• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    缺氧對細(xì)胞TH17在脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)機(jī)制的影響

    2017-09-20 06:21:46索南昂秀曹振宇祁騰民
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2017年24期
    關(guān)鍵詞:缺氧脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)

    索南昂秀+曹振宇+祁騰民

    [摘要] 目的 探討TH17細(xì)胞及細(xì)胞因子在缺氧環(huán)境下在脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)機(jī)制的影響。 方法 選擇2015年9月~2017年1月青海省人民醫(yī)院就診的脊柱結(jié)核病患者46例,依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查將其分為初發(fā)組(27例)和復(fù)發(fā)組(19例)。對患者TH17細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ進(jìn)行檢測,并對CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行檢測,觀察Th17細(xì)胞趨化指數(shù)變化及Th17細(xì)胞表達(dá)CCR受體及CCL配體的關(guān)系。 結(jié)果 與初發(fā)組比較,復(fù)發(fā)組患者的TH17細(xì)胞比例明顯升高(P < 0.05),細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量明顯上升(P < 0.01),IFN-γ含量下降(P < 0.01)。復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組(P < 0.01),免疫熒光染色及掃描定量分析發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的骨細(xì)胞中表達(dá)高于初發(fā)組(P < 0.01),細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果均相似。 結(jié)論 可將Th17細(xì)胞用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估??蓪L-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體作為缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)新的診斷標(biāo)志物,用于結(jié)核病復(fù)發(fā)的早期診斷。

    [關(guān)鍵詞] 缺氧;TH17;脊柱結(jié)核;復(fù)發(fā)

    [中圖分類號] R687.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2017)08(c)-0096-06

    [Abstract] Objective To discuss the effect of TH17 cells and cytokines on the recurrence of spinal tuberculosis was evaluated in hypoxic environment. Methods From September 2015 to January 2017, in Qinghai People's Hospital, 46 patients with spinal tuberculosis were selected, they were divided into primary group (27 cases) and recurrence group (19 cases) according to clinical manifestation and laboratory examination. TH17 cells and cytokines including IL-6, IL-1β, IL-23, TNF-α, IFN-γ in patients and the CCL20, CCL22, CCL27 were detected. The relationship of chemotactic index of Th17 cells and the Th17 expression of CCR receptor and CCL ligand were evaluated. Results Compared with primary group, the percentage of TH17 cells increased significantly of patients in recurrence group (P < 0.05), the content of cytokines including IL-6, IL-1, IL-23, TNF-α increased significantly (P < 0.01), the content of IFN-γ decreased (P < 0.01). The concentration of CCL20, CCL22 and CCL27 from recurrent group were significantly higher than primary group (P < 0.01), immunofluorescence staining and scanning quantitative analysis showed that the expression of CCL20, CCL22 and CCL27 in bone cells of patients in recurrent group were higher than in primary group (P < 0.01), cell morphology was similar with the the staining results of primary group. Conclusion Th17 cells can be used for the diagnosis of tuberculosis and tuberculosis recurrence, differentiation of tuberculosis courses and evaluation of immune function of patients. IL-6, IL-1β, IL-23, TNF-α, IFN-γ, CCL20, CCL22, CCL27, CCR receptors and CCL ligands can be used as a new diagnostic marker for the recurrence of spinal tuberculosis in hypoxia, and for the early diagnosis of tuberculosis recurrence.

    [Key words] Hypoxia; TH17; Spinaltuberculosis; Recurrenceendprint

    近些年來,結(jié)核病發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,且結(jié)核病情越來越趨于嚴(yán)重,該種疾病較為隱匿,一般嚴(yán)重時(shí)才被發(fā)現(xiàn),故致殘率高,若早期不能得到發(fā)現(xiàn)并接受及時(shí)的治療,將會對患者、家庭及社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。脊柱結(jié)核患者一般從肺部結(jié)核轉(zhuǎn)移發(fā)展而來,病情極為隱匿,該種疾病為結(jié)核性病變的最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式,發(fā)病率約為所有結(jié)核病總數(shù)的45%[1]。相關(guān)研究表明脊柱結(jié)核病的骨性組織及血液中存在Th17細(xì)胞,尤以在脊柱結(jié)核病的骨性組織中濃度較高[2]。脊柱結(jié)核病患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞的來源主要包括兩個(gè)途徑:①自身局部組織Th17細(xì)胞進(jìn)行分化增殖;②在CCL20-CCR受體、CCL22-CCR受體和CCL27-CCR受體趨化軸的作用下及成骨細(xì)胞的自身趨化作用下,將Th17細(xì)胞從患者血液中募集到達(dá)病骨組織中[3]。脊柱結(jié)核病的骨性組織及血液中的趨化因子受體及配體在炎癥因子的作用下表現(xiàn)為上調(diào),其中上調(diào)Th17的細(xì)胞因子為IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α,而下調(diào)抑制細(xì)胞Th17的因子為IFN-γ[3]。

    本項(xiàng)研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)觀察監(jiān)測在缺氧條件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ對Th17細(xì)胞的具體調(diào)節(jié)作用,以及CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體對脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的調(diào)節(jié)程度進(jìn)行研究監(jiān)測,以此探討在高原缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的原因與相關(guān)部分作用機(jī)制,從而為高海拔缺氧環(huán)境條件下的脊柱結(jié)核病的治療尋找以及提供基礎(chǔ)理論研究的基礎(chǔ),而且為該類疾病的復(fù)發(fā)提供科學(xué)的監(jiān)測指標(biāo)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選擇2015年9月~2017年1月青海省人民醫(yī)院就診的脊柱結(jié)核病患者46例,依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查將其分為初發(fā)組(27例)和復(fù)發(fā)組(19例)。初發(fā)組男14例,女13例,年齡25~72歲,平均(38.9±14.2)歲;復(fù)發(fā)組男10例,女9例,年齡30~68歲,平均(39.2±15.6)歲。兩組性別、年齡、淋巴細(xì)胞數(shù)等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05),具有可比性。所有患者入院后進(jìn)行的TSPOT.TB結(jié)果和TST結(jié)果均為陽性,診斷均參照中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制訂的結(jié)核診斷和治療指南中的標(biāo)準(zhǔn)。所有脊柱結(jié)核病的患者,同時(shí)可伴有肺部結(jié)核(非活動期)及其他部位結(jié)核。其中臨床診斷包括脊柱磁共振及CT影像學(xué)陽性,而患者肺部影像學(xué)檢查結(jié)果則提示可能為肺結(jié)核相關(guān)性病變,且完善γ-干擾素試驗(yàn)(+)、結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)、抗結(jié)核抗體檢查陽性,經(jīng)診斷性治療有效后可伴有輕度咳嗽咳痰等肺結(jié)核可疑癥狀的病例;其他結(jié)核確診病例包括患者痰液涂片抗酸染色檢查(±),而培養(yǎng)結(jié)核桿菌(+)及病變部位病理學(xué)診斷為結(jié)核桿菌病變的病例[4-6]。同時(shí)排除肝、腎功能嚴(yán)重障礙性疾病的患者,自身免疫性疾病患者,應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的患者。

    1.2 方法

    1.2.1 Th17細(xì)胞的檢測

    選取抗凝管(EDTA)對來自于高海拔地區(qū)缺氧條件下的脊柱結(jié)核病初發(fā)和復(fù)發(fā)的患者抽取靜脈血液6 mL,抽血時(shí)間均為該類患者住院并已經(jīng)確診后的次日清晨,確診條件為:①影像學(xué)資料及入院行結(jié)核菌素試驗(yàn)(+);②完善γ-干擾素試驗(yàn)(+)。抽取患者的血液樣本必須嚴(yán)格控制于室溫下保存,以及抽血當(dāng)天必須及時(shí)進(jìn)行檢測。

    1.2.1.1 樣本前處理 ①選用RPMI對已選取的250 μL全血標(biāo)本進(jìn)行1∶1等體積稀釋。②將稀釋液加入流式檢測的專用管中,并且依次加入:15 μL 1 μg/mL PMA工作液,10 μL 50 μg/mL Ionomycin工作液,6.6 μL 0.2 mg/mL Monensin工作液。將以上試驗(yàn)液進(jìn)行混勻,并放置于室溫條件下的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),時(shí)長5~7 h。③將以上試驗(yàn)液從培養(yǎng)箱中取出后再依次加入:CD3-PC5 抗體10 μL,CD45-ECD 抗體10 μL,CD4-FITC 抗體10 μL,在室溫條件下將以上試驗(yàn)液避光孵育約15~20 min。④再將每個(gè)試驗(yàn)管中分別加入固定液(120 μL Fix&Perm中的Reagent A),并在室溫條件下避光孵育約15~20 min。⑤再將每管中分別加入4 mL PBS,取1000 g放入離心機(jī)離心8 min,并棄除上清。⑥再將每管中分別加入固定液(120 μL Fix&Perm中的Reagent B),同時(shí)各管中再分別加入相應(yīng)的IL-17-PE,將以上試驗(yàn)液在室溫下避光孵育10 min。⑦再將每管中分別加入3 mL PBS,取1000 g放入離心機(jī)離心8 min,并予以棄除上清。⑧最后選取1.0 mL PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測。

    1.2.1.2 Th17 細(xì)胞上機(jī)檢測 ①選擇Navios操作菜單中的Th17細(xì)胞檢測程序;②以 CD45+CD3+的T淋巴細(xì)胞設(shè)置;③分析Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)的含量。

    1.2.2 IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的檢測

    ①選用枸櫞酸鈉抗凝管抽取高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境下的脊柱結(jié)核病初發(fā)和復(fù)發(fā)患者靜脈血液6mL,抽血時(shí)間均為該類患者住院后并已經(jīng)確診后的次日清晨,確診條件為:影像學(xué)資料及入院行結(jié)核菌素試驗(yàn)(+);完善γ-干擾素試驗(yàn)(+)。②抽取脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者靜脈血6 mL,取1000 g置于離心機(jī)進(jìn)行離心7 min后立即收集上清液250 μL,再將收集好的上清液進(jìn)行低溫凍存(-80℃)。③將待測樣本和鼠抗人IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ試劑盒恢復(fù)至室溫。④稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并分別設(shè)置復(fù)孔加樣,每個(gè)濃度3孔,共計(jì)15孔。并分別設(shè)置空白對照孔,待測樣本孔。⑤再于酶標(biāo)板上首先加入已經(jīng)稀釋的樣本液體40 μL,然后再加入15 μL樣本,并在恒溫水浴箱中封板孵育40 min,揭開封板膜并且棄去液體,甩干,再于每孔中加入已經(jīng)稀釋好的洗滌液并且靜置25 s后棄去。⑥再于每孔中分別加入IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ酶標(biāo)試劑液體40 μL(空白孔除外)。⑦再選用封板膜封板,并放置于恒溫水浴箱中,孵育時(shí)間約為25 min,仔細(xì)揭開封板膜并且拋去液體,甩干,再于每孔加入稀釋好的洗滌液并且靜置25 s后拋去。⑧再于每孔中分別加入40 μL的顯色劑A,再加入40 μL的顯色劑B,混勻后再留置于室溫條件下進(jìn)行避光顯色20 min。⑨再于每孔分別加入40 μL終止液予以終止反應(yīng),立即予以酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm波長測定吸光度(OD)值。⑩最后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品已知濃度擬合曲線換算出各樣本中IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的含量,所有檢測報(bào)告均以(ng/L)為單位[7]。endprint

    1.2.3 CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體的檢測分析

    采用ELISA的方法對CCL20、CCL22、CCL27在進(jìn)行了檢測;采用免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài)。

    具體方法:①提取缺氧條件下的脊柱結(jié)核初發(fā)患者和復(fù)發(fā)患者的病變部位骨組織;②從骨組織中分離提取出成骨細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng),3 d后取出并進(jìn)行初次漂洗固定;③再次漂洗后滴加血清液并進(jìn)行孵育,并分別滴加CCL20、CCL22、CCL27抗體并進(jìn)行過夜(溫度進(jìn)行控制);④再次漂洗,并滴加標(biāo)記的免疫熒光二抗進(jìn)行避光孵育,1 h后漂洗;⑤封片后置于激光共聚焦顯微鏡下,在波長488 nm的激發(fā)下進(jìn)行比較觀察;⑥使用Image-Pro plus軟件分別對初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的骨細(xì)胞CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行掃描測定。

    檢測脊柱結(jié)核患者初發(fā)組和復(fù)發(fā)組病骨細(xì)胞表面表達(dá)的CCR4細(xì)胞比例,以及分別加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后Th17細(xì)胞的趨化性表現(xiàn)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn)。通過 ROC 曲線評價(jià)各指標(biāo)用于區(qū)分結(jié)核病不同病程的診斷效益。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞的表達(dá)情況

    復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞的比例[(13.08±0.70)%]明顯高于初發(fā)組[(11.31±0.40)%)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。

    2.2 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ表達(dá)情況

    復(fù)發(fā)組IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表達(dá)明顯高于初發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05),而IFN-γ的表達(dá)低于初發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表1。這一變化趨勢和Th17細(xì)胞的變化趨勢相同,說明Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ在抗結(jié)核感染過程中的重要作用。

    2.3 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的表達(dá)情況

    復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表2。說明CCL20、CCL22、CCL27在缺氧狀態(tài)下對Th17細(xì)胞的趨化作用起到了重要的作用。

    2.4 免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài)

    免疫熒光染色結(jié)果:CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的成骨細(xì)胞中表達(dá)較初發(fā)組為高,細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果相似。經(jīng)免疫熒光染色鑒定,CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者骨組織中明顯多于初發(fā)組。見圖1(封三)。

    2.5 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的定量分析

    復(fù)發(fā)組骨細(xì)胞中CCL20、CCL22、CCL27的相對光密度值明顯高于初發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表3。

    2.6 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中Th17細(xì)胞趨化比例情況

    脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)組病骨細(xì)胞表面表達(dá)的CCR4細(xì)胞比例為(67.3±4.9)%,初發(fā)組為(52.6±5.5)%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。說明復(fù)發(fā)組患者骨細(xì)胞中的細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)顯著高于初發(fā)組。

    Th17細(xì)胞趨化指數(shù)變化:初發(fā)組分別加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后較復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞趨化性均減弱,細(xì)胞趨化指數(shù)均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表4。

    3 討論

    目前隨著全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域外科學(xué)技術(shù)和外科內(nèi)固定技術(shù)的不斷高速的發(fā)展,外科手術(shù)方案逐漸成為治療脊柱結(jié)核并患者的首選方法,這是近幾十年來在治療脊柱結(jié)核病方面的一大突破性進(jìn)展,常規(guī)條件下在對于此類患者進(jìn)行有效的抗結(jié)核藥物的治療基礎(chǔ)之上,尚可以采取對具備局部手術(shù)指征的脊柱結(jié)核病患者進(jìn)行及時(shí)而且有效的外科手術(shù)干預(yù)治療,從而達(dá)到徹底清除病灶組織、穩(wěn)定牢固的脊柱內(nèi)固定支持和充分的病變部位椎體植骨融合[9-10]。

    及時(shí)而有效的外科手術(shù)干預(yù)治療可良好控制脊柱結(jié)核病灶在病椎局部及軟組織的腐蝕擴(kuò)散,防止早期出現(xiàn)脊柱后突畸形,甚至防止早期出現(xiàn)癱瘓癥狀,以及對于已經(jīng)出現(xiàn)脊柱后突畸形的患者進(jìn)行脊柱矯正都具有積極的臨床意義,但手術(shù)干預(yù)治療結(jié)束后由于各種原因?qū)е录怪Y(jié)核病的復(fù)發(fā)而需要再次手術(shù)甚至多次手術(shù)的患者也在逐年增多[11]。

    青海省深處我國的內(nèi)陸,屬于青藏高原地區(qū),平均海拔在2500 m左右,大部分地區(qū)海拔更高,長期處于高原缺氧環(huán)境,這里因交通不便,相對閉塞,導(dǎo)致醫(yī)療資源匱乏,衛(wèi)生條件相對內(nèi)省較差,且該地區(qū)為多種族地區(qū),相互種族之間的語言溝通存在一定障礙,各族生活習(xí)慣相差較大等等,從而導(dǎo)致該地區(qū)的大部分疾病患者普遍缺乏醫(yī)療保健意識,時(shí)常延誤病情,早期不能發(fā)現(xiàn)及治療,導(dǎo)致肺結(jié)核病及脊柱結(jié)核病在發(fā)病的早期階段常常沒有得到足夠的重視,喪失了最佳的治療機(jī)會,大大增加了治療難度,而且術(shù)后該地區(qū)此類患者的營養(yǎng)條件普遍欠缺,生活衛(wèi)生環(huán)境較差,種種因素均導(dǎo)致脊柱結(jié)核病在術(shù)后復(fù)發(fā)較為常見,且手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)率呈逐漸上升趨勢。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[12-13]由于結(jié)核分支桿菌具備頑強(qiáng)的生命力以及具備復(fù)雜的免疫機(jī)制,極為隱匿,侵蝕范圍較廣,所以自其被人類研究發(fā)現(xiàn)至今一直未能得到及時(shí)而有效的控制,尤其是近十幾年來結(jié)核病蔓延至人體脊柱骨性組織的發(fā)病率有所抬頭上升,這就使得脊柱結(jié)核病在現(xiàn)階段呈現(xiàn)出死灰復(fù)燃的跡象[14-15]。已知人體免疫機(jī)制中的CD4+T細(xì)胞在抗結(jié)核感染細(xì)胞免疫中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[16-17],在人體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞因子協(xié)調(diào)作用下初始CD4+T細(xì)胞,使其分化為Th17細(xì)胞[18],并且分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子(如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體等),從而達(dá)到促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)[19]。endprint

    目前,關(guān)于在高原缺氧環(huán)境條件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ對人體內(nèi)的Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用甚為稀少,且關(guān)于CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體在脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的研究尚無研究報(bào)道。國內(nèi)外的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中類似于此類細(xì)胞的數(shù)量與功能存在著十分密切的關(guān)系,并且發(fā)揮著巨大的作用[20-21]。過去十幾年的國內(nèi)及國外相關(guān)人員研究發(fā)現(xiàn),脊柱結(jié)核病和正常未患病對照相比,細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量略為升高[22-23]。

    但本研究尚發(fā)現(xiàn)在高原缺氧環(huán)境條件下復(fù)發(fā)的脊柱結(jié)核感染患者體內(nèi)的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表達(dá)較初發(fā)組明顯增加,而細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)較初發(fā)組明顯降低,考慮這種現(xiàn)象可能與機(jī)體長期處于缺氧狀態(tài),以及結(jié)核分枝桿菌的不斷刺激,均導(dǎo)致了體內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞在原本正常的細(xì)胞增殖活化過程中受到明顯抑制,因此通過該項(xiàng)研究可以推測出IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ細(xì)胞可作為評估在缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核患者是否存在復(fù)發(fā)可能性的免疫功能指標(biāo)。此外,本研究尚監(jiān)測發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者及初發(fā)患者體內(nèi)含量存在明顯的差異性,可考慮將其作為缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的觀察指標(biāo)。最后,本項(xiàng)研究觀察缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中CCR4受體變化水平及在CCL配體作用下Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化,CCR4受體變化存在差異性,而Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化明顯,故也可考慮將CCR4受體及CCL配體作為判斷缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的輔助指標(biāo)。

    人體內(nèi)的Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23等通過研究發(fā)現(xiàn)可明顯提高宿主的抵抗能力[24],且這些細(xì)胞因子均在多種細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用[25]?,F(xiàn)階段的國內(nèi)及國外關(guān)于Th17細(xì)胞在脊柱結(jié)核病中的發(fā)揮作用的研究報(bào)道稀少[26],尚存在不少差異,且關(guān)于缺氧狀態(tài)下的報(bào)道尚無,有大部分學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的大量表達(dá)和脊柱結(jié)核病的嚴(yán)重程度呈正比例[27],也有小部分學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性脊柱結(jié)核患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞的表達(dá)受到明顯的抑制[28]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境條件下的復(fù)發(fā)性結(jié)核患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞及大多數(shù)細(xì)胞因子數(shù)量顯著高于初發(fā)性脊柱結(jié)核患者,而IFN-γ數(shù)量低于初發(fā)性脊柱結(jié)核患者。所以可以推測缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)性患者機(jī)體固有免疫被激活,同時(shí)分泌大量細(xì)胞因子刺激Th17細(xì)胞增殖進(jìn)而引起一系列免疫病理損傷,與此同時(shí)IFN-γ對于抑制Th17 細(xì)胞的作用在不斷減弱[28-30]。也有相關(guān)國外研究報(bào)道人體內(nèi)Th17細(xì)胞及分泌的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及IL-23并不一定參與了機(jī)體抗結(jié)核的免疫病理損傷[31],這可能與人體的免疫應(yīng)答能力存在一定關(guān)聯(lián),通過本項(xiàng)研究,我們可以發(fā)現(xiàn)在高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境條件下的人體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞與脊柱結(jié)核病從初發(fā)到復(fù)發(fā)的不同疾病進(jìn)展階段具有緊密的相關(guān)性,這就說明了人體T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力與脊柱結(jié)核病的復(fù)發(fā)具有直接作用[32]。

    本研究通過直接檢測缺氧環(huán)境條件下的脊柱結(jié)核病患者的外周血中Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體)的含量,反映出了機(jī)體的最直接最實(shí)際的免疫情況。此外,尚有一些研究人員通過結(jié)核特異性抗原刺激后外周血后再檢測,也可反應(yīng)機(jī)體免疫應(yīng)答狀況,但該方面的研究尚未明確結(jié)論,有待進(jìn)一步的研究探索。①通過流式細(xì)胞術(shù)對高原缺氧條件下脊柱結(jié)核感染不同病程時(shí)期患者外周血中Th17細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞在高原缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)量明顯高于初發(fā)患者(P < 0.05),提示可將Th17細(xì)胞用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估。②通過Luminex技術(shù)對結(jié)核免疫標(biāo)志物的檢測發(fā)現(xiàn)免疫標(biāo)志物IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α在缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)感染患者中的表達(dá)量明顯高于脊柱結(jié)核初發(fā)患者組(P < 0.05),而IFN-γ在缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)感染患者中的表達(dá)量低于脊柱結(jié)核初發(fā)患者組(P < 0.05),提示可將IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ均作為缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)新的診斷標(biāo)志物,用于高海拔地區(qū)脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的早期篩查及診斷。③通過ELISA方法對CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組(P < 0.05),從而證實(shí)了CCL20、CCL22、CCL27在缺氧狀態(tài)下對Th17細(xì)胞的趨化作用起到了重要的作用。故可考慮將CCL20、CCL22、CCL27作為缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的指標(biāo)。④通過免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的成骨細(xì)胞中表達(dá)較初發(fā)組為高,細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果相似,經(jīng)免疫熒光染色鑒定,CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者骨組織中明顯多于初發(fā)組。故可考慮將CCL20、CCL22、CCL27作為缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的指標(biāo)。⑤通過軟件測試明確了在復(fù)發(fā)組骨細(xì)胞中CCL20、CCL22、CCL27的相對光密度值明顯高于初發(fā)組。故提示可將CCL20、CCL22、CCL27用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估。⑥通過檢測缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中CCR4受體變化水平及在CCL配體作用下Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化,CCR4受體變化存在差異性,而Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化明顯,故也可考慮將CCR4受體及CCL配體作為判斷缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的輔助指標(biāo)。endprint

    綜上所述,人體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的不斷分化以及發(fā)育對于人體的免疫調(diào)節(jié)功能和防御能力的平衡具有相當(dāng)重要的意義,其中部分Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子(如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體等)均起到了促進(jìn)炎癥和加強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用,而小部分細(xì)胞因子對于Th17細(xì)胞的抑制作用也在減弱(如IFN-γ)。本研究通過對多種免疫標(biāo)志物的同時(shí)檢測,不僅有效提升了高海拔地區(qū)脊柱結(jié)核病初發(fā)及復(fù)發(fā)診斷的陽性率,同時(shí)將有助于判斷脊柱結(jié)核病患者在不同病程時(shí)期的真實(shí)免疫狀況,為臨床醫(yī)師對脊柱結(jié)核病的篩查診斷以及治療方案的調(diào)整加之患者免疫功能的評估提供了準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] 徐美霞,吳武中.百白破疫苗接種不良反應(yīng)原因分析與護(hù)理措施[J].中國醫(yī)藥指南,2011,9(36):434.

    [2] Dye C,Scheele S,Dolin P,et al. Consensus statement global burden of tuberculosis: estimated incidence,prevalence,and mortalityby country. WHO global surveillance and monitoring project [J]. JAMA,1999,282(7):677-686.

    [3] 吳啟秋,潘毓萱,畢志強(qiáng),等.骨與關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中耐多藥結(jié)核分枝桿菌對療效的影響[J].中華骨科雜志,2005, 25(7):431-433.

    [4] Kim SH,Song KH,Choi SJ,et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients [J]. Am J Med,2009,122(2):189-195.

    [5] 李嶠珂,吳雪瓊,陽幼榮,等.T SPOT-TB 試劑盒在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(17):3117-3119.

    [6] 張祥英.脊柱結(jié)核的外科治療進(jìn)展[J].中國矯形外科雜志,2004,12(13):1025-1027.

    [7] Sallusto F,Lanzavecchia A. Heterogeneity of CD4 memory T cells: functional modules for tailored immunity [J]. Eur Immunol,2009,39(8):2076-2082.

    [8] Gu G,Nars M,Hentunen T A,et al. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro [J]. Cell Tissue Res,2006,323(2):263-271.

    [9] Frost HM. Measurement of human bone formation by means of tetracycline labelling [J]. Can J Biochem Physiol,1963, 355(41):31-42.

    [10] 鄭啟新,潘海濤,郭曉東,等.一期前路病灶清除植骨內(nèi)固定治療胸腰椎結(jié)核的療效[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2008,31(2):99-102.

    [11] 周勁松,陳建庭,金大地,等.結(jié)核分支桿菌對材料粘附能力的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國脊柱脊髓雜志,2003,13(11):670-673.

    [12] 劉建文,宋應(yīng)超,李振武,等.肩胛下經(jīng)胸前路病灶清除減壓植骨內(nèi)固定治療上胸椎結(jié)核并截癱[J].中國脊柱脊髓雜志,2004,14(12):757-759.

    [13] Bonewald LF, Johnson ML. Osteocytes,mechanosensing and Wnt signaling [J]. Bone,2008,42(4):606-615.

    [14] Anonymous. Diagnostic standards and classi Cation of tuberculosis in adultsand children [J]. Am J Respir Crit Care Med,2000,161(4 Pt 1):1376-1395.

    [15] 谷守山,李永民,王旭,等.鈦網(wǎng)及同種異體骨植骨結(jié)合內(nèi)固定治療脊柱結(jié)核: 23 例隨訪驗(yàn)證[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(30):5662-5665.

    [16] 朱敏立,蔡伯薔.慢性阻塞性肺疾病急性加重與肺癌患者的終末期住院費(fèi)用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2009, 32(4):258-261.

    [17] 王長征.從慢性阻塞性肺疾病的自然病程看早期治療的重要性[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(7):557-558.

    [18] Chen X,Zhou B,LiM,et al. CD4+CD25+Fox P3+regulatory T cells suppress mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease [J]. Clin Immunol 2007,123(1):50-59.

    [19] Babu S,Bhat SQ,Kumar NP,et al. Regulatory Tcells modulate Th17 responses in patients with positive tuberculin skin testresults [J]. J Infect Dis,2010,201(1):20-31.endprint

    [20] Tuli SM. Tuberculosis ofthe spine:a historical review [J]. Clin Orthop Relat Res,2007,460(3):29-38.

    [21] 郝定均,郭華,許正偉,等.腰骶段脊柱結(jié)核的手術(shù)治療[J].中國脊柱脊髓雜志,2010,20(10):806-809.

    [22] 郭立新,馬遠(yuǎn)征,陳興,等.脊柱結(jié)核的外科治療與術(shù)后療效評估[J].中華骨科雜志,2008,28(12):979-982.

    [23] Canale ST.坎貝爾骨科手術(shù)學(xué)[M].10版.盧世璧,王繼芳,王巖,譯.濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社,2005:1959-1960.

    [24] 張衛(wèi)紅,吳啟秋,林羽,等.病灶清除術(shù)治療109例脊椎結(jié)核失敗原因分析[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1998,21(3):181-183.

    [25] Harari A,Rozot V,Bellutti Enders F,et al. Dominant TNF-α+Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+Tcell responses discriminate between latent infection and active disease [J]. Nat Med,2011,17(3):372-376.

    [26] Guven O,Kumano K,Yalcin S,et al. A single stage posterior approach and rigid fixation for preventing kyphosis in the treatment of spinal tuberculosis [J]. Spine(Phila Pa 1976),1994,19(9):1039-1043.

    [27] Khader SA,Bell GK,Pearl JE,et al. IL-23 and IL-17 in the establishment ofprotective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination andduring Mycobacterium tuberculosis challenge [J] Nat Immunol,2007,8(4):369-377.

    [28] Saenz de Tejada I,Anglin G,KnigIlt JR,et al. Efects of tadalafil Of erectile dysfunction in men with diabetes [J]. Diabetes Care,2002,25(12):2159-2164.

    [29] 劉慧梅,劉加彬,閆家徽,等.胸水γ干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016, 13(22):16-19.

    [30] 智日增,劉華生,張哲恩,等.結(jié)核性胸腔積液中干擾素γ、干擾素α及可溶性程序性死亡配體1的表達(dá)及臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2015,53(18):7-9,14.

    [31] Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, et al. Generation and regulation of human CD4+ IL-17-producing T cells in ovarian cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(40):15505-15510.

    [32] Li L,Wu CY. CD4+CD25+Treg cells inhibit human memory gamma delta T cells toproduce IFN-gamma in response to M tuberculosis antigen ESAT-6 [J]. Blood,2008,111(12):5629-5636.

    (收稿日期:2017-05-15 本文編輯:蘇 暢)endprint

    猜你喜歡
    缺氧脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)
    貧困山區(qū)教育“缺氧”現(xiàn)象原因淺析
    原花青素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)對H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用
    基于互聯(lián)網(wǎng)微信平臺的脊柱結(jié)核患者健康教育效果評價(jià)
    完整結(jié)腸系膜切除治療老年肥胖患者結(jié)腸癌的療效及復(fù)發(fā)情況觀察
    腫瘤標(biāo)志物CA199和CEA與大便潛血聯(lián)合檢測對腸癌復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值
    69例再發(fā)腦梗死患者臨床特點(diǎn)及危險(xiǎn)因素分析
    健康教育路徑在脊柱結(jié)核護(hù)理中的應(yīng)用及效果研究
    脊柱結(jié)核的CT及MRI影像診斷價(jià)值
    乳酸清除率對感染性休克患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值
    健康教育在預(yù)防尿路結(jié)石患者復(fù)發(fā)護(hù)理中的作用
    国产免费福利视频在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一区二区av电影网| 亚洲免费av在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 两人在一起打扑克的视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲五月婷婷丁香| 男人操女人黄网站| 国产伦人伦偷精品视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 大香蕉久久网| 考比视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 少妇的丰满在线观看| av视频免费观看在线观看| 欧美成人午夜精品| 欧美久久黑人一区二区| 精品少妇内射三级| svipshipincom国产片| 免费观看a级毛片全部| 国产一卡二卡三卡精品| 午夜免费观看性视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 国产亚洲精品久久久久5区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲视频免费观看视频| av国产久精品久网站免费入址| 欧美大码av| 成在线人永久免费视频| 看十八女毛片水多多多| 91精品三级在线观看| 成年动漫av网址| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲七黄色美女视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久人妻综合| 我要看黄色一级片免费的| svipshipincom国产片| 亚洲情色 制服丝袜| 伦理电影免费视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产色视频综合| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产成人影院久久av| 久久99一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费少妇av软件| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产综合久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线观看免费高清a一片| 搡老乐熟女国产| 欧美黄色淫秽网站| 99久久精品国产亚洲精品| 少妇的丰满在线观看| 免费看十八禁软件| 亚洲欧美精品自产自拍| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 免费高清在线观看日韩| 欧美人与善性xxx| 欧美黑人精品巨大| 亚洲视频免费观看视频| 看十八女毛片水多多多| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久国产精品麻豆| 色94色欧美一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美在线一区亚洲| 大型av网站在线播放| videosex国产| 精品视频人人做人人爽| 亚洲欧美一区二区三区国产| 老司机亚洲免费影院| 高潮久久久久久久久久久不卡| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品一国产av| 国产成人影院久久av| 国产精品国产三级专区第一集| 色网站视频免费| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲情色 制服丝袜| 国产97色在线日韩免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 91字幕亚洲| 欧美日韩精品网址| kizo精华| 丝袜喷水一区| 国产片特级美女逼逼视频| 国精品久久久久久国模美| 99九九在线精品视频| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久精品精品| 一边亲一边摸免费视频| 天天操日日干夜夜撸| 熟女av电影| 久热这里只有精品99| avwww免费| 亚洲,欧美精品.| 久热这里只有精品99| www.av在线官网国产| 看免费成人av毛片| 亚洲av电影在线进入| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 永久免费av网站大全| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 十八禁网站网址无遮挡| 色网站视频免费| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产成人av教育| 九草在线视频观看| 午夜福利在线免费观看网站| a级毛片在线看网站| av福利片在线| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久视频综合| 欧美精品av麻豆av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 9色porny在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 中国国产av一级| 亚洲 欧美一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 国产av国产精品国产| 欧美日韩av久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 好男人电影高清在线观看| 美女中出高潮动态图| 好男人视频免费观看在线| www.熟女人妻精品国产| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美乱码精品一区二区三区| 丝袜脚勾引网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 午夜免费成人在线视频| 两个人免费观看高清视频| 一区二区三区四区激情视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 99久久综合免费| 国产在视频线精品| 麻豆乱淫一区二区| 老司机深夜福利视频在线观看 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 一本久久精品| 国产精品一区二区在线不卡| 美国免费a级毛片| 精品福利观看| a级毛片黄视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黄色视频不卡| 黄色一级大片看看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 欧美激情极品国产一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 自线自在国产av| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产三级黄色录像| 麻豆av在线久日| 99热国产这里只有精品6| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品欧美一区二区三区在线| 两个人看的免费小视频| 久久ye,这里只有精品| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 午夜91福利影院| 搡老乐熟女国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 999精品在线视频| av线在线观看网站| 久久久欧美国产精品| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲视频免费观看视频| 成人免费观看视频高清| 国产在线视频一区二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲久久久国产精品| 免费在线观看完整版高清| 性高湖久久久久久久久免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品免费久久久久久久清纯 | 一本大道久久a久久精品| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久久人人人人人| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产看品久久| 国产欧美日韩一区二区三 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 悠悠久久av| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩一区二区三区影片| 天天影视国产精品| 赤兔流量卡办理| 两个人免费观看高清视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲国产看品久久| 亚洲精品一二三| 免费高清在线观看日韩| 亚洲一码二码三码区别大吗| 大香蕉久久成人网| 女人精品久久久久毛片| av国产精品久久久久影院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 一二三四社区在线视频社区8| 久久青草综合色| 丝袜脚勾引网站| 亚洲 国产 在线| a级片在线免费高清观看视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 成人手机av| av天堂久久9| 水蜜桃什么品种好| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人手机av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产av新网站| av天堂久久9| 一级黄色大片毛片| 日韩视频在线欧美| 成人亚洲欧美一区二区av| 操出白浆在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜福利视频精品| 亚洲欧美激情在线| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美日韩综合久久久久久| 精品国产一区二区久久| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲 国产 在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩大码丰满熟妇| 女警被强在线播放| 真人做人爱边吃奶动态| 老司机在亚洲福利影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩一级在线毛片| 看免费av毛片| www日本在线高清视频| 97在线人人人人妻| 久久天堂一区二区三区四区| 国产男女超爽视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 久久久精品94久久精品| 久久ye,这里只有精品| 9热在线视频观看99| 久久久精品区二区三区| 考比视频在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 国产麻豆69| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美久久黑人一区二区| 国产在视频线精品| 久久精品久久久久久久性| 亚洲视频免费观看视频| 免费看十八禁软件| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 曰老女人黄片| av线在线观看网站| 尾随美女入室| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av日韩在线播放| e午夜精品久久久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品免费大片| 男人舔女人的私密视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜影院在线不卡| 久久九九热精品免费| 亚洲 欧美一区二区三区| av欧美777| 久久这里只有精品19| 亚洲欧美一区二区三区国产| 波野结衣二区三区在线| 中文字幕最新亚洲高清| 精品一区二区三卡| 精品久久久久久电影网| 下体分泌物呈黄色| 色94色欧美一区二区| 久久ye,这里只有精品| 丁香六月天网| 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇 在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品人妻久久久影院| av线在线观看网站| 国产成人影院久久av| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黄片小视频在线播放| 中文字幕色久视频| 国产高清视频在线播放一区 | 日韩伦理黄色片| 久久久久网色| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久影院123| av在线老鸭窝| 免费观看a级毛片全部| 国产精品久久久久久精品电影小说| av有码第一页| 国产高清videossex| 在线观看人妻少妇| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国精品久久久久久国模美| av视频免费观看在线观看| 日韩av免费高清视频| 国产成人系列免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 在线观看人妻少妇| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩大片免费观看网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 十分钟在线观看高清视频www| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产亚洲精品久久久久5区| 看免费av毛片| 久热这里只有精品99| 操美女的视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久精品成人免费网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美xxⅹ黑人| 无限看片的www在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美大码av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品熟女少妇八av免费久了| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费在线观看完整版高清| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜福利视频精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 两个人看的免费小视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品人妻久久久影院| 91字幕亚洲| 婷婷色麻豆天堂久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 最近中文字幕2019免费版| 9色porny在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩黄片免| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品美女久久av网站| 男女边吃奶边做爰视频| 在线观看一区二区三区激情| 久久这里只有精品19| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 99国产精品一区二区三区| 视频区欧美日本亚洲| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一区福利在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 天天操日日干夜夜撸| 91九色精品人成在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| www.熟女人妻精品国产| 老熟女久久久| 免费观看人在逋| 久久99热这里只频精品6学生| 又黄又粗又硬又大视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成人影院久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲精品国产区一区二| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 曰老女人黄片| 黄频高清免费视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 午夜福利,免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| tube8黄色片| 色婷婷av一区二区三区视频| 黄色 视频免费看| 国产黄色免费在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 黄频高清免费视频| 亚洲国产最新在线播放| 视频区欧美日本亚洲| 久久精品久久精品一区二区三区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| svipshipincom国产片| 精品国产一区二区三区四区第35| av福利片在线| 秋霞在线观看毛片| 超色免费av| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品二区激情视频| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 大码成人一级视频| 精品亚洲成国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 一区福利在线观看| 性少妇av在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 视频区图区小说| 久久久久久人人人人人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产成人一精品久久久| 99精品久久久久人妻精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久99精品国语久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲国产欧美网| 久久久国产精品麻豆| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人免费观看视频高清| 91精品国产国语对白视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 女人精品久久久久毛片| 午夜免费成人在线视频| 一级毛片 在线播放| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 99热国产这里只有精品6| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇 在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 高清黄色对白视频在线免费看| av一本久久久久| 美女午夜性视频免费| 国产男女内射视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| h视频一区二区三区| 亚洲综合色网址| 在线观看人妻少妇| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美女中出高潮动态图| 免费av中文字幕在线| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产激情久久老熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美成人精品欧美一级黄| 大型av网站在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区| 一级片'在线观看视频| videos熟女内射| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 宅男免费午夜| 色播在线永久视频| 一级片免费观看大全| 99久久99久久久精品蜜桃| 岛国毛片在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产片内射在线| 人妻一区二区av| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 妹子高潮喷水视频| 男人操女人黄网站| 韩国精品一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美清纯卡通| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品国产av蜜桃| 午夜激情久久久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 一本大道久久a久久精品| 久久99精品国语久久久| 国产野战对白在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品九九99| 亚洲一区中文字幕在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美97在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费观看av网站的网址| 天堂俺去俺来也www色官网| 桃花免费在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 我要看黄色一级片免费的| 91国产中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 国产视频首页在线观看| av在线app专区| av一本久久久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品福利观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 午夜福利一区二区在线看| av在线播放精品| cao死你这个sao货| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品乱久久久久久| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| av福利片在线| 丁香六月天网| 国产亚洲欧美精品永久| 精品一品国产午夜福利视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久久国产电影| 免费在线观看黄色视频的| av线在线观看网站| 一区二区av电影网| 涩涩av久久男人的天堂| 国产97色在线日韩免费| 日韩视频在线欧美| 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲视频免费观看视频| 中国国产av一级| 99国产精品免费福利视频| 中文字幕av电影在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 人妻人人澡人人爽人人| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美激情 高清一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 电影成人av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品国产乱码久久久久久小说| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 人妻 亚洲 视频| 亚洲情色 制服丝袜| 看十八女毛片水多多多| 99国产精品一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久毛片免费看一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲 国产 在线| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 欧美日韩综合久久久久久| 午夜激情av网站| 美女主播在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产在线免费精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美成狂野欧美在线观看| av线在线观看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美人与善性xxx| 一区二区三区乱码不卡18| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产爽快片一区二区三区| 久久久国产一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 又黄又粗又硬又大视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 91字幕亚洲| 国产精品三级大全| 美女高潮到喷水免费观看| a级毛片黄视频| 观看av在线不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲专区国产一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩欧美一区视频在线观看|