超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白物化特性的影響

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(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642;3.寶健(中國(guó))有限公司,北京 100176)

超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白物化特性的影響

劉春花1,2,梁燕3,+,周愛(ài)梅1,2,*,肖蘇堯1,2,劉欣1,2,曹庸1,2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642;3.寶健(中國(guó))有限公司,北京 100176)

研究不同超高壓條件(100、300、500 MPa,保壓15、30、45 min)下鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白物化特性的改變。結(jié)果表明,隨著壓力和時(shí)間的增加,鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的溶解度降低,濁度基本呈上升的趨勢(shì),表明肌動(dòng)球蛋白發(fā)生了聚集變性。SDS-PAGE顯示超高壓引起肌動(dòng)球蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集形成了大分子物質(zhì)。超高壓處理后鳙魚(yú)的Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)活性消失,表明肌動(dòng)球蛋白發(fā)生了變性。隨著壓力的增加和加壓時(shí)間的延長(zhǎng),肌動(dòng)球蛋白的表面疏水性增加,表明超高壓使蛋白氨基酸的疏水性基團(tuán)暴露。隨著壓力的增大,肌動(dòng)球蛋白的總巰基含量減少,二硫鍵含量升高,表明肌動(dòng)球蛋白中的巰基發(fā)生氧化,形成了二硫鍵。鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白上述物化特性的改變證明超高壓誘導(dǎo)使其構(gòu)象發(fā)生了改變。

超高壓,鳙魚(yú),肌動(dòng)球蛋白,物化特性

鳙魚(yú)(Arstichthysnobilis)別名花鰱、胖頭魚(yú)、黑鰱,是我國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)中的“四大家魚(yú)”之一,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,其產(chǎn)量位于淡水魚(yú)產(chǎn)量的前列[1]。但由于鳙魚(yú)生長(zhǎng)在池塘或湖泊中,導(dǎo)致魚(yú)肉本身帶有很重的泥土味,口感差,如果僅鮮銷會(huì)造成附加值低,而且一直以來(lái)，消費(fèi)者有偏愛(ài)吃鳙魚(yú)頭的習(xí)慣,造成魚(yú)身部分價(jià)格大跌[2]。因此,如何對(duì)鳙魚(yú)進(jìn)行深加工以提高其商品價(jià)值是鳙魚(yú)加工產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題,而開(kāi)發(fā)魚(yú)糜制品成為解決這一問(wèn)題的重要途徑[3]。但鳙魚(yú)魚(yú)糜形成凝膠的能力差且易凝膠裂化[4],所以研究鳙魚(yú)魚(yú)糜的凝膠特性對(duì)實(shí)現(xiàn)其綜合利用有著重要意義。

高品質(zhì)魚(yú)糜制品應(yīng)該具有良好的質(zhì)構(gòu)特性、色澤和風(fēng)味,其中質(zhì)構(gòu)特性是最重要的[5]。魚(yú)糜制品的質(zhì)構(gòu)特性主要受魚(yú)肉蛋白質(zhì)凝膠性能的影響,而蛋白質(zhì)的凝膠性能又與其物化特性密切相關(guān)。魚(yú)的肌肉蛋白中,肌原纖維蛋白,特別是肌動(dòng)球蛋白是決定魚(yú)糜凝膠形成的主要因素[6]。熱處理是現(xiàn)在魚(yú)糜凝膠化的主要方法,然而,熱處理的凝膠特性卻不理想[7]。超高壓已被證實(shí)能夠引起蛋白質(zhì)分子中氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等非共價(jià)鍵和二硫鍵等共價(jià)鍵發(fā)生改變,從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、聚集或凝膠化,進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的質(zhì)構(gòu)特性和功能特性,達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)物理改性的作用[8]。很多研究表明,超高壓誘導(dǎo)的蛋白凝膠比熱誘導(dǎo)蛋白凝膠具有更好的透明度、平滑度、柔軟度和質(zhì)構(gòu)特性[9]。此外,超高壓誘導(dǎo)魚(yú)糜形成凝膠所需時(shí)間比熱誘導(dǎo)形成凝膠的時(shí)間短,同時(shí)可以減少熱敏性成分的損失以及不良風(fēng)味的產(chǎn)生[10]。關(guān)于超高壓對(duì)肌肉中肌原纖維蛋白或者肌動(dòng)球蛋白物化特性的影響，目前國(guó)內(nèi)外已有對(duì)鴨肉[11]、豬肉[12]、雞肉[13]以及水產(chǎn)品如羅非魚(yú)[5]、六齒金線魚(yú)[14]、草魚(yú)[15]、梅魚(yú)[3]、馬鮫魚(yú)[16]、三疣梭子蟹[17]、海鱸魚(yú)[18]、秘魯魷魚(yú)[19]、鯉魚(yú)[20]、沙丁魚(yú)和明太魚(yú)[21]等很多報(bào)道,其中研究比較多的是羅非魚(yú),而超高壓處理對(duì)鳙魚(yú)魚(yú)糜肌動(dòng)球蛋白的物化特性產(chǎn)生怎樣的影響,這些影響與蛋白質(zhì)凝膠形成的關(guān)系如何,目前未見(jiàn)系統(tǒng)的報(bào)道。因此,本研究從鳙魚(yú)魚(yú)肉中提取肌動(dòng)球蛋白,檢測(cè)超高壓(100～500 MPa處理15～45 min)誘導(dǎo)的肌動(dòng)球蛋白物化特性的改變,從而探究肌動(dòng)球蛋白物化特性的改變與蛋白質(zhì)凝膠特性的關(guān)系,為闡明超高壓的凝膠機(jī)理提供理論依據(jù),同時(shí)為超高壓在魚(yú)糜生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮鳙魚(yú) 廣州百佳連鎖超市;三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 廣州化學(xué)試劑廠;三羥基甲基氨基甲烷(Tris) 上海伯奧生物科技有限公司;考馬斯亮蘭R250 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;馬來(lái)酸 廣州化學(xué)試劑廠;5′-三磷酸腺苷(ATP)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)、脲素、β-巰基乙醇、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸,DTNB)、牛血清白蛋白(BSA) 均購(gòu)自Sigma公司;其他試劑 均為分析純。

FJ200-SH高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;Centrifuge 5810R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf;Nor 500磁力攪拌器 德國(guó)KIKAL labortechnik;UV-1800PC紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;FX-20DU超高壓設(shè)備 溫州貝諾機(jī)械有限公司;RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 島津制作所;HH-S8水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;PHS-25C精密pH計(jì) 上?？祪x儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的提取 參考Balange等[22]的方法并稍作改動(dòng)提取肌動(dòng)球蛋白。稱取一定量鳙魚(yú)肌肉,加入10倍體積冷卻的0.6 mol/L、pH7.0的KCl溶液,均質(zhì)4 min(均質(zhì)時(shí)將樣品放在含冰塊的泡沫盒中,每均質(zhì)20 s休息20 s,攪拌時(shí)間和間隔時(shí)間總共為4 min),然后在5000×g、4 ℃離心30 min,收集上清液并加入3倍的冷卻蒸餾水沉淀肌動(dòng)球蛋白,在5000×g、4 ℃離心20 min收集沉淀,然后加入約20 mL冷卻的0.6 mol/L、pH7.0 KCl,并于4 ℃下磁力攪拌30 min以溶解肌動(dòng)球蛋白,最后于5000×g、4 ℃離心30 min以除去未溶解的蛋白質(zhì),上清液即為肌動(dòng)球蛋白溶液。

1.2.2 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的超高壓處理 將肌動(dòng)球蛋白(4 mg/mL)灌入腸衣中,于100、300、500 MPa下分別保壓15、30、45 min,取出后迅速置于冰水中冷卻,獲得超高壓處理的樣品,進(jìn)行物化特性分析。

1.3測(cè)定方法

1.3.1 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白溶解度的測(cè)定 參考Riebroy等[23]的方法測(cè)定鹽溶性蛋白的含量。取5 mL肌動(dòng)球蛋白溶液在4 ℃下5000×g離心15 min,除去不溶物,用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。超高壓處理后的蛋白濃度與處理前的蛋白濃度的百分比為蛋白溶解度。

1.3.2 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白濁度的測(cè)定 肌動(dòng)球蛋白溶液的濁度根據(jù)Yarnpakdee等[24]的方法進(jìn)行測(cè)定。取超高壓處理后的肌動(dòng)球蛋白溶液(1 mg/mL),用紫外分光光度計(jì)測(cè)得的A660即為濁度。

1.3.3 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的SDS-PAGE分析 參考Benjakul等[25]的方法進(jìn)行肌動(dòng)球蛋白的SDS-PAGE分析。其中SDS-PAGE凝膠電泳的濃縮膠濃度為4%,分離膠濃度為10%,電泳分離后用Coomassie Blue R-250染色。

1.3.4 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性的測(cè)定 參考Riebroy等[23]的方法進(jìn)行Ca2+-ATPase活性的測(cè)定。將提取出來(lái)的蛋白溶液用0.6 mol/L、pH7.0的KCl稀釋至4 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液加入0.3 mL 0.5 mol/L、pH7.0 Tris-馬來(lái)酸溶液、0.5 mL 0.01 mol/L CaCl2溶液、3.45 mL蒸餾水和0.25 mL 20 mmol/L ATP溶液,在25 ℃反應(yīng)10 min后用2.5 mL 15%三氯乙酸阻斷反應(yīng)。反應(yīng)完后,反應(yīng)液在5000×g離心5 min得上清液,采用鉬酸銨法測(cè)定反應(yīng)中釋放出來(lái)的無(wú)機(jī)磷含量。Ca2+-ATPase活性表示為每毫克蛋白每分鐘分解ATP釋放的無(wú)機(jī)磷的微摩爾數(shù),單位為μmol(Pi)/min·mg Pro。

1.3.5 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白表面疏水性的測(cè)定 參考Hayakawa等[26]的方法測(cè)定表面疏水性。將提取出的肌動(dòng)球蛋白溶液以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0,含0.6 mol/L NaCl)稀釋成0、0.125、0.25、0.5和1 mg/mL系列濃度,取4 mL稀釋后的肌動(dòng)球蛋白溶液,在20 ℃水浴10 min,加入20 μL 8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽溶液(pH7.0),反應(yīng)完后在激發(fā)波長(zhǎng)374 nm、發(fā)射波長(zhǎng)485 nm的條件下,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度對(duì)肌動(dòng)球蛋白濃度作圖,并通過(guò)線性回歸求出其回歸方程,用回歸方程的斜率來(lái)表示鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的表面疏水性(S0ANS)。

1.3.6 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量的測(cè)定 參考Benjakul等[27]的方法進(jìn)行總巰基含量的測(cè)定。將肌動(dòng)球蛋白溶液用0.6 mol/L、pH7.0的KCl稀釋至4 mg/mL,取此溶液0.4 mL,加入3.6 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(含8 mol/L脲素,2% SDS和10 mmol/L EDTA,pH6.8),混勻后加入0.4 mL 0.1% DTNB溶液(用0.2 mol/L Tris-HCl配制,pH7.2)的,在40 ℃反應(yīng)25 min后用紫外分光光度計(jì)于412 nm測(cè)吸光度,用0.6 mol/L、pH7.0的KCl同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)。巰基含量以mol/105g蛋白質(zhì)計(jì),計(jì)算公式如下:

其中A412表示吸光值;ε表示摩爾消光系數(shù),這里取13600 L·mol-1·cm-1;c表示肌動(dòng)球蛋白的濃度,為4 mg/mL;D表示稀釋因子,其值為11。

1.3.7 鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白二硫鍵含量的測(cè)定 參考Yarnpakdee等[24]的方法測(cè)定二硫鍵含量。提取出的肌動(dòng)球蛋白溶液用0.6 mol/L、pH7.0的KCl溶液稀釋至1 mg/mL,取此溶液0.5 mL,加入3 mL pH9.5新配制的NTSB溶液(2-nitro-5-thiosulfobenzoate),混勻后在暗處于室溫(25～27 ℃)放置25 min,然后用紫外光柵分光光度計(jì)在412 nm測(cè)OD值。同時(shí)用蒸餾水做空白對(duì)照。二硫鍵含量以mol/105g蛋白質(zhì)計(jì),計(jì)算公式同總巰基含量,不同的是這里ε為13900 L·mol-1·cm-1,c為1 mg/mL,D為7。

1.3.8 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法 蛋白質(zhì)含量是以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白通過(guò)雙縮脲方法來(lái)測(cè)定,得到的蛋白質(zhì)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.051x+0.002(R2=0.999)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS Statistics 16.0.1軟件進(jìn)行方差分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白溶解度的影響

超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白溶解度的影響如圖1所示。由圖1可知,隨著壓力的增加和加壓時(shí)間的延長(zhǎng),鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的溶解度逐漸降低。相同壓力下,隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng),鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白溶解度呈降低的趨勢(shì),其中100 MPa時(shí)下降緩慢,變化不顯著(p>0.05),300、500 MPa時(shí)在加壓時(shí)間不超過(guò)30 min時(shí)顯著降低(p<0.05),之后緩慢降低(p>0.05),其中500 MPa、45 min時(shí)達(dá)到最小值87.41%。相同加壓時(shí)間,高壓處理后肌動(dòng)球蛋白的溶解度比低壓處理后的低,這與Ko等[28-29]和Hsu等[30]的研究結(jié)果相一致。

圖1 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultra-high pressure on the solubility of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis注:圖中不同的小寫字母表示同壓力不同時(shí)間有顯著性差異(p<0.05),不同大寫字母表示同時(shí)間不同壓力下有顯著性差異(p<0.05);圖2,圖4～圖7同。

蛋白溶解度大小的變化可以反應(yīng)單體肌原纖維蛋白向肌原纖維蛋白絲聚集的程度[31]。由結(jié)果可知,溶解度的降低表明鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白分子經(jīng)過(guò)100 MPa以上高壓處理,分子展開(kāi),疏水基團(tuán)暴露在外面,從而水合能力降低并且發(fā)生聚集,因此溶解性降低。此外,相同壓力下處理時(shí)間在30 min內(nèi),加壓時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)使肌動(dòng)球蛋白聚集程度增加,溶解性降低。

2.2超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白濁度的影響

超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白濁度的影響見(jiàn)圖2。由圖2分析,相同加壓時(shí)間,隨著壓力的增大,濁度顯著增加(p<0.05)。壓力為100 MPa時(shí)隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)濁度緩慢增大,但變化不顯著(p>0.05);300 MPa時(shí),隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)濁度先顯著增加(p<0.05)之后變化不大(p>0.05);500 MPa下隨著處理時(shí)間的增加也呈現(xiàn)先顯著增加(p<0.05)之后變化不大的趨勢(shì)(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與未處理的肌動(dòng)球蛋白相比,在適宜的超高壓壓力(≥300 MPa)下濁度可顯著增大,而加壓時(shí)間對(duì)其影響不明顯。濁度的增加則表明蛋白分子間相互作用形成了大分子聚集物,導(dǎo)致光散射增加,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理可使肌動(dòng)球蛋白發(fā)生聚集,這與Riebroy等[32]的研究結(jié)果一致,而且肌動(dòng)球蛋白在不同超高壓條件下處理后的濁度不同,這可能是因?yàn)椴煌邏簵l件下肌動(dòng)球蛋白的聚集敏感性不同造成的[14]。

圖2 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白濁度的影響Fig.2 Effect of ultra-high pressure on the turbidity of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis

2.3超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白SDS-PAGE圖譜的影響

鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白SDS-PAGE圖譜如圖3所示。由圖3可知,肌動(dòng)球蛋白SDS-PAGE圖譜中包含肌球蛋白重鏈(MHC)和肌動(dòng)蛋白(Actin)兩個(gè)主要條帶。各組間MHC條帶和Actin帶強(qiáng)度無(wú)明顯變化。但發(fā)現(xiàn)壓力≥300 MPa時(shí),有大分子(>200 kDa)物質(zhì)出現(xiàn),這是因?yàn)槌邏河欣诘鞍踪|(zhì)的聚集變性,形成大分子蛋白,由于大分子不能通過(guò)聚丙烯酸胺凝膠,因此沉積在膠的頂部,并隨著壓力的增大逐漸增多,說(shuō)明壓力越大,肌原纖維蛋白聚集程度越大,這與Hsu等[6]和Shoji等[33]的研究結(jié)果基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超高壓處理能較好地使肌動(dòng)球蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集形成大分子物質(zhì),此外Gilleland等[34]研究證明超高壓誘導(dǎo)的魚(yú)糜凝膠由二硫鍵等共價(jià)鍵的交聯(lián)作用實(shí)現(xiàn)。不同的魚(yú)種經(jīng)超高壓處理后MHC帶的變化也有所不同,馬海建[35]在對(duì)草魚(yú)魚(yú)糜肌動(dòng)球蛋白經(jīng)超高壓處理后,也發(fā)現(xiàn)MHC帶和Actin帶變化不大,與本研究結(jié)果一致,而陸海霞等[19]的研究表明,秘魯魷魚(yú)肌原纖維蛋白經(jīng)200 MPa及以上壓力處理15 min后其MHC帶消失,并認(rèn)為超高壓處理使Actin、MHC和副肌球蛋白按一定的比例聚集交聯(lián)形成凝膠。

圖3 超高壓處理下鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE pattern of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis subjected to high hydrostatic pressure注:0:Marker;1:100 MPa/15 min;2:100 MPa/30 min;3:100 MPa/45 min;4:300 MPa/15 min;5:300 MPa/30 min;6:300 MPa/45 min;7:500 MPa/15 min;8:500 MPa/30 min;9:500 MPa/45 min;10:對(duì)照組;MHC:肌球蛋白重鏈;Actin:肌動(dòng)蛋白。

2.4超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

不同處理壓力和時(shí)間對(duì)肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性的影響如圖4所示,由圖4可知,鳙魚(yú)魚(yú)糜肌動(dòng)球蛋白經(jīng)超高壓處理后,Ca2+-ATPase活性顯著降低(p<0.05)。對(duì)比各加壓樣品,相同加壓時(shí)間,壓力越大,Ca2+-ATPase活性下降越明顯(p<0.05),其中500 MPa時(shí),Ca2+-ATPase活性消失,表明肌動(dòng)球蛋白發(fā)生變性;相同壓力,加壓15 min時(shí),Ca2+-ATPase活性顯著下降(p<0.05),隨后延長(zhǎng)加壓時(shí)間對(duì)其下降趨勢(shì)作用不大(p>0.05)。100、300、500 MPa處理15 min時(shí)Ca2+-ATPase活性比新鮮未處理肌動(dòng)球蛋白下降了39.29%、71.43%、100%,處理30 min分別下降46.43%、75.00%、100%,處理45 min分別下降42.86%、75.00%、100%。以上結(jié)果說(shuō)明Ca2+-ATPase活性在高壓處理下較為敏感,易失活。

圖4 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4 Effect of ultra-high pressure on the Ca2+-ATPase activity of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis

Ca2+-ATPase活性是肌球蛋白或肌動(dòng)球蛋白分子完整程度的標(biāo)志[26]。其他研究者也有類似的報(bào)道。Ko等[36]研究發(fā)現(xiàn)虱目魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的Ca2+-ATPase活性在200 MPa處理10 min以上時(shí)降低(比新鮮的低20%),而且在300 MPa處理5 min活性喪失,表明肌動(dòng)球蛋白幾乎完全失活(變性)。Ko等[29]報(bào)道當(dāng)羅非魚(yú)肌球蛋白處以100 MPa以上壓力時(shí),Ca2+-ATPase活性急劇降低,在100、150和200 MPa保壓10 min,活性分別僅保留43%、35%和21%。Ishizaki等[37]報(bào)道指出肌肉組織中對(duì)壓力敏感的組分為肌球蛋白亞基-1(S-1),ATP酶的活性位點(diǎn)位于該區(qū)域。S-1在超高壓處理下展開(kāi)并暴露出疏水性基團(tuán),同時(shí)伴隨溶解度降低、α-螺旋含量減少。本研究的結(jié)果顯示在壓力釋放后,肌動(dòng)球蛋白構(gòu)象發(fā)生了不可逆的改變,導(dǎo)致其球狀頭部結(jié)構(gòu)中與Ca2+-ATPase活性相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變,進(jìn)而引起Ca2+-ATPase活性的降低甚至消失。

2.5超高壓對(duì)肌動(dòng)球蛋白表面疏水性的影響

鳙魚(yú)魚(yú)糜肌動(dòng)球蛋白經(jīng)過(guò)超高壓處理后,其表面疏水性的變化結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可知,新鮮的鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白經(jīng)超高壓處理后,其表面疏水性顯著增加(p<0.05)。相同加壓時(shí)間條件下,隨壓力值的增大其表面疏水性增加,100～300 MPa時(shí)有顯著增加(p<0.05),300、500 MPa處理之間變化不明顯(p>0.05)。在一定的壓力作用下,保壓時(shí)間的延長(zhǎng)有助于表面疏水性的增大,特別是加壓15 min時(shí)上升趨勢(shì)顯著(p<0.05),繼續(xù)增加加壓時(shí)間對(duì)其影響不大(p>0.05)。100、300、500 MPa處理15 min時(shí)表面疏水性比未處理時(shí)依次增加了約0.56、0.93、0.96倍,處理30 min后依次增加約0.53、1.04、1.11倍,處理45 min后依次增加約0.57、1.07、1.11倍。Ko等[29]對(duì)羅非魚(yú)肌動(dòng)球蛋白超高壓處理后研究表面疏水性得到類似的結(jié)論,指出高壓使表面疏水性增加,是因?yàn)閴毫φT導(dǎo)氨基酸殘基暴露在分子表面。Ishizaki等[37]指出,壓力對(duì)疏水作用的影響可能主要是由于水化壓縮性之間的差量導(dǎo)致蛋白分子的展開(kāi)。疏水區(qū)域的暴露是大的肌球蛋白聚集體形成的先決條件。超高壓處理中蛋白分子間疏水作用的形成可能是魚(yú)糜凝膠形成的機(jī)理之一。本研究也說(shuō)明超高壓凝膠形成與蛋白分子內(nèi)的疏水相互作用有關(guān),新鮮的鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的疏水性氨基酸一般位于蛋白分子內(nèi)部,其表面疏水性較低,經(jīng)過(guò)超高壓作用后,其表面疏水性明顯升高。

圖5 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of ultra-high pressure on the surface hydrophobicity of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis

2.6超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量的影響

超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量的影響由圖6所示。由結(jié)果可知,與未處理組相比,經(jīng)超高壓處理的鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量顯著降低(p<0.05)。相同加壓時(shí)間時(shí),隨壓力的不斷增大,肌動(dòng)球蛋白總巰基含量顯著下降(p<0.05)。相同壓力條件下,對(duì)比不同加壓時(shí)間的巰基含量可以發(fā)現(xiàn),15 min處理時(shí),總巰基含量顯著下降(p<0.05),延長(zhǎng)作用時(shí)間其數(shù)值差別不大(p>0.05)。壓力500 MPa處理45 min時(shí),樣品的總巰基含量達(dá)到最小值6.582 mol/105g蛋白質(zhì)。100、300、500 MPa處理15 min,總巰基含量比未處理肌動(dòng)球蛋白分別下降了17.74%、23.54%、36.72%,處理30 min后分別下降20.49%、23.20%、37.92%,處理45 min后分別下降18.69%、24.52%、40.13%。Hsu等[30]指出當(dāng)壓力高于200 MPa時(shí),羅非魚(yú)肌動(dòng)球蛋白的總巰基含量隨壓力的增大而降低,且?guī)€基含量的降低可能與巰基的氧化、二硫鍵的形成或氫鍵和疏水作用的形成有關(guān),由此推斷本研究中在超高壓處理下,鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量的下降與分子內(nèi)、分子間巰基的暴露氧化,二硫鍵的形成有關(guān),且壓力越大,加壓時(shí)間越長(zhǎng),下降越明顯。

圖6 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量的影響Fig.6 Effect of ultra-high pressure on the total sulfhydryl content of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis

2.7超高壓對(duì)肌動(dòng)球蛋白二硫鍵含量的影響

由圖7可知,相同加壓時(shí)間,隨著壓力的增大,肌動(dòng)球蛋白二硫鍵含量呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。加壓100 MPa時(shí),隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng),二硫鍵含量呈先顯著降低而后明顯增加(p<0.05)的趨勢(shì),這可能是因?yàn)?5 min內(nèi)的短時(shí)間低壓處理不足以使氨基酸側(cè)鏈暴露較多的巰基,因而氧化形成二硫鍵的巰基含量少,二硫鍵生成量低,而此時(shí)肌動(dòng)球蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞,可能造成分子內(nèi)部的二硫鍵含量下降,巰基氧化形成二硫鍵的速度低于分子內(nèi)部二硫鍵下降的速度[14],因此表現(xiàn)為100 MPa下15 min內(nèi)的處理使二硫鍵含量下降,而加壓時(shí)間的延長(zhǎng)則有利于巰基的氧化,所以導(dǎo)致二硫鍵含量在加壓時(shí)間15 min后開(kāi)始上升。300 MPa處理時(shí),二硫鍵含量較100 MPa處理組有顯著增加(p<0.05),且加壓時(shí)間對(duì)其影響不大(p>0.05),加壓15 min時(shí)二硫鍵含量最大。當(dāng)壓力增至500 MPa時(shí),二硫鍵含量隨加壓時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少。本研究結(jié)果表明較高的壓力和長(zhǎng)時(shí)間的加壓導(dǎo)致二硫鍵斷裂,不利于二硫鍵的生成。Stone等[38]指出二硫鍵的形成雖不是形成凝膠的必需條件,但分子間二硫鍵的形成,尤其是由肌球蛋白頭部S-1部位氧化形成的二硫鍵,對(duì)凝膠的形成有重要貢獻(xiàn)。Damodaran等[39]指出二硫鍵含量的增加有助于延長(zhǎng)多肽鏈的長(zhǎng)度,有效多肽鏈長(zhǎng)度的增加有利于凝膠結(jié)構(gòu)的相互間纏繞,且相互交聯(lián)的蛋白鏈越長(zhǎng),凝膠性能越強(qiáng)。因此二硫鍵的形成有利于肌動(dòng)球蛋白凝膠化,所以要控制適宜的壓力和加壓時(shí)間以促進(jìn)二硫鍵的形成。

圖7 超高壓對(duì)鳙魚(yú)肌動(dòng)球蛋白二硫鍵含量的影響Fig.7 Effect of ultra-high pressure on the disulfide bond content of natural actomyosin extracted from muscle of Arstichthys nobilis

3 結(jié)論

研究表明100～500 MPa的高壓可誘導(dǎo)鳙魚(yú)肌肉肌動(dòng)球蛋白分子構(gòu)象的改變,從而導(dǎo)致其物化特性的改變,表現(xiàn)在濁度、表面疏水性和二硫鍵含量的增加,以及蛋白溶解度和總巰基含量的降低,肌動(dòng)球蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集形成大分子物質(zhì),Ca2+-ATPase活性的降低乃至喪失。因此,100 MPa以上壓力誘導(dǎo)的鳙魚(yú)肌肉肌動(dòng)球蛋白的變性和聚集,將有助于魚(yú)糜凝膠的形成,疏水相互作用和二硫鍵可能會(huì)發(fā)揮主導(dǎo)作用。本研究的結(jié)論為以后進(jìn)一步深入探討超高壓促凝膠的機(jī)理提供一定的理論參考,進(jìn)一步的工作將研究肌動(dòng)球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在高壓處理下的變化。

[1]雒莎莎,童彥,Jahangir Muhammad Muzammil,等. 超高壓處理對(duì)鳙魚(yú)質(zhì)構(gòu)特性的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(5):182-187.

[2]袁曉晴,孫耀軍,劉紅梅. 酶解鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白制備ACE抑制肽工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(20):213-216.

[3]胡飛華.梅魚(yú)魚(yú)糜超高壓凝膠化工藝及凝膠機(jī)理的研究[D]. 杭州:浙江工商大學(xué),2010.

[4]Benjakul S,Chantarasuwan C,Visessanguan W. Effect of medium temperature setting on gelling characteristics of surimi from some tropical fish[J]. Food Chemistry,2003,82(4):567-574.

[5]郭寶顏,梁燕,周愛(ài)梅,等. 超高壓對(duì)羅非魚(yú)肌動(dòng)球蛋白物化特性的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015(6):259-263.

[6]Hsu K,Jyh-Sheng H,Yu C,et al. Changes in conformation and in sulfhydryl groups of actomyosin of tilapia(Orechromisniloticus)on hydrostatic pressure treatment[J]. Food Chemistry,2007,103(2):560-564.

[7]Cao Y,Cheng Y D,Wang X C,et al. Effects of heating methods on gel-forming ability of silver carp(Hypophthalmichthysmolitrix)surimi[J]. Journal of Shanghai Fisheries University,2003,12(S1):107-112.

[8]Chung Y C,Gebrehiwot A,Farkas D F,et al. Gelation of Surimi by High Hydrostatic Pressure[J]. Journal of Food Science,1994,59(3):523-524,543.

[9]梁燕,周愛(ài)梅,郭寶顏,等. 超高壓對(duì)草魚(yú)魚(yú)糜凝膠特性的影響及其機(jī)理初探[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(1):86-90,96.

[10]周愛(ài)梅,林麗英,梁燕,等. 超高壓誘導(dǎo)魚(yú)糜凝膠性能的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013(9):2058-2062.

[11]李亞楠.鴨肉中肌原纖維蛋白的提取及凝膠特性的研究[D]. 天津:天津商業(yè)大學(xué),2012.

[12]Huang Y,Guo L,Xiong S,et al. Property and structure changes of myofibril protein in pork treated by high pressure combined with heat[J]. Food Science and Technology International,2016,22(7):647-662.

[13]Iwasaki T,Yamamoto K. Effect of high hydrostatic pressure on chicken myosin subfragment-1[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2002,30(5):227-232.

[14]Zhou A,Lin L,Liang Y,et al. Physicochemical properties of natural actomyosin from threadfin bream(Nemipterusspp.)induced by high hydrostatic pressure[J]. Food Chemistry,2014,156:402-407.

[15]閆春子.超高壓處理對(duì)淡水魚(yú)冷藏保鮮效果的影響[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2016.

[16]羅曉玲.馬鮫魚(yú)魚(yú)糜超高壓凝膠化工藝研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2010.

[17]周果,楊文鴿,崔燕,等. 超高壓處理對(duì)三疣梭子蟹感官及其肌原纖維蛋白生化特性的影響[J]. 食品科學(xué),2017:1-8.

[18]鄭捷,尚校蘭,劉安軍. 超高壓處理對(duì)海鱸魚(yú)魚(yú)肉凝膠形成作用[J]. 食品科學(xué),2013,34(19):88-92.

[19]陸海霞.秘魯魷魚(yú)肌原纖維蛋白質(zhì)凝膠特性的研究[D]. 杭州:浙江工商大學(xué),2009.

[20]Qiu C,Xia W,Jiang Q. Pressure-induced changes of silver carp(Hypophthalmichthys molitrix)myofibrillar protein structure[J]. European Food Research and Technology,2014,238(5):753-761.

[21]Ko W C,Tanaka M,Nagashima Y,et al. Effect of Pressure Treatment on Actomyosin ATPases from Flying Fish and Sardine Muscles[J]. Journal of Food Science,1991,56(2):338-340.

[22]Balange A K,Benjakul S,Maqsood S. Gel Strengthening Effect of Wood Extract on Surimi Produced from Mackerel Stored in Ice[J]. Journal of Food Science,2009,74(8):C619-C627.

[23]Riebroy S,Benjakul S S B P,Visessanguan W,et al. Acid-induced gelation of natural actomyosin from Atlantic cod(Gadusmorhua)and burbot(Lotalota)[J]. Food Hydrocolloids,2009,23(1):26-39.

[24]Yarnpakdee S,Benjakul S S B P,Visessanguan W,et al. Thermal properties and heat-induced aggregation of natural actomyosin extracted from goatfish(Mulloidichthysmartinicus)muscle as influenced by iced storage[J]. Food Hydrocolloids,2009,23(7):1779-1784.

[25]Benjakul S,Visessanguan W,Chantarasuwan C. Effect of porcine plasma protein and setting on gel properties of surimi produced from fish caught in Thailand[J]. Food Science and Technology,2004,37(2):177.

[26]Hayakawa S N S. Relationships of Hydrophobicity and Net Charge to the Solubility of Milk and Soy Proteins[J]. Journal of Food Science,1985,50(2):486-491.

[27]Benjakul S,Seymour T A,Morrissey M T,et al. Physicochemical changes in Pacific whiting muscle proteins during iced storage[J]. Journal of Food Science,1997,62(4):729-733.

[28]Ko W C,Hwang J S,Jao C L,et al. Denaturation of tilapia myosin fragments by high hydrostatic pressure[J]. Journal of Food Science,2004,69(8):C604-C607.

[29]Ko W C,Jao C L,Hsu K C. Effect of hydrostatic pressure on molecular conformation of tilapia(Orechromisniloticus)myosin[J].Journal of Food Science,2003,68(4):1192-1195.

[30]Hsu K,Ko W. Effect of Hydrostatic Pressure on Aggregation and Viscoelastic Properties of Tilapia(Orechromisniloticus)Myosin[J]. Journal of Food Science,2001,66(8):1158-1162.

[31]Kunihiko S,Shigeo H,Katsuhiro Y,et al. Physicochemical properties and heat-induced gelling of cardiac myosin in model system[J]. Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,1985,49(10):2975-2983.

[32]Riebroy S,Benjakul S S B P,Visessanguan W,et al. Comparative study on acid-induced gelation of myosin from Atlantic cod(Gardusmorhua)and burbot(Lotalota)[J]. Food Chemistry,2008,109(1):42-53.

[33]Shoji T,Saeki H,Wakameda A,et al. Gelation of salted paste of Alaska pollack by high hydrostatic pressure and change in myofibrillar protein in it[J]. Nippon Suisan Gakkaishi,1990,56(12):2069-2076.

[34]Gilleland G M,Lanier T C,Hamann D D. Covalent bonding in pressure induced fish protein gels[J]. Journal of Food Science,1997,62(4):713-716,733.

[35]馬海建.超高壓處理對(duì)草魚(yú)魚(yú)肉和魚(yú)糜制品品質(zhì)的影響[D]. 上海:上海海洋大學(xué),2016.

[36]Ko W C. Effect of high pressure on gelation of meat paste and inactivation of actomyosin Ca-ATPase prepared from milkfish[J].Fisheries Science,1996,62(1):101-104.

[37]Ishizaki S,Tanaka M,Takai R,et al. Stability of fish myosins and their fragments to high hydrostatic pressure[J]. Fisheries Science,1995,61(6):989-992.

[38]Stone A P,Stanley D W. Mechanisms of fish muscle gelation[J]. Food Research International,1992,25(5):381-388.

[39]Damodaran S.Interrelationship of molecular and functional properties of food proteins[C]. In:Kinsella JE,Soucie WG(eds)Food proteins. AOCS,Champaign,IL,1989:21-51.

Effectofultra-highpressureonthephysicochemicalpropertiesofactomyosinfrombigheadcrap(Arstichthysnobilis)

LIUChun-hua1,2,LIANGYan3,+,ZHOUAi-mei1,2,*,XIAOSu-yao1,2,LIUXin1,2,CAOYong1,2

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou 510642,China;3.Pro-Health(China)Co.,Ltd.,Beijing 100176,China)

Changes of physicochemical properties in natural actomyosin fromArstichthysnobilisinduced by ultra-high hydrostatic pressure(100,300,500 MPa for 15,30,45 min)were investigated. The results revealed that the solubility of actomyosin decreased while the turbidity increased with the increase of pressure and time,indicating the accumulation of protein aggregates and denaturation. SDS-PAGE showed that ultra-high pressure induced the cross-linking and accumulation of actomyosin to form macromolecular substances. Ca2+-ATPase activity of actomyosin treated by ultra-high pressure was lost,suggesting the denaturation of actomyosin. Surface hydrophobicity of actomyosin increased when the pressure and pressurization time increased,indicating that the exposed hydrophobic residues increased upon application of high pressure. The total sulfhydryl content of actomyosin decreased while the disulfide bond content increased with the increase of pressure,which confirmed that the sulfhydryl group of actomyosin underwent oxidation to form disulfide bonds. These variations in the physicochemical properties demonstrate that the conformation of actomyosin extracted fromArstichthysnobilischanges after ultra-high pressure processing.

ultra-high pressure;Arstichthysnobilis;actomyosin;physicochemical properties

2017-02-23 +并列第一作者

劉春花(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：liuch0805@126.com。 梁燕(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：liangyanxy@126.com。

*通訊作者:周愛(ài)梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品及農(nóng)產(chǎn)品深加工，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101311)。

TS254.1

:A

:1002-0306(2017)16-0029-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.007