在廉價高分子材料表面采用化學鍍金法制備接觸式電導檢測器及其在PCR產物分析中的初步應用*

吳 劍，張 葉

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽蕪湖 241000）

在廉價高分子材料表面采用化學鍍金法制備接觸式電導檢測器及其在PCR產物分析中的初步應用*

吳 劍，張 葉

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽蕪湖 241000）

化學鍍金；接觸式電導檢測器；PCR產物分析

PCR（聚合酶鏈式反應）微芯片是運用多種方法在硅片、硅橡膠等材料上加工微管道、微反應室等，實現(xiàn)芯片上的快速PCR擴增，具有快速、高效、試劑消耗少等優(yōu)點，是近年生命科學領域的研究熱點之一[1-2]。PCR擴增產物為核酸，其檢測方法有熒光分光光度法、定量PCR法和數(shù)字PCR拷貝數(shù)計數(shù)法等[3-6]，但均需用到較為龐大的檢測儀器，因此便攜性差。電化學方法儀器便攜性好，如果能直接作為PCR微芯片的檢測元件能明顯提高微芯片的便攜性，可為在一些特殊場所，如中藥的野外檢測等方面提供技術支持。為此，本研究采用化學鍍金-轉移法制作了接觸式電導檢測器，并將其應用于鳳丹皮PCR擴增產物的檢測中，效果較好。該檢測器雖然檢測靈敏度不高，但是制作成本低廉、儀器的便攜性好，可應用于上述特殊場所進行藥材的初步篩查，因此具有一定的應用價值?，F(xiàn)報告如下：

1 實驗部分

1.1 試劑、用品和儀器 聚二甲基硅氧烷(PDMS)Sylgard 184，Dow Corning(Midland, MI,美國)公司；HAuCl4，上?；瘜W試劑有限公司；甲醛，上海凌峰化學試劑有限公司；抗壞血酸，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖，上海生物科學與技術有限公司；KHCO3，溫州化學試劑廠；透明環(huán)氧樹脂水晶膠（綠循化工商行，江蘇，昆山）；E625型硅橡膠，深圳紅葉杰公司（深圳，中國）。1×TBE緩沖溶液：分別稱取Tris 10.8g、Na2B4O7?2H2O 0.744g、 硼酸5.5g置于燒杯中，加50ml水攪拌溶解，轉移到100ml容量瓶中搖勻、定容，0.45μm濾膜過濾，超聲去氣備用，溶液pH=8.7。維修佬焊錫絲0.2mm，淘寶網。所用試劑除特別標明外，均為分析純；所有試劑均用18Mcm的Millipore水配制。

1.2 硅橡膠表面化學鍍金條件研究 雖有研究者[7]在PDMS表面進行了化學鍍金研究，且該方法環(huán)保性好，但PDMS較為昂貴。本研究使用廉價的E625型硅橡膠，在其表面進行了化學鍍金的配方研究。

在一塊固化后的E625型硅膠上打孔、清洗干凈、烘干，緊密貼合在另外一片固化后的E625型硅膠表面，所打小孔作為化學鍍金槽（見圖1a）。鍍液所用試劑包括：主鹽，1%氯金酸；還原劑，2%葡萄糖或0.3%甲醛水溶液或1%抗壞血酸；緩沖溶液，20%碳酸氫鉀。將主鹽、一種還原劑、緩沖溶液和水按照正交實驗設計軟件設計出的不同鍍液配方進行調配、混勻，注射到上述鍍金槽內，同一配方的鍍液重復注射到5個不同的槽內，視頻監(jiān)控鍍金過程，完成后用目測法觀察鍍層情況（見圖1b），用萬用表考察鍍層的導電性能并作出評價。

圖1 化學鍍金工藝研究槽化學鍍金及結果

1.3 集成電導電極微芯片的制作 將少量硅橡膠按照最佳單體比例，混合傾注到培養(yǎng)皿的底部，并覆蓋培養(yǎng)皿的整個底部，硅橡膠厚度約為0.1mm，保持底部水平靜置1小時，待基本固化；將用焊錫絲、面粉制備的微管道模板放置到上述硅橡膠的表面，繼續(xù)靜置約1小時待硅橡膠完全固化。此時，部分焊錫絲模板嵌入固化后的硅橡膠內。

將熱熔膠用熱熔膠槍加熱澆筑在在上述模板表面，待其固化后剝離獲得帶管道的熱熔膠模板，并且該模板可重復使用。

硅橡膠按照最佳單體比例傾倒在上述熱熔膠模板內，待硅橡膠固化制備硅橡膠陽模。在硅橡膠陽模下端凸起的陽模適當位置的兩邊，用固化后的PDMS塊圍成電導電極的形狀，在PDMS塊和管道凸起部分組成的兩個圍堰內，分別注入最佳比例的化學鍍金液，靜置待形成鍍金層。

將水晶膠（由A、B兩組分組成）按A：B=3:1的比例混合均勻，傾倒在鍍金后的硅橡膠模板表面，待固化后剝離獲得帶管道和電導電極的水晶膠基電泳芯片下片。將PDMS按照單體：固化劑=10：1的比例配置混合均勻傾倒在另一培養(yǎng)皿中，靜置，氣泡脫凈后60℃加熱1小時，待固化后切割成所需要的形狀作為上片，在PDMS上片的適合位置打孔，形成進樣口、廢液口等。將上下片貼合在一起，制成集成電導電極的復合電泳芯片（整個制備過程見圖2）。在兩個電導電極后端引出引線，連接在EZ-1電導率測試筆的兩個電極上。

圖2 集成電導電極微芯片制作過程示意圖

1.4 使用電泳芯片檢測鳳丹皮PCR擴增產物 鳳丹皮DNA提取物進行PCR擴增，將擴增產物引入上述自制集成電導電極微芯片的進樣口，在1×TBE緩沖溶液下電泳分離，用電導率儀進行檢測，用監(jiān)控攝像頭監(jiān)控、記錄數(shù)據(jù)的變化，所得結果整理后獲得電泳曲線。

2 討論

2.1 化學鍍金條件的研究 研究發(fā)現(xiàn)，配方甲醛、碳酸氫鉀、氯金酸、水比例為1:0.5:1.5:1，硅橡膠單體A:B=1:0.8時化學鍍成功率高，可出現(xiàn)光亮的化學鍍層，且導電性能良好。另研究發(fā)現(xiàn)，化學鍍金時溫度升高化學鍍所需時間減少，但當溫度超過35℃時難以生成化學鍍層，原因可能是在該溫度下鍍液中水分蒸發(fā)嚴重導致鍍液不穩(wěn)定。因此，在施鍍時應控制反應溫度在25℃左右。

2.2 檢測鳳丹皮PCR擴增產物 鳳丹皮PCR擴增產物電泳曲線見圖3，可見電泳芯片的響應數(shù)據(jù)（圖3）出現(xiàn)了一些較為明顯的響應，可確定是擴增產物的響應（與常規(guī)的擴增產物電泳法獲得的響應對比，圖3）。

圖3 鳳丹皮PCR擴增產物的電泳曲線

3 小結

本研究利用硅橡膠表面化學鍍金法制備了接觸式電導檢測器，并用于檢測了鳳丹皮的PCR擴增產物。該芯片制備過程簡單、成本低廉，制備的芯片可應用在PCR產物的檢測中，對中藥材的初步篩查等有一定的應用價值。

[1]陳文元,張衛(wèi)平.集成微流控聚合物PCR芯片[M].上海:上海交通大學出版社,2009.35.

[2]趙樹彌,朱靈,朱燦燦,等.集成核酸提取的實時熒光PCR微全分析系統(tǒng)[J].分析化學,2014,42(10):1393-1399.

[3]張璐.微量DNA檢驗技術及應用—微量DNA檢驗技術及展望[J].警察技術,2012（,2）:3-6.

[4]李亮,張秀杰,宛煜嵩,等.脫氧核糖核酸定量的潛在基準方法研究進展[J].中國農業(yè)科技導報,2013,15（1）:158-163

[5]任廣睦,劉季,王英元.實時熒光定量PCR技術應用于核酸定量檢測的研究進展及展望[J].山西醫(yī)科大學學報,2007, 37（9）:973-976.

[6]朱強遠,楊文秀,高一博,等.一種可絕對定量核酸的數(shù)字PCR微流控芯片[J].高等學校化學學報,2013,34（3）:545-550.

[7]Wu J,Bai H,Zhang X,et al.Thermal/Plasma-Driven reversible wettability switching of a bare gold film on a poly(dimethylsiloxane) surface by electroless plating[J].Langmuir,2010,26(2): 1191-1198.

(技術方法欄目編輯：張 健)

O657

A

1004-6879（2017）05-0417-02

2016-12-21）

* 安徽省教育廳自然科學基金項目（KJ2012B081），2014年高校優(yōu)秀青年人才支持計劃（皖教秘人[2014]181號）