山楂葉超高效液相色譜指紋圖譜及聚類分析研究*

楊明宇，李明臣，徐寶欣，高 婧，李艷榮，潘海峰△

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省灤平縣中醫(yī)院）

山楂葉超高效液相色譜指紋圖譜及聚類分析研究*

楊明宇1，李明臣2，徐寶欣1，高 婧1，李艷榮1，潘海峰1△

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.河北省灤平縣中醫(yī)院）

目的:采用超高效液相色譜法（UPLC）結(jié)合相似度計算和聚類分析建立山楂葉指紋圖譜共有模式，為山楂葉的質(zhì)量評價提供參考。方法：采用Waters CORTECS UPLC C18色譜柱（3.0mm×100mm，1.6μm），以乙腈-0.1%甲酸水為流動相，梯度洗脫，流速0.2ml/min，檢測波長320nm，柱溫30℃，進樣量3μl。對14批山楂葉進行檢測，運用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》建立山楂葉UPLC指紋圖譜并進行相似度計算和聚類分析。結(jié)果：通過聚類分析將14批山楂葉分為Ⅰ、Ⅱ兩類，選取第Ⅰ類樣品建立山楂葉UPLC指紋圖譜共有模式。結(jié)論：本研究建立的方法可為山楂葉的質(zhì)量控制提供參考。

山楂葉；超高相液相色譜指紋圖譜；聚類分析；共有模式

1 儀器與試藥

Waters AcquityTM超高相液相色譜儀；HC-2062高速離心機；KQ-700型超聲波清洗器；AG-245型十萬分之一電子分析天平。

綠原酸（120416）、牡荊素葡萄糖苷（151103）、牡荊素鼠李糖苷（151024），上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；牡荊素（111687-200602）、金絲桃苷（111521-200303），中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈，色譜純；實驗用水，哇哈哈純凈水；其它試劑為分析純。

山楂葉，由承德民族師范學(xué)院董建新教授鑒定為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉。藥材來源：河北省S1，S2，S3，S4，S6，S7，S11，S12，S14；河南省S5；四川省S8；山東省S9；山西省S10；浙江省S13。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18（3.0mm×100mm，1.6μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫：T：0-4-7-14-16-25-28-30min，A：12%-12%-17%-17%-25%-40%-80%-80%；檢測波長320nm，流速0.2ml/min，柱溫30℃，進樣量：3μl。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、牡荊素葡萄糖、牡荊素鼠李糖、牡荊素、金絲桃苷對照品適量，用甲醇溶解，制成每1ml含綠原酸0.033mg、牡荊素葡萄糖苷0.097mg、牡荊素鼠李糖苷0.196mg、牡荊素0.020mg、金絲桃苷0.038mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定山楂葉藥材粉末（過60目篩）0.5g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇溶液25ml，稱重，超聲（700W，40kHz）提取30min，取出室溫放置后再稱重，用60%甲醇溶液補足損失的量，搖勻，提取液于12000r/min離心10min，0.20μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗：取同一藥材（S6）供試品溶液，連續(xù)進樣5次，按2.1的色譜條件進樣測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD＜3%，說明該方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗：取同一藥材（S6）平行制備6份供試品溶液，分別按2.1的色譜條件進樣測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD＜3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗：取同一藥材（S6）供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h按2.1的色譜條件進樣測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD＜3%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 樣品測定：制備14批山楂葉的供試品溶液，按2.1的色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。根據(jù)指紋圖譜檢測結(jié)果，選擇峰面積較大、峰形較好的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定16個共有峰。經(jīng)與混合對照品指紋圖譜的保留時間和紫外吸收曲線比，確認了綠原酸、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷。

2.4.5 聚類分析：本研究以16個共有峰峰面積為變量，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，對14批山楂葉進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖1：當(dāng)類間距離在5-10時，14批山楂葉被分為兩類，S14為第Ⅱ類，其余為第Ⅰ類；結(jié)合相似度評價結(jié)果，選取第Ⅰ類作為建立共有模式的樣品。

圖1 14批山楂葉聚類分析樹狀圖

2.4.6 山楂葉指紋圖譜共有模式的建立：通過相似度評價、聚類分析，從14批山楂葉樣品中篩選出13批化學(xué)成分和成分含量相對穩(wěn)定的樣品，將13批樣品色譜圖的AIA文件導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，建立山楂葉指紋圖譜共有模式（圖2），并進行相似度評價，相似度均＞0.870。提示，所建立的共有模式可為山楂葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖2 13批山楂葉藥材UPLC指紋圖譜疊加圖

3 討論

山楂葉現(xiàn)有指紋圖譜研究多采用常規(guī)的HPLC法，但該法分析時間較長[6-7]。為此，本研究采用UPLC法建立山楂葉的指紋圖譜，在保證分離度的前提下，能明顯縮短分析時間，同時具有較高的靈敏度，可為進一步研究山楂葉的UPLC-MS化學(xué)成分識別提供依據(jù)。

本研究建立的山楂葉UPLC指紋圖譜共標(biāo)定出16個共有峰，但14批山楂葉與對照圖譜匹配的相似度相比差異較大。為建立更加可靠的指紋圖譜，本研究采用聚類分析，從14批山楂葉樣品中篩選出13批成分和含量穩(wěn)定的樣品，并建立了指紋圖譜共有模式，可為山楂葉藥材的質(zhì)量控制提供較全面、直觀、簡便的評價，為全面控制山楂葉的質(zhì)量提供基礎(chǔ)。

[1]陳鐘，盧樹杰，張維庫，等.HPLC測定山楂葉總黃酮中牡荊素鼠李糖苷含量[J].中成藥，2009，31(10)：1615-1616.

[2]高婷，曹陽，賈凌云，等.HPLC法測定14個地區(qū)山楂中羽扇豆醇的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(5)：373-376.

[3]楊明宇，潘偉東，潘海峰.山楂葉的化學(xué)成分研究[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，32(6)：522-524.

[4]耿慧春，滿瑩，趙智勇.山楂葉化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(26)：12-13.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.32.

[6]杜義龍，李艷榮，張曉峰，等.承德產(chǎn)山楂葉的HPLC指紋圖譜研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(10)：906-910.

[7]劉榮華，余伯陽.山楂葉HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2007, 29(1)：7-11.

[8]吳學(xué)文，熊艷，杜方麓.聚類分析在中藥材分類學(xué)中的應(yīng)用[J].中南藥學(xué)，2003，1(4)：232-234.

ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FINGERPRINT AND CLUSTERING ANALYSIS OF HAWTHORN LEAVES

YANG Ming-yu, LI Ming-chen, XU Bao-xin, et al
(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To establish hawthorn leaf fi ngerprint common patterns by using UPLC combined similarity calculation and clustering analysis, and provide reference for the quality evaluation of hawthorn leaves.Methods:The UPLC was used with the condition that the column was Waters CORTECS UPLC C18column (3.0mm ×100mm,1.6μm); the mobile phase was eluted with gradient by acetonitrilee-0.1% formic acid; the fl ow rate was 0.2ml/min; the detection wavelength was 320nm; the column temperature was 30℃; the sample volume was 3μl. The UPLC fi ngerprint of 14 batches of hawthorn leaves was established by evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fi ngerprint similarity (2004A version), and the similarity calculation and cluster analysis were carried out.Results:The 14 batches of hawthorn leaves were divided into Ⅰ, Ⅱ group by cluster analysis; and the hawthorn leaf fi ngerprint common pattern was established based on Ⅰgroup.Conclusions:The method established in this study can provide reference for quality control of hawthorn leaves.

Hawthorn leaves; UPLC fi ngerprint; Cluster analysis; Common pattern

R917

A

1004-6879（2017）05-0363-03

2016-11-18）

* 河北省教育廳青年基金項目（QN2016127，QN2017006）△ 通訊作者

山楂葉為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge. Var. Major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉，主要產(chǎn)于河北承德、遼寧、山東、山西等地[1-2]，主要含有黃酮、有機酸、黃烷類等成分[3]。山楂葉有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂之功效，其藥材和制劑在臨床上有著廣泛的應(yīng)用[4-5]。目前，關(guān)于山楂葉質(zhì)量控制的研究多集中在高相液相（HPLC）指紋圖譜的建立[6-7]，該方法雖然具有準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點，但存在靈敏度低、耗時較長、耗費溶劑較多等缺點。為建立一種快速、高效的質(zhì)量控制方法，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立山楂葉指紋圖譜，通過相似度評價結(jié)合聚類分析[8]，以及建立山楂葉UPLC指紋圖譜的共有模式，以期為山楂葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。