.11%,0.31%,0.63%,0.36%,0.31%,0.74%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 多糖樣品衍生化后,在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)行HPLC分析,記錄峰面積后計(jì)算Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的RSD分別為:0.82%,0.56%,0.57%,1.80%,0.98%,0.38%,0.79%,表明多糖樣品衍生物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知單糖含量的諾麗多糖水解液6份,加入等量的單糖對(duì)照品,按1.2.3.1方法衍生化,HPLC法測(cè)定峰面積,Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc的平均回收率分別為102.1%,98.6%,104.6%,108.9%、96.1%、97.4%和105.3%,RSD 分別為1.83%,0.60%,0.74%,0.69%、1.41%、1.08%和0.89%。

2.3諾麗多糖的單糖組成及比例

2.3.1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC結(jié)果 七種單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后在2.1色譜條件下HPLC分析,結(jié)果如圖1,編號(hào)1～8號(hào)色譜峰分別為PMP、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖的衍生物。

圖1 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram for precolumn derivatization product of mixture standard monosaccharides注:1.PMP；2.Man；3.Rha；4.Glc；5.Gal；6.Ara；7.Xyl；8.Fuc。

2.3.2 四個(gè)多糖樣品單糖組成HPLC結(jié)果 四個(gè)多糖樣品衍生化后在1.2.1色譜條件下進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如圖2,檢測(cè)出四個(gè)諾麗多糖樣品的單糖組成為Man、Rha、Glc、Gal及Ara,A的單糖摩爾百分比為1.33∶4.24∶77.22∶9.83∶7.38,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;B的單糖摩爾百分比為2.58∶2.28∶52.20∶31.40∶11.54,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;C的單糖摩爾百分比為1.32∶6.45∶47.00∶32.91∶12.31,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;D的單糖摩爾百分比為3.18∶3.39∶27.23∶45.50∶20.70,此部位多糖的單糖主要為Gal,其次為Glc和Ara。四個(gè)部位中Man及Rha含量是微量的。

圖2 四個(gè)多糖樣品衍生化后的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram for precolumn derivatization product of four polysaccharide samples注:1.PMP；2.Man；3.Rha；4.Glc；5.Gal；6.Ara；8.Fuc。

2.4抗氧化結(jié)果

2.4.1 清除DPPH·能力 DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,其乙醇溶液呈紫色,當(dāng)DPPH·與抗氧化劑反應(yīng)后,紫色會(huì)隨著被還原而逐漸變淺,吸光度降低[15],以此來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑的清除能力。此法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高,是常用的評(píng)價(jià)體外抗氧化活性方法。A、B、C、D四個(gè)多糖樣品對(duì)DPPH·的清除能力見(jiàn)圖3,從圖中可以看出,諾麗多糖對(duì)DPPH·有一定的清除能力,8 mg/mL時(shí)D的清除率達(dá)到58.96%,在0.5～8.0 mg/mL范圍內(nèi)多糖清除能力呈明顯劑量依賴(lài)性。在低濃度時(shí)(0.5～2 mg/mL),A對(duì)DPPH·的清除能力弱于B、C、D,而其他3個(gè)多糖樣品對(duì)DPPH·清除能力相差不大;在高濃度(4～8 mg/mL)時(shí),A、B、C、D對(duì)DPPH·的清除能力差異明顯(p<0.01)。四個(gè)多糖樣品對(duì)DPPH·清除能力大小整體趨勢(shì)為:D>C>B>A。

圖3 四個(gè)多糖樣品對(duì)DPPH·的清除能力Fig.3 DPPH· scavenging ability of four polysaccharide samples

2.4.2 清除OH·能力 參考Fenton反應(yīng)體系[16],利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH,·OH活性高,存活時(shí)間短,通過(guò)在體系中加入水楊酸來(lái)有效地捕捉·OH,產(chǎn)生有色產(chǎn)物,該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收,在反應(yīng)體系加入具有清除·OH功能的被測(cè)物,與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)與·OH反應(yīng),使有色產(chǎn)物生成量減少。A、B、C、D四個(gè)多糖樣品對(duì)OH·的清除能力如圖4,從圖中可以看出,諾麗多糖對(duì)OH·有一定的清除能力,8 mg/mL時(shí)C的清除率達(dá)到68.36%,在0.5～8.0 mg/mL范圍內(nèi)多糖清除能力呈明顯劑量依賴(lài)性。低濃度(0.5～1 mg/mL)時(shí),四個(gè)多糖樣品對(duì)OH·的清除能力相仿,在高濃度(2～8 mg/mL)時(shí),四個(gè)多糖樣品清除率差異較大(p<0.01),特別是D對(duì)OH·的清除率很低。四個(gè)多糖樣品對(duì)OH·清除能力總體大小趨勢(shì)為:C>B>A>D。

圖4 四個(gè)多糖樣品對(duì)OH·的清除能力Fig.4 OH· scavenging ability of four polysaccharide samples

圖5 四個(gè)多糖樣品對(duì)的清除能力Fig.5 · scavenging ability of four polysaccharide samples

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)用PMP柱前衍生化HPLC法分析了不同濃度的乙醇分級(jí)醇沉得到的四個(gè)醇沉諾麗多糖的單糖組成及比例,并對(duì)Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl、Fuc 7種單糖的PMP衍生化產(chǎn)物的HPLC分離分析條件進(jìn)行了摸索,用乙酸代替了文獻(xiàn)中常用的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,磷酸鹽緩沖液遇有機(jī)試劑易析出結(jié)晶而造成色譜柱堵塞,且色譜柱沖洗過(guò)程更加繁瑣,因此用乙酸作為流動(dòng)相更有利于儀器的使用與維護(hù);并對(duì)諾麗多糖單糖組成分析方法做了補(bǔ)充。從數(shù)據(jù)分析可以看出,隨著乙醇濃度的增高,半乳糖及阿拉伯糖的摩爾百分比不斷增加,而葡萄糖摩爾百分比逐漸下降。

[1]顧湘雋.身價(jià)不菲的怪果:諾麗[J].國(guó)際市場(chǎng),2001(1):12-13.

[2]Zhang WM,Wang W,Zhang JJ,et al.Antibacterial constituents of HainanMorindacitrifolia(Noni)leaves[J]. Journal of Food Science,2016,81(5):1192-1196.

[3]胡鳴旭,張洪才,于純淼,等. 諾麗果提取物的抗氧化活性及心肌保護(hù)作用研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2014,30(2):31-36.

[4]Li JH,Sara LS,Hilary BV,et al. Fermented Noni Exudate(fNE):A mediator between immune system and anti-tumor activity[J]. Oncology Reports,2008,20:1505-1509.

[5]Simla B,Klaus U,Petra H,et al. Analgesic and Antiinflammatory Activity ofMorindacitrifoliaL.(Noni)Fruit[J]. Phytother. Res,2010,24:38-42.

[6]張偉敏,魏靜,師萱,等. 諾麗葉降血壓、降血糖和抗氧化活性的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(19):66-70.

[7]劉海青,劉銀才,胡文婷. 海巴戟果水溶性多糖的分離純化及清除自由基活性[J]. 生物加工過(guò)程,2008,6(3):44-47.

[8]Vennila S,Brindha D.Invitrocytotoxic and apoptotic activity of polysaccharide richMorindaCitrofollafruit on MCF-7 cells[J]. Asian J. of Pharm. and Clin. Res.,2015,8(2):190-193.

[9]Anne H,Eiichi F. An Immunomodulatory Polysaccharide-Rich Substance from the Fruit Juice ofMorindacitrifolia(Noni)with Antitumour Activity[J].Phytother. Res,1999,13:380-387.

[10]曹鵬偉,戴軍,彭奇均. 樹(shù)脂對(duì)靈芝多糖色素吸附研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(10):90-93.

[11]方積年,丁侃. 天然藥物-多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國(guó)天然藥物,2007,5(5):338-347.

[12]羅懿洋,任道遠(yuǎn),陳麗芳,等. 杏鮑菇多糖的單糖的組成分析及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2015,8(36):158-162.

[13]Qian JY,Bai YY,Tang J,et al. Antioxidation andα-glucosidase inhibitory activities of barley polysaccharides modified with sulfation[J]. LWT-Food Science and Technology. 2015,64:104-111.

[14]Ye SH,Zhang JJ,Liu ZF,et al. Biosynthesis of selenium rich exopolysaccharide(Se-EPS)by Pseudomonas PT-8 and characterization of its antioxidant activities[J]. Carbohydrate Polymers,2016,142:230-239.

[15]韋獻(xiàn)雅,殷麗琴,鐘成,等. DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2014,35(9):317-322.

[16]Hanasaki Y,Ogawa S,Fukui S. The correlation between active oxygens scavenging and effects of flavonoids[J]. Free Radical Biol. Med.,1994,16:845-850.

[17]Robak J,Gryglewski RJ. Flavonoids are scavengers of superoxide anions[J]. Biochem. Pharmacol,1998,37:837-841.

[18]楊小青,宋金春,謝順嵐,等. 不同提取方法蓮子心總生物堿抗氧化活性比較[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2015,12(18):100-104.

[19]Chen HX,Zhang M,Qu ZS,et al. Antioxidant activities of different fractions of polysacchari-de conjugates from green tea(CamelliaSinensis)[J]. Food Chemistry,2008,106:559-563.

[20]鄭必勝,金江濤,閆文娟. 廣東蟲(chóng)草多糖的醇沉及凝膠滲透色譜法表征其分子量分布的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(5):120-123.

StudyonmonosaccharidecompositionsanalysisandantioxidantactivityinvitroofpolysaccharidesfromNoni

ZUOLi-min,LUYu,JIANGShi-ping,YANYong-qiu,TONGYing-peng,CHENSu-hong*,WANGPing*

(Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Noni polysaccharides;grading-alcoholic precipitation;monosaccharide compositions;antioxidant activityinvitro

2016-12-29

左麗敏(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學(xué),E-mail：zuolm91@163.com。

*通訊作者:陳素紅(1973-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué),E-mail：chensuhong@aliyun.com。 王平(1969-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué),E-mail：wangping45@zjut.edu.cn。

重大科技專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2015C02032)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0056-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.011