干擾素-γ基因多態(tài)性與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)性研究

周莉，陳海燕，孔山，成家茂

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，云南大理671000；3.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南大理671000；4.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

干擾素-γ基因多態(tài)性與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)性研究

周莉1，陳海燕2，孔山3，成家茂4*

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，云南大理671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，云南大理671000；3.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南大理671000；4.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

目的：探討干擾素基因874位點(diǎn)（IFN-γ+874T∕A）的單核苷酸多態(tài)性與擴(kuò)張型心肌?。―CM）易感性之間的關(guān)系。方法：收集經(jīng)大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的113例DCM患者（患者組）以及100例漢族健康成人（對(duì)照組）的靜脈血，采用PCRSSP技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DCM患者和健康對(duì)照者的IFN-γ+874T∕A單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果：患病組IFN-γ+874TT基因型分布頻率（30.97%）與健康對(duì)照組（8.00%）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.631，P＜0.01）；患病組和對(duì)照組的T等位基因分布頻率分別為40.27%和22.00%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.352，P＜0.001）。結(jié)論：IFN-γ+874T∕A多態(tài)性與DCM易感性可能存在密切聯(lián)系。

擴(kuò)張型心肌??；干擾素-γ；基因多態(tài)性

應(yīng)用免疫抑制治療擴(kuò)張型心肌?。―ilated Car?diomyopathy，DCM），尤其是近年來被發(fā)現(xiàn)的炎癥性擴(kuò)張型心肌病，可顯著改善病情〔1〕，表明DCM的發(fā)病與病毒感染和自身免疫異常密切相關(guān)。干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）是唯一的Ⅱ型IFN，也稱為免疫干擾素，除具有廣譜抗病毒作用外，對(duì)免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔2〕。IFN-γ是IFN-γ基因的表達(dá)產(chǎn)物，該基因內(nèi)含子1的+874T∕A位點(diǎn)具有單核苷酸多態(tài)性，是產(chǎn)物的高表達(dá)表型，與DCM的易感性、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)〔3〕。我們對(duì)大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的113例DCM患者和100例健康對(duì)照者的IFN-γ+874A∕T基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，旨在進(jìn)一步探討IFN-γ+874T∕A基因多態(tài)性與DCM易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院各科室中自2012年1月至2015年12月經(jīng)確診的DCM病人共計(jì)113例納入患病組，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2007年頒布的《心肌病診斷與治療建議》中DCM的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕：①左心室舒張期末內(nèi)徑（LVEDD）＞5.0 cm（女性）和＞5.5 cm（男性）。②左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜45%或左心室縮短速率（FS）＜25%。并排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、酒精性心肌病、心動(dòng)過速性心肌病、心包疾病、系統(tǒng)性疾病、肺心病和神經(jīng)肌肉性疾病等。其中，男68例，女45例，年齡17～82歲，平均（36.45±17.33）歲，漢族，無近親血緣關(guān)系和家族史。另隨機(jī)選取我院某次健康體檢中無近親血緣關(guān)系的成人100例作為正常對(duì)照組，其中，男57例，女43例，年齡19～67歲，平均（35.77±19.63）歲。所有研究對(duì)象在檢驗(yàn)室采血5 mL，從中取2 mL抽檢血液作為本次研究所用，所有血液均已經(jīng)過抗凝處理。

1.2 總DNA提取全血基因組DNA抽提試劑盒購于上海生工，按試劑盒說明進(jìn)行操作。所有DNA樣本-20℃保存。DNA提取、PCR基因轉(zhuǎn)錄均在解剖教研室的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照無菌要求和檢測(cè)步驟完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參照文獻(xiàn)〔5〕設(shè)計(jì)IFN-γ+ 874T∕A位點(diǎn)的PCR引物，所有引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。見表1。

表1 IFN-γ+874T∕A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的引物序列

1.4 PCR-SSP反應(yīng)試劑購自大連寶生物工程有限公司，應(yīng)用美國賽默飛世爾Piko系列PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，基因組DNA 2 μL（50～100 ng）、10×PCR緩沖液1.5 μL、dNTPs 200 μmol∕L、引物P1、P2、P3各1.5 μmol∕L，P4、P5各0.5 μmol∕L，Taq DNA聚合酶1.5 U。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s、60℃退火40 s、72℃延伸40 s共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓140 V，電泳時(shí)間15～20 min，在紫外光下觀察擴(kuò)增結(jié)果并記錄拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行基因型和等位基因頻率，然后經(jīng)Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，型別分布使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ+874T∕A位點(diǎn)PCR-SSP多態(tài)性檢測(cè)的基因型樣本的基因組DNA片段經(jīng)擴(kuò)增后，可出現(xiàn)3種不同的基因型陽性條帶，分別為TT正常純合子（264 bp）、AA突變純合子（264 bp）以及AT雜合子。見表2、圖1。

表2 IFN-γ+874T∕A位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)的基因型

2.2 IFN-γ+874T∕A等位基因的分布頻率患病組和對(duì)照組人群的IFN-γ+874T∕A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率，均經(jīng)Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。結(jié)果顯示，患病組IFN-γ+874TT基因型分布頻率（30.97%）較健康對(duì)照組（8.00%）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.631，P＜0.001）；且患病組的T等位基因分布頻率（40.27%）也較對(duì)照組（22.00%）的明顯升高，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.352，P＜0.001）。見表3。

圖1 IFN-γ+874T∕A位點(diǎn)基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表3 IFN-γ+874位點(diǎn)基因型及等位基因的數(shù)量與分布頻率

3 討論

IFN-γ為Ⅱ型干擾素，是Th1細(xì)胞產(chǎn)生的免疫因子，與免疫應(yīng)答機(jī)制的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)關(guān)系密切。IFN-γ基因位于染色體12q24.1，包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。近年來文獻(xiàn)報(bào)道的IFN-γ單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有：-183G∕T，+764C∕G，+874A∕T，+2 109A∕G，+2 118A∕G，+2 326T∕C，+2 459A∕G，+2 671T∕C，+3 177T∕G，+3 273G∕A，+3 810G∕A，+5 199A∕T，+5 272A∕G，+4 766C∕T，+5 644G∕A等〔6〕，在內(nèi)含子區(qū)的+874和+2 109位點(diǎn)存在兩個(gè)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的多態(tài)性。IFN-γ基因啟動(dòng)上游+874T∕A位點(diǎn)的多態(tài)性變異，是由第874位點(diǎn)堿基A變?yōu)門所致，可通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，影響IFN-γ的表達(dá)量〔7〕，且TT為高表達(dá)基因型，AA為低表達(dá)型基因型，TA為中等表達(dá)基因型〔8〕。研究表明，IFN-γ+874T∕A等位基因可能是DCM的遺傳易感基因之一〔9〕，這可能與DCM發(fā)病機(jī)制中的自身免疫調(diào)節(jié)以及疾病發(fā)展過程中Th1細(xì)胞針對(duì)心肌抗原所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)密切相關(guān)〔10〕。研究認(rèn)為，IFN-γ作為重要的細(xì)胞因子，在擴(kuò)張型心肌病病程發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用：促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，通過抑制白細(xì)胞介素-4的產(chǎn)生，阻滯Th2的增殖分化，調(diào)整Th1∕Th2比例，從而抑制體液免疫，調(diào)節(jié)自身免疫；通過誘導(dǎo)抗病毒蛋白直接抑制病毒復(fù)制；活化NK細(xì)胞，形成IFN-NK系統(tǒng)，抵御病毒感染；誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)生，而發(fā)揮抗病毒、擴(kuò)張血管保護(hù)心肌作用〔11〕。本研究結(jié)果顯示，在海拔超過2 000 m的高原地區(qū)漢族人群中，DCM患者的IFN-γ+874TT基因型和T等位基因的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，說明IFN-γ+874T∕A基因位點(diǎn)多態(tài)性與DCM相關(guān)，可能是DCM的易感性基因之一。近年來，隨著分子心臟病學(xué)研究的進(jìn)展，應(yīng)用分子生物學(xué)手段治療DCM已成為該領(lǐng)域的熱門話題。因此，今后對(duì)于DCM患者而言，介于注射用重組人IFN-γ制劑克隆伽瑪不失為一種新的治療選擇，有必要對(duì)此類患者的外周血IFN-γ水平及其免疫性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步明確IFN-γ對(duì)DCM患者自身免疫和心功能的影響。

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Associations of IFN-γ Gene Polymorphism with Dilated Cardiomyopathy

Zhou Li1,Chen Haiyan2,Kong Shan3,Cheng Jiamao4*
（1.Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Ultrasonic Department, The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；3.Department of Laboratory,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；4.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To investigate the relationship between mononucleotide's polymorphism of IFN-γ gene's 874 site and the susceptibility to dilated cardiomyopathy.Methods：In this case-control study,we have collected venous blood of 113 patients with DCM（patients group）and of 100 healthy Han adults（control group）from the first affiliated hospital of Dali University.PCR-SSP technology and agarose gel electrophoresis were applied to detect mononucleotide's IFN-γ+874T∕A polymorphism of the two groups.Results：There were significant differences between the patient group whose IFN-γ+874TT genotypic frequency distribution was 30.97%and the health control group with 8.00%（χ2=17.631，P＜0.001）.The distributive frequencies of T allele in the patient group and control group were 40.27%and 22.00%respectively.There were statistically significant differences between them（χ2=16.352，P＜0.001）.Conclusion：There may be a close relationship between IFN-γ+874A∕T polymorphism and the susceptibility to DCM.

dilated cardiomyopathy;IFN-γ;gene polymorphism

R542.2

B

2096-2266（2017）08-0028-03

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.007

（責(zé)任編輯 董杰）

大理大學(xué)青年教師科研基金資助項(xiàng)目（KYQN201118）

2016-03-24

2017-03-26

周莉，講師，主要從事心血管病研究.

*通信作者：成家茂，教授.