PI因子結(jié)構類似物對恰塔努加鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)納他霉素的影響

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(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

PI因子結(jié)構類似物對恰塔努加鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)納他霉素的影響

寇美辰,唐欣影,魏寶東*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

以恰塔努加鏈霉菌(StreptomycesChattanovgensis)為發(fā)酵菌種,向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加PI因子結(jié)構類似物,經(jīng)過初篩,獲得能正向調(diào)控納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的PI因子結(jié)構類似物;應用Box-Behnken設計建立單因素與納他霉素產(chǎn)量之間的回歸模型,經(jīng)由響應面分析得到最優(yōu)組合條件。實驗結(jié)果表明:1,2-丙二醇、丙三醇和三乙醇胺都能有效提高納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量,向每50 mL培養(yǎng)基中添加0.42 mL 1,2-丙二醇、0.43 mL丙三醇、1 mL三乙醇胺,發(fā)酵時間為120 h時,發(fā)酵培養(yǎng)基中納他霉素的產(chǎn)量為2.5 g/L,是空白對照組(1.567 g/L)的1.60倍。由此可知一定添加量的PI因子結(jié)構類似物可以提高納他霉素產(chǎn)量。

PI因子,恰塔努加鏈霉菌,納他霉素,發(fā)酵,響應面分析

納他霉素(Natamycin)是由恰塔努加鏈霉菌(S.chattanovgrnsis)、納塔爾鏈霉菌(S.natalensis)、褐黃孢鏈霉菌(S.gilvosporeus)[1-2]和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)[3]等經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,由于其廣譜、高效、安全無毒,且對食品風味無不良影響,被廣泛用于食品工業(yè)方面[4-5]。但由于納他霉素發(fā)酵水平低,成本高,限制了在食品防腐領域的廣泛應用[6]。一直以來,為了提高納他霉素的產(chǎn)量,在菌種選育[7-9]、培養(yǎng)基條件優(yōu)化[10-11]和發(fā)酵工藝優(yōu)化方面投入了較多研究,而微生物發(fā)酵方面涉及較少。

最近在對由S.natalensis發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的研究中發(fā)現(xiàn)一種新型的自誘導物-PI因子,其結(jié)構為2,3-二氨基-2,3-雙(羥甲基)-1,4-丁二醇[12]。當S.natalensis分泌到胞外的PI因子達到50 nm時會引發(fā)群感效應,促進納他霉素的合成,并且外源添加PI因子可使PI因子缺失突變菌恢復產(chǎn)生納他霉素的能力[13-14]。通過高效液相色譜法與核磁共振對純化后的PI因子進行凈化、分析,證明含有甘油與乳酸成分,其中甘油有修復npi287缺陷型突變體菌株在液體培養(yǎng)基產(chǎn)生納他霉素的能力[15]。乙二醇、1,2-丙二醇也有相似作用,但已經(jīng)排除了其作為碳源營養(yǎng)物質(zhì)的可能性,且多元醇或者乙酸甘油酯或者甘油乳酸酯沒有這種作用。甘油能刺激菌株分泌納他霉素,外源添加甘油能導致缺陷型npi287突變菌株恢復產(chǎn)生納他霉素的能力,但是并不能產(chǎn)生PI因子[16]。而外源添加PI因子與甘油混合物時,納他霉素的產(chǎn)量高于單獨添加PI因子[17]。

由于乙二醇、甘油等PI因子結(jié)構類似物對納他霉素的合成有促進作用,而這些化合物共同點是含有氨基或者羥基[18],所以,本實驗以PI因子結(jié)構類似物為研究材料,進行對納他霉素發(fā)酵影響的初步研究,篩選正調(diào)控納他霉素生物合成影響較大的PI因子結(jié)構類似物,并通過響應面分析得到優(yōu)化組合,以期提高納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

恰塔努加鏈霉菌(StreptomycesChattanovgensis)ATCC13358 沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院。

61號斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉15.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、瓊脂15.0 g/L、蒸餾水1000 mL、pH7.4。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂15～20 g/L、蒸餾水1000 mL、自然pH。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨6.0 g/L、酵母浸粉6.0 g/L、蒸餾水1000 mL，pH7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L、葡萄糖40.0 g/L(50%單獨滅菌)、大豆蛋白胨20.0 g/L、蒸餾水1000 mL，pH7.4。

超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;PHS-25數(shù)顯pH計 上海雷磁精密儀器廠;手動壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京電器三廠制造;HZQ-F全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東明醫(yī)療儀器廠;紫外分光光度計 南京菲勒儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 篩選PI因子結(jié)構類似物單因素實驗 斜面培養(yǎng):接種于61號斜面培養(yǎng)基,29 ℃條件下培養(yǎng)恰塔努加鏈霉菌5～7 d;種子培養(yǎng):用適量無菌水洗下孢子制備成108CFU/mL的孢子懸浮液[19],取適量孢子懸浮液接種到250 mL三角瓶中,29 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)恰塔努加鏈霉菌28～42 h;發(fā)酵培養(yǎng):以6%(體積分數(shù))的接種量加到已添加各種PI因子結(jié)構類似物的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在29 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min條件下培養(yǎng)恰塔努加鏈霉菌120 h。

分別添加1,2-丙二醇、乙二醇、丙三醇和三乙醇胺[20],在每50 mL的培養(yǎng)基中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL的PI因子結(jié)構類似物,發(fā)酵培養(yǎng)120 h,以發(fā)酵液中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量作為評定指標,通過單因素實驗獲得添加PI因子結(jié)構類似物的最適質(zhì)量濃度。

將篩選后的PI因子結(jié)構類似物,以其最適質(zhì)量濃度加于發(fā)酵液中,設定發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132 h,以納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量作為響應值來確定發(fā)酵最優(yōu)時間。

1.2.2 PI因子結(jié)構類似物響應面優(yōu)化實驗設計 分析單因素實驗結(jié)果,將對納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量影響較大的PI因子結(jié)構類似物作后續(xù)的響應面分析,運用Design-Expert8.0軟件分析出恰塔努加鏈霉菌發(fā)酵體系中PI因子結(jié)構類似物的最優(yōu)組合,實驗設計如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素和水平Table 1 Independent variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 納他霉素的測定 將發(fā)酵液與甲醇以1∶9的比例放于離心管中,充分振蕩,靜置15 min后放入離心機中,8000 r/min離心20 min,用甲醇對上清液進行適當系列稀釋,在303 nm下測定吸光度值,根據(jù)吸光度和標準曲線進行納他霉素的定量分析[21]。

1.2.4 恰塔努加鏈霉菌種子生長曲線的確定 在菌株的生長過程中,每6 h取其干重,測定菌體干重(drycellweight,DCW)[22],以發(fā)酵時間做X軸,菌體干重為Y軸繪制種子生長曲線圖。

1.3數(shù)據(jù)分析

通過SPSS軟件分析計算數(shù)據(jù)差異顯著性,p<0.05差異顯著,p<0.01差異極顯著;采用Design-Expert8.0軟件進行響應面優(yōu)化實驗,找到最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1確定納他霉素標準曲線

應用紫外分光光度計法法,根據(jù)已知濃度的納他霉素標準液繪制標準曲線,以納他霉素的含量為橫坐標(x),對應吸光度值為縱坐標(Y),根據(jù)線性回歸方程y=0.1076x-0.0095,由方程的決定系數(shù)R2=0.9998可知在1～9 mg/L的范圍內(nèi)有一定線性關系[23]。

2.2單因素實驗結(jié)果

2.2.1 不同PI因子結(jié)構類似物對納他霉素產(chǎn)量的影響 本實驗將選擇4種PI因子結(jié)構類似物:1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺,分別向每50 mL發(fā)酵液中添加0.4 mL的各PI因子結(jié)構類似物進行實驗,篩選出對納他霉素產(chǎn)量影響較大的PI因子結(jié)構類似物。

從圖1可以看出,相比于對照組1.567 g/L,添加1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺后納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量分別為2.02、2.03、1.674、.788 g/L。這四種PI因子結(jié)構類似物均能夠提高納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量,但提高程度有所差異,其中1,2-丙二醇、丙三醇的效果較好。用SPSS軟件進行分析1,2-丙二醇與丙三醇差異顯著(p<0.05),三乙醇胺與1,2-丙二醇、丙三醇差異極顯著(p<0.01),即本實驗中四種PI因子結(jié)構類似物在添加量為0.4 mL時對納他霉素均有促進作用,但各自正調(diào)控程度有所不同,原因可能是受氨基和羥基結(jié)構以及數(shù)量的影響,具體原因需要進一步探究。

圖1 不同的PI因子結(jié)構類似物對納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different PI factor structural analogues on natamycin production

2.2.2 不同添加量的PI因子結(jié)構類似物對納他霉素產(chǎn)量的影響 從圖2可以看出,在添加范圍內(nèi),納他霉素產(chǎn)量隨PI因子結(jié)構類似物濃度的升高而升高,在每50 mL培養(yǎng)基中添加0.4 mL 1,2-丙二醇時,納他霉素產(chǎn)量達到2.02 g/L;添加丙三醇0.4 mL時,其產(chǎn)量較高達到2.23 g/L;添加乙二醇0.4 mL時,產(chǎn)量達到1.674 g/L;添加三乙醇胺1 mL時,產(chǎn)量達到1.788 g/L。但當PI因子結(jié)構類似物濃度繼續(xù)升高時,卻不利于納他霉素的合成,說明此體系中應該存在PI因子結(jié)構類似物的最適質(zhì)量濃度。

圖2 不同添加量的PI因子結(jié)構類似物對納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PI factor structural analogues on natamycin production

實驗中所采用的這4種PI因子結(jié)構類似物都能夠增加納他霉素的產(chǎn)量,原因可能是其結(jié)構中含有的氨基或者羥基在恰塔努加鏈霉菌次級代謝過程中引發(fā)了群感效應[18],正調(diào)控納他霉素的生成,具體原因尚未明確,需要進一步的研究。根據(jù)實驗結(jié)果,將運用響應面法把含有氨基結(jié)構的三乙醇胺和1,2-丙二醇與丙三醇作后續(xù)響應面分析。

2.2.3 發(fā)酵時間對納他霉素產(chǎn)量的影響 分別向每50 mL發(fā)酵液中添加0.4 mL的3種PI因子結(jié)構類似物,從圖3中可以看出,發(fā)酵時間在60 h之前,納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量都在提高,但上升幅度比較平緩;發(fā)酵時間在60～120 h納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量大幅上升,發(fā)酵到120 h時均達到最高值;之后逐漸趨于平緩,到132 h時均無明顯變化，可能是由于后期發(fā)酵時菌體過多,氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)供給不上導致120 h以后的納他霉素產(chǎn)量沒有繼續(xù)升高。

圖3 發(fā)酵時間對納他霉素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on natamycin production

2.3響應面法優(yōu)化實驗結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果 在單因素實驗的基礎上,確定因素和水平[24],選取三乙醇胺(A)、丙三醇(B)、1,2-丙二醇(C)作為實驗因素,分別設計3種水平[25],以納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量作為評價指標(Y),采用Box-Behnken實驗設計對發(fā)酵體系中添加的PI因子結(jié)構類似物進行優(yōu)化,實驗的設計及結(jié)果如表1和表2所示。

表2 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

2.3.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計分析 根據(jù)表1的結(jié)果,建立納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量對3因素的線性回歸方程:Y=2.48+7.500E-0.03A+0.4B+0.09C-0.03AB-0.02AC-0.04BC-0.07A2-0.087B2-0.15C2。實驗數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的統(tǒng)計分析Table 3 Statistical analysis of the fitted regression equation

注:*.差異顯著(p<0.05);**.差異極顯著(p<0.01)。

圖4 不同因素間的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of different factors

從圖4可以看出,在固定其他發(fā)酵參數(shù)條件下,當1,2-丙二醇一定時,納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量隨著三乙醇胺和丙三醇質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,曲面圖中的穩(wěn)定點即極大值點,說明存在最適質(zhì)量濃度。統(tǒng)一其他發(fā)酵參數(shù),當丙三醇一定時,納他霉素的產(chǎn)量隨著三乙醇胺和1,2-丙二醇的增加呈先增加后減少的趨勢,達到頂峰后減小,等高線圖形近似橢圓形,說明兩自變量間交互效應明顯。當三乙醇胺一定時,另兩種物質(zhì)的濃度交互作用對納他霉素的產(chǎn)量有顯著的影響,當1,2-丙二醇在0.4 mL以下,納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量升高,當1,2-丙二醇的濃度大于0.4 mL時,納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量開始降低,當丙三醇濃度為0.42 mL時,產(chǎn)量達到最高值。PI因子中含有兩個氨基和四個羥基結(jié)構,當我們外源復合添加這三種PI因子結(jié)構類似物時,相當于同時加入了羥基與氨基,可能正好滿足了PI因子發(fā)生群感效應的條件,促使納他霉素產(chǎn)量提高,具體原因仍需進一步研究。

從響應面圖形上可以直觀地看出各參數(shù)的最優(yōu)值和各參數(shù)之間的交互作用,從圖4中可以較明顯的看出各因素之間的交互作用對納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響,經(jīng)分析在響應值達到最高點時[26],添加量為每50 mL培養(yǎng)基加入1,2-丙二醇0.42 mL、丙三醇0.43 mL、三乙醇胺1 mL。此時搖瓶中納他霉素的發(fā)酵產(chǎn)量最高,預測值為2.5 g/L。將已經(jīng)確定的各物質(zhì)濃度加入發(fā)酵培養(yǎng)基中,進行發(fā)酵培養(yǎng),平行實驗三次,最終得到納他霉素的產(chǎn)量2.48、2.50、2.51 g/L。與預測數(shù)值接近,表明此模型能夠較好地說明實驗情況。

3 結(jié)論

通過單因素實驗對4 種不同PI因子結(jié)構類似物進行篩選,得知1,2-丙二醇、丙三醇和三乙醇胺均能正調(diào)控納他霉素的合成。通過Design-Expert8.0軟件進行響應面分析得到此發(fā)酵體系中的最優(yōu)配比:添加量為每50 mL培養(yǎng)基加入丙三醇為1,2-丙二醇為0.42、0.43 mL、三乙醇胺為1 mL。在這種發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下產(chǎn)量大值可達到2.5 g/L,為實驗組的(1.567 g/L)的1.60倍。

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InfluencesofPIfactorstructuralanaloguesontheproductionofnatamycinfromStreptomycesChattanovgensis

KOUMei-chen,TANGXin-ying,WEIBao-dong*

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Preliminary screening was carried out to obtain PI factor structural analogues that can effectively induce natamycin production in the fermentation culture byStreptomycesChattanovgensis.Box-Behnken experimental design was adopted to build regression model between single factor and natamycin production,according the response surface analysis to determine the optimal conditions. The results indicated that 1,2-propanediol,glycerol and triethanolamine effectively increased natamycin production. With volume of 0.42,0.43 and 1 mL for these PI factor structural analogues in 50 mL culture under the condition of 120 h,the yield of natamycin was 2.5 g/L,which was 0.60 times higher than that of the control group.It can be seen that a certain amount of PI factor structural analogues can increase the yield of natamycin.

PI factor;StreptomycesChattanovgensis;natamycin;fermentation;response surface methodology

2016-12-29

寇美辰(1992-)，女，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵研究，E-mail:804779029@qq.com。

*通訊作者:魏寶東(1969-)，男，博士，副教授，研究方向：食品制造與貯藏研究，E-mail:bdwei2003@yahoo.com.cn。

遼寧省科學技術計劃(2014027007)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0045-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.009