人參致病菌拮抗菌株的篩選及鑒定△

邵天蔚，丁萬(wàn)隆，李勇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·中藥農(nóng)業(yè)·

人參致病菌拮抗菌株的篩選及鑒定△

邵天蔚，丁萬(wàn)隆，李勇*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193)

目的：篩選對(duì)人參黑斑菌、人參銹腐菌等人參致病菌有較好抑菌活性的微生物菌株，為人參病害生防防治提供參考依據(jù)。方法：采用平板稀釋法從人參栽培土壤和菌劑產(chǎn)品中分離菌株；以人參致病菌為靶標(biāo)，采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗菌；分別采用16S rDNA和28S rDNA序列分析方法鑒定細(xì)菌和真菌菌株的分類學(xué)地位。結(jié)果：共計(jì)從人參栽培土壤中分離到66株菌，其中菌株X對(duì)人參致病菌表現(xiàn)較好抑菌活性；從商品化菌劑中分離出17株菌，其中菌株QM、BM2、HZ3、GG、HC和DD對(duì)人參致病菌表現(xiàn)較好抑菌活性。經(jīng)鑒定，菌株X為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，QM、BM2和HZ3為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)，GG為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，HC為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，DD為平展木霉(T.effusum)。結(jié)論：篩選出的7株拮抗菌對(duì)多種人參致病菌有較好抑菌活性，菌株X可用于生防菌劑開(kāi)發(fā)，與菌株QM、BM2、HZ3、GG、HC和DD對(duì)應(yīng)的商品化菌劑可用于人參病害防治。

人參；病害；拮抗菌；篩選；鑒定

人參PanaxginsengC.A.Mey.是五加科多年生宿根植物，我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。我國(guó)人參栽培面積居世界首位，吉林省長(zhǎng)白山區(qū)作為我國(guó)人參主產(chǎn)區(qū)，年人參產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)80%[1]，出口量占世界總量60%，在世界人參產(chǎn)業(yè)中具有舉足輕重的地位[2]。人參根部發(fā)病率平均約20%左右，重者高達(dá)70%以上，嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。土傳根病防治一直是人參生產(chǎn)中的難點(diǎn)問(wèn)題。目前，人參病害防治仍主要依賴化學(xué)殺菌劑，長(zhǎng)期使用不僅嚴(yán)重破壞自然生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致人參農(nóng)藥殘留超標(biāo)，也給人參用藥安全帶來(lái)重大安全隱患。

隨著人們對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留問(wèn)題的認(rèn)識(shí)日益深刻以及環(huán)保理念的逐漸深化，中藥材病害生物防治逐漸被愈來(lái)愈多的人所認(rèn)可[4-5]。針對(duì)中藥材病害，篩選高效、穩(wěn)定的生防菌株對(duì)中藥材病害防治具有重要意義。本研究以人參常見(jiàn)病害為靶標(biāo)，從人參根圍土和市售菌劑中篩選對(duì)人參致病菌具有較好抑菌活性的菌株，借助16S rDNA或28S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定，本研究結(jié)果對(duì)開(kāi)展菌株抑菌機(jī)理研究以及菌劑產(chǎn)品合理應(yīng)用等均具有很好的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株和土壤 人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans、人參黑斑菌Alternariapanax、人參根腐菌Fusariumsolani、人參灰霉菌Botrytiscinerea由本課題組保存。土壤樣品于2015年7月采自吉林省靖宇縣水庫(kù)屯試驗(yàn)地、板石參場(chǎng)、鎮(zhèn)郊參場(chǎng)和藥用植物研究所內(nèi)試驗(yàn)田的人參栽培土壤。商品化菌劑及其生產(chǎn)廠家如表1所示。

表1 微生物菌劑來(lái)源

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1000 mL，pH 7.0；NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水1000 mL、pH 7.4～7.6；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，瓊脂10～15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌株分離、純化與保存 采用梯度稀釋法分離土壤樣品中的微生物菌株。采回土樣編號(hào)分組，風(fēng)干后過(guò)20目篩，分別稱取10g置于三角瓶中，加入90mL無(wú)菌水及玻璃珠振蕩10～30min得到土壤樣品懸液。1mL懸濁液，加入9mL無(wú)菌水后40℃熱浴20min，得菌懸液。取1mL菌懸液體，梯度稀釋10-3、10-4、10-5，分別取100μL，均勻涂布在NA培養(yǎng)基表面，3次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)2～3d，挑取性狀差異明顯的單菌落進(jìn)行編號(hào)，劃線法純化培養(yǎng)，4℃保藏，備用。拮抗細(xì)菌分離采用LB培養(yǎng)基，35℃暗培養(yǎng)3～5d，拮抗木霉菌分離采用PDA培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)5～7d，分離得到的拮抗菌株純化后，4℃保存。

1.2.2抑菌活性篩選 以四種人參致病菌為靶標(biāo)，采用對(duì)峙培養(yǎng)法篩選拮抗菌株。將預(yù)先培養(yǎng)好的人參致病菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基中心，四周距平板邊緣1cm處對(duì)稱接種拮抗菌株，每種處理3～5次重復(fù)。28℃暗培養(yǎng)5～7d，觀察，記錄對(duì)照及處理組人參致病菌菌落直徑。

1.2.3抗菌株的鑒定 采用16SrDNA序列分析方法鑒定所得細(xì)菌菌株。取適量細(xì)菌至無(wú)菌水中，充分震蕩成細(xì)菌懸濁液，用引物fD1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和rP1(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA。擴(kuò)增體系25μL，包括：10×PCRBuffer(100mmol·L-1Tris，500mmol·L-1KCl，20mmol·L-1Mg2+，pH8.3)2.5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)1μL，引物各1μL，TaqDNA聚合酶(2.5U·μL-1)1μL，模板DNA(菌懸液)1μL，重蒸水補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。FungalDNAKit(OMEGA)用于真菌基因組提取，通用引物NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAG-3’)和NL-4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)用于真菌菌株28SrDNA序列擴(kuò)增。擴(kuò)增體系25μL，包括：2×PCRPremixTaqTM(Verdion2.0TakaRa)12.5μL，ddH2O5.5μL，DNA模板5μL，NL-1和NL-4各1μL。PCR程序：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火30s，72延伸1min，32次循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物送三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序，測(cè)得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，MEGA6.0軟件分析序列同源性，以Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap(1000次重復(fù))進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3數(shù)據(jù)分析

用Excel2010對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株分離、純化

共計(jì)從人參栽培土和菌劑產(chǎn)品中分離到83株菌。由人參栽培土壤分離到66株，從商品化菌劑中分離到17株(表2)。

2.2拮抗菌株篩選

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人參致病菌有抑菌活性的菌株共計(jì)13株。其中，對(duì)人參黑斑菌有抑菌作用的菌株13株，占拮抗菌總株數(shù)的100%；對(duì)人參銹腐菌有抑菌作用的菌株9株，占拮抗菌總株數(shù)的69.23%；對(duì)人參根腐菌有抑菌作用的菌株8株，占拮抗菌總株數(shù)的61.54%；對(duì)人參灰霉菌有抑菌作用的菌株7株，占拮抗菌總株數(shù)的53.85%(表3)。

表2 分離所得菌株編號(hào)與數(shù)目

在上述13株具有抑菌效果的微生物菌株中，QM、BM2、HZ3、GG、X、HC和DD對(duì)4種供試人參致病菌均有較好的抑菌活性(表4)。

2.3拮抗菌株鑒定

5株拮抗細(xì)菌同源性分析結(jié)果表明，菌株QM、BM2、HZ3與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus(KC790324，JF460743)的序列同源性最高(99%)，它們位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支上(圖1)，綜合同源性比對(duì)結(jié)果，QM、BM2、HZ3屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus。菌株GG與枯草芽孢桿菌B.subtilis(AB924083)的序列同源性達(dá)99%，二者位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支上(圖1)。綜合同源性比對(duì)結(jié)果，GG屬于枯草芽孢桿菌B.subtilis。菌株X與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(HQ003407)的同源性達(dá)99%，二者位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支上(圖1)。綜合同源性比對(duì)結(jié)果，X應(yīng)屬于解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens。

表3 分離菌株的抑菌活性

注：+.菌株對(duì)病原菌具有抑菌效果；-.菌株對(duì)病原菌無(wú)抑菌作用。

表4 7株分離菌對(duì)人參致病菌生長(zhǎng)的抑制情況

2株拮抗真菌同源性分析結(jié)果表明，菌株HC與棘孢木霉T.asperellum(KF723005)的序列同源性達(dá)99%，它們位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支上(圖2)。綜合同源性比對(duì)結(jié)果和HC與棘孢木霉在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌應(yīng)屬于棘孢木霉T.asperellum。菌株DD與平展木霉T.effusum(KC171306)序列同源性達(dá)99%，二者位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同一分支上(圖2)。綜合同源性比對(duì)結(jié)果和DD與平展木霉在發(fā)育系統(tǒng)中的位置，該菌應(yīng)屬于平展木霉T.effusum。

圖1 細(xì)菌菌株QM、GG、BM2、HZ3和X系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 真菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

芽孢桿菌屬是普遍用于防治植物病害的菌屬，具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫、易貯存、對(duì)人畜無(wú)毒害、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想的生防微生物資源[6]。研究表明，芽孢桿菌對(duì)人參銹腐菌和人參黑斑菌抑菌效果明顯且防治效果穩(wěn)定[7-8]。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌是2011年才被鑒定的新種[9]，劉利強(qiáng)等[10]利用該菌種防治黃瓜灰霉病?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的重要成員，在防治傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品病害的同時(shí)，也逐漸用于人參病害生物防治。胡陳云等[11]分離出的枯草芽孢桿菌分泌的抑菌脂肽能夠?qū)е氯藚⒑诎呔腿藚P腐菌菌絲體的形態(tài)異常和發(fā)育畸形；賈斌等[12]利用解淀粉芽孢桿菌拮抗人參黑斑病菌，抑菌率達(dá)到80%。本實(shí)驗(yàn)篩選出的5株拮抗細(xì)菌均為芽孢桿菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參病原菌與拮抗細(xì)菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)抑菌帶明顯，推測(cè)可能是拮抗細(xì)菌生成的次生代謝產(chǎn)物及幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶等降解酶類對(duì)病原菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用。

應(yīng)用于植物病害防治的生防真菌主要有木霉(Trichodermaspp.)、小盾殼霉(Conithyriumminitans)和鏈霉菌(Streptomycetaceae)等。據(jù)已有研究報(bào)道，木霉對(duì)人參銹腐菌等引發(fā)的人參根部病害有較好的防治效果[13]。丁萬(wàn)隆等[14]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌劑可顯著降低西洋參立枯病的發(fā)病率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參病原菌受到木霉菌抑制后有明顯的生長(zhǎng)停滯甚至萎縮現(xiàn)象，據(jù)已知木霉菌生防機(jī)制，推測(cè)可能是木霉菌生長(zhǎng)速度快，對(duì)病原菌形成營(yíng)養(yǎng)和空間的雙重競(jìng)爭(zhēng)，使病原菌因缺乏營(yíng)養(yǎng)和空間而萎縮；另外也可能是木霉對(duì)病菌菌絲得重寄生作用，導(dǎo)致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)篩選出的7株拮抗菌對(duì)四種人參致病菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，證明其在人參病害生物防治領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。后續(xù)將深入探索上述菌株對(duì)人參致病菌的抑菌作用機(jī)理，結(jié)合田間病害防效測(cè)定，為人參病害生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

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ScreeningandIdentificationofAntagonisticStrainsagainstPhytopathogensofPanaxginseng

SHAO Tianwei, DING Wanlong, LI Yong*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China)

Objective：To screen strains that having antagonistic activity againstCylindrocarpondestructans，Alternariapanaxetc.，providing references for biocontrol of soilborne diseases prevailing inP.ginseng.Methods：Strains were separated from ginseng-cultivating soils and commercial microbial agents by the plate dilution method.Confronting culture method was used to screen antagonistic strains against pathogens ofP.ginseng.Antagonistic agents were identified by 16S and 28S ribosomal DNA sequencing.Results：In total，66 stains were isolated from ginseng cultivating soil.Among them，strain X shown significant antagonistic activity against pathogens ofP.ginseng.Another 17 stains were isolated from commercial microbial pesticides，in which strains QM，BM2，HZ3，GG，HC and DD had antagonistic activity against pathogens ofP.ginseng.Homology results showed that，strain X was identified asB.amyloliquefaciens，QM，BM2 and HZ3 wasBacillusmethylotrophicus，GG wasB.subtilis，HC wasTrichodermaasperellumand DD wasT.effusum.Conclusion：Seven strains having antagonistic activity against pathogens ofP.ginsengwere identified.Strain X can be used to develop microbial pesticide，while commercial agents corresponding to QM，BM2，HZ3，GG，HC and DD can be used directly to control soil-borne diseases ofP.ginseng.

Panaxginseng；diseases；antagonists；screen；identification

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201407005)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程(2016-I2M-3-017)

] 李勇，研究員，研究方向：藥用植物病害生物防治技術(shù)研究；E-mail：liyong@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.020

2016-11-22)

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