基于ITS2序列的維吾爾藥材神香草鑒定研究△

楊珺，樊叢照，李曉瑾*

(1.昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所 國(guó)家中醫(yī)藥管理局新疆中藥民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830002)

·基礎(chǔ)研究·

基于ITS2序列的維吾爾藥材神香草鑒定研究△

楊珺1，樊叢照2，李曉瑾2*

(1.昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所 國(guó)家中醫(yī)藥管理局新疆中藥民族藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：采用DNA條形碼技術(shù)建立維吾爾藥材神香草鑒別的方法。方法：使用DNA條形碼ITS2序列，建立了維吾爾藥材神香草基原植物DNA條形碼ITS2序列標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)市售11份“神香草”藥材進(jìn)行鑒定。結(jié)果：市售神香草藥材僅有2份為維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)中收錄的硬尖神香草，1份為神香草屬植物，1份為鼠尾草屬植物，其余7份來(lái)源于荊芥屬植物。結(jié)論：DNA條形碼ITS2序列可作為鑒定維吾爾藥材神香草及其偽品藥材的有效工具。

神香草；ITS2；鑒定；DNA條形碼

維吾爾常用藥材神香草，維吾爾語(yǔ)名“祖帕”，維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)中記載其基原植物為唇形科(Lamiaceae)多年生草本植物硬尖神香草H.cuspidatus，其全草均可入藥，維醫(yī)廣泛用其治療氣管炎的咳嗽、氣喘、感冒發(fā)燒和風(fēng)濕等病證[1-4]。目前硬尖神香草多為野生，由于資源短缺，使市場(chǎng)供應(yīng)不足而出現(xiàn)混淆品，主要為大苞荊芥Nepetabracteata[5]。大苞荊芥維吾爾語(yǔ)名亦為“祖帕”，易與硬尖神香草混淆，但其化學(xué)成分，藥性及作用功效與硬尖神香草存在顯著差異[6-7]，誤用會(huì)危害患者的生命健康。針對(duì)市場(chǎng)上出現(xiàn)的混淆品，已有研究者采用性狀、顯微及理化鑒別等方法對(duì)硬尖神香草與大苞荊芥進(jìn)行了鑒定[5]，雖然為維吾爾藥材神香草的質(zhì)量控制提供了一定的依據(jù)，但這些鑒定方法需要很強(qiáng)的專業(yè)性，不適于推廣應(yīng)用。

相比之下，DNA條形碼技術(shù)[8]能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒定，適用于非專業(yè)工作者。2011年，中國(guó)植物條形碼工作組(Chinese Plant BOL Group)建議將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心DNA條形碼[9]。ITS2序列作為藥材鑒別的DNA條形碼，已被載入《中華人民共和國(guó)藥典》2010版第三增補(bǔ)本[10]和2015版[11]，在常用中藥民族藥材紅景天[12]、枸杞[13]、蜀葵[14]等藥材真?zhèn)舞b別中得到驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

此研究中所使用的16份神香草屬植物樣本采自新疆不同地區(qū)，包括11份硬尖神香草及5份大花神香草，由新疆中藥民族藥研究所副研究員王果平鑒定，憑證標(biāo)本保存于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館(新疆XTNM)；自市場(chǎng)收集11份“神香草”藥材樣品。神香草基原植物樣本ITS2單倍型序列已提交至GenBank(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息

1.2試劑

PCR擴(kuò)增所用引物由生工生物工程合成，ITS2正向序列：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；DNA提取試劑盒(DP305-03)、DNA聚合酶及dNTP等均購(gòu)自天根生物(TIANGEN)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所使用的DNA提取研磨儀為GRINDER，型號(hào)GT-100；離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器，型號(hào)AnkerTGL-16C；PCR擴(kuò)增儀為AnAnalytikJenacompany，型號(hào)070-851。

1.4方法

1.4.1DNA提取及檢測(cè) 稱取干燥藥材(枝葉)30mg，DNA提取研磨儀1000r·min-1研磨2min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。

1.4.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序 反應(yīng)體積25μL，dNTP0.4μL(10mmol·L-1)，PCR緩沖液2.5μL(10×)，引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)，聚合酶1.0U，總DNA1μL(約30ng)。引物ITS2擴(kuò)增程序：94℃，變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s(40個(gè)循環(huán))；72℃延伸10min[15]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)并純化后，使用ABI3730XL(AppliedBiosystemsCo.，USA)測(cè)序儀由美吉生物測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5數(shù)據(jù)處理

測(cè)序峰圖用CodonCodeAlignerV4.0.4(CodonCodeCo.，USA)校對(duì)拼接，去除引物區(qū)。將所有序列由軟件MEGA5.0(molecularevolutionarygeneticsanalysis)分析比對(duì)[16]，ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[17]，用鄰接(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，使用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率[18]。

1.6BLAST鑒定

將測(cè)序獲得的藥材樣本序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行BLAST鑒定，搜索相似性最高的植物序列。

2 結(jié)果

2.1序列信息分析

ITS2序列分析結(jié)果顯示，硬尖神香草為2個(gè)單倍型，長(zhǎng)度均為219bp，GC含量變化為68.0%～68.5%；大花神香草單倍型數(shù)為2，長(zhǎng)度為219bp，GC含量為68.0%；11個(gè)藥材樣本有7個(gè)單倍型，其中編號(hào)為YC130006、YC130008、YC130011為同一單倍型，編號(hào)YC130007與YC130010序列一致，YC130005與YC130009一致。

表2 ITS2序列信息

2.2種內(nèi)及種間變異位點(diǎn)分析

16份植物樣本中，硬尖神香草種內(nèi)存在1個(gè)變異位點(diǎn)，為187bp位點(diǎn)的A-C變異，大花神香草種內(nèi)有2個(gè)變異位點(diǎn)，分別為164bp位點(diǎn)的C-T變異及187bp位點(diǎn)的A-C變異，硬尖神香草與大花神香草種間差異不顯著。在7個(gè)單倍型的神香草藥材序列中，編號(hào)為YC130001的藥材與硬尖神香草相似，編號(hào)為YC130009的藥材序列與硬尖神香草一致，其余序列均與硬尖神香草之間變異較大。

2.3ITS2序列BLAST鑒定結(jié)果

11條藥材序列GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST結(jié)果如表3所示，僅編號(hào)為YC130001、YC130005及YC130009的藥材與神香草屬植物序列相似度較高，其中標(biāo)號(hào)為YC130005及YC130009的藥材與硬尖神香草一致，判定為正品藥材，編號(hào)為YC130001的藥材來(lái)源于神香草屬其他植物。編號(hào)為YC130004的藥材來(lái)源于鼠尾草屬植物，其余7份藥材均來(lái)源于荊芥屬植物。

2.4神香草屬植物及藥材NJ樹(shù)鑒定結(jié)果

基于硬尖神香草、大花神香草及藥材單倍型序列構(gòu)建NJ鑒別樹(shù)，結(jié)果如圖2所示，僅編號(hào)為YC130001及YC130009的藥材與硬尖神香草及同屬植物聚在一起，支持率為99%；編號(hào)為YC130002、YC130003、YC130006及YC130007的藥材聚為一支；YC130004的藥材單獨(dú)為一支。

圖1 不同單倍型實(shí)驗(yàn)樣本種內(nèi)及種間變異位點(diǎn)比較

藥材編號(hào)相似度最高植物拉丁名相似度最高植物GenBank登錄號(hào)中文名相似度(%)YC130001H.cuspidatusKF454217神香草屬植物95YC130002NepetabinaloudensisAJ515311荊芥屬的一種92YC130003NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種93YC130004SalviadaghestanicaKU563878鼠尾草屬的一種89YC130005H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130006NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130007NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種93YC130008NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130009H.cuspidatusKF454217硬尖神香草100YC130010NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94YC130011NepetaassurgensAJ515316荊芥屬的一種94

圖2 基于ITS2序列的單倍型NJ鑒別樹(shù)，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000次重復(fù))

3 討論

本研究首次采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)市售維吾爾藥材“神香草”進(jìn)行鑒定，與以往的鑒定方法相比，DNA條形碼鑒定不需要樣本性狀完整，僅需要微量的入藥部位即可。研究結(jié)果表明，從維吾爾藥材“神香草”藥用部位枝葉中可成功提取基因組DNA，其DNA質(zhì)量可滿足DNA條形碼鑒定的需求。

本研究以多途徑來(lái)源的硬尖神香草及大花神香草植物ITS2序列建立了鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，將市售藥材中獲得的ITS2序列與鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，雖然NJ樹(shù)鑒定結(jié)果顯示，編號(hào)為YC130001及YC130009的藥材均與硬尖神香草基原植物聚在一起，但NJ樹(shù)并不能完全鑒定植物種，進(jìn)一步BLAST鑒定結(jié)果表明，編號(hào)為YC130009的藥材來(lái)源于硬尖神香草，編號(hào)為YC130001的藥材來(lái)源于神香草屬其他植物；大花神香草由于其資源分布有限，作為藥材的可能性較小。

在GenBank中經(jīng)過(guò)BLAST對(duì)比，11份藥材樣品中有7份與荊芥屬植物相似度較高，因此推測(cè)此7份藥材可能為報(bào)道的大苞荊芥，大苞荊芥維吾爾語(yǔ)名為祖帕，與神香草維語(yǔ)同名，使得神香草藥材來(lái)源混亂，市場(chǎng)偽品及混淆品數(shù)量多。此外，編號(hào)為YC130004的藥材經(jīng)比對(duì)與鼠尾草屬植物，可由此判斷市場(chǎng)上存在使用鼠尾草屬植物充當(dāng)神香草的現(xiàn)象。

DNA條形碼在已經(jīng)在植物分類及草藥鑒定等諸多領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用[19-22]，本文將DNA條形碼應(yīng)用到維吾爾藥材鑒定領(lǐng)域，應(yīng)用此技術(shù)成功鑒定出市售藥材神香草的真?zhèn)?，隨著研究的深入，相信DNA條形碼技術(shù)會(huì)不斷應(yīng)用于其他維吾爾藥材鑒定領(lǐng)域，為維吾爾藥材的真?zhèn)舞b別提供一個(gè)可靠的技術(shù)手段，以保障藥材的正確性，保護(hù)使用者的利益，同時(shí)有利于藥材監(jiān)管部門對(duì)進(jìn)出口維吾爾藥材進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

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StudyonOriginPlantofUygurMedicineHyssopuscuspidatusBasedonITS2Sequence

YANG Jun1，F(xiàn)AN Congzhao2，LI Xiaojin2*

(1.ChangjivocationalandtechnicalcollegeofPharmacy，Changji，831100China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，StateAdministrationoftraditionalChinesemedicineKeyLaboratoryoftraditionalChinesemedicineandethnicmedicineresources，Urumqi830002，China)

Objective：To establish a method for identification of identify the origin plant of Uygur medicineHyssopuscuspidatusby DNA barcode technology.Methods：DNA barcode ITS2 sequence was used to establish a standard database ofH.cuspidatus，and eleven medicinal materials “H.cuspidatus” were authenticated by the identification system.Results：Only two medicinal materials were fromH.cuspidatus，one of them was fromHyssopusgenus，and one was fromSalviagenus，the other 7 samples were fromNepetagenus.Conclusion：ITS2 sequence can be used as an effective barcode to identify Uygur MedicineH.cuspidatusfrom its adulterants.

Hyssopuscuspidatus；ITS2；identification；DNA barcode

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高新技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目(201517107)

] 李曉瑾，研究員，研究方向：中藥資源；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.006

2017-02-28)

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