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    hMTERF3基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

    2017-09-15 11:21:59孫美濤梅雯楊澤芳丁小倩張若鵬張曉娟熊偉
    大理大學(xué)學(xué)報 2017年8期
    關(guān)鍵詞:真核凝膠電泳瓊脂糖

    孫美濤,梅雯,楊澤芳,丁小倩,張若鵬,張曉娟,熊偉*

    (1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南大理671000;2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科,云南大理671000;3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科,云南大理671000)

    hMTERF3基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

    孫美濤1,梅雯1,楊澤芳1,丁小倩1,張若鵬2,張曉娟3,熊偉1*

    (1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南大理671000;2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖科,云南大理671000;3.大理大學(xué)大理教學(xué)醫(yī)院呼吸內(nèi)科,云南大理671000)

    目的:構(gòu)建和鑒定帶3×Flag標簽的人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3基因(hMTERF3)真核表達載體。方法:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因序列設(shè)計引物,采用聚合酶鏈式反應(yīng)從pGEM-hMTERF3重組克隆載體中擴增出hMTERF3基因開放閱讀框序列,經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后,連接入真核表達載體p3×FLAG-CMV-14的多克隆位點中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3,分別用菌落PCR、限制性核酸內(nèi)切酶分析和DNA序列分析3種方法鑒定重組子。結(jié)果:重組質(zhì)粒p3×FLAGCMV-hMTERF3經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定均獲得大小為1 254 bp的目的條帶,DNA序列分析和Blast序列比對結(jié)果表明該序列與GenBank中hMTERF3基因序列的同源性達到100%,插入基因的大小和方向均正確。結(jié)論:成功構(gòu)建了hMTERF3基因的真核表達載體,為進一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

    人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3;真核表達載體;鑒定

    線粒體基因的表達調(diào)控與線粒體的功能密切相關(guān)〔1〕。人類線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子(human mito?chondrial transcription termination factor,hMTERF)是一類由核基因組編碼,且能夠與線粒體DNA(mi?tochondrial DNA,mtDNA)特異結(jié)合的單體蛋白質(zhì)〔2〕。人類MTREF蛋白家族包括4個成員,分別為MTERF1~MTERF4,各成員主要參與線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程的調(diào)控〔3〕。目前,線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子僅在后生動物及植物中存在,在真菌中仍未發(fā)現(xiàn)與其同源的蛋白質(zhì)〔4〕。

    hMTERF3(human mitochondrial transcription ter?mination factor 3,hMTERF3)基因又被命名為人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1(mitochondrial tran?scription termination factor domain containing 1,hM?TERFD1)〔5〕。hMTERF3基因位于8號染色體(8q22.1),包含11個外顯子〔6〕。研究顯示,哺乳動物MTERF3是一種線粒體蛋白質(zhì),負調(diào)控線粒體的DNA轉(zhuǎn)錄水平和能量生成〔7〕。hMTERF3基因拷貝數(shù)擴增及其過表達對肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進展和預(yù)后有重要作用,但其在惡性腫瘤的作用機制還不清楚〔8〕。本實驗擬利用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)克隆hMTERF3基因編碼序列,構(gòu)建hMTERF3基因真核表達載體,為進一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制,以及尋找新的腫瘤基因治療靶點的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞株和載體大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞(博邁德生物技術(shù)有限公司);重組DNA克隆載體pGEM-hMTERF3(Sino Biological公司);真核表達載體p3×FLAG-CMV-14由云南大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室余敏副教授贈送。

    1.2 試劑限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ(大連Takara公司);2×Taq PCR Master Mix(Promega公司);T4 DNA連接酶(Gene Copoeia公司);Trans 2K DNA Maker、6×DNA Loading Buffer、DuRed核酸染料(北京全式金生物技術(shù)公司);質(zhì)粒提取純化試劑盒(Omega公司);DNA片段回收試劑盒(BioTeke公司);瓊脂糖為西班牙進口分裝;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純;PCR引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成,DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

    1.3 儀器PCR擴增儀(德國Eppendorf AG公司);BT423S型電子天平(德國Sarturios公司);DYY-12C型電泳儀(北京六一儀器廠);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);TAZ-84A臺式恒溫培養(yǎng)箱(上海實驗儀器總廠);TGL-16C臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);HH-4恒溫水浴鍋(上海國華電器有限公司);微量移液器(上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司);LDZX-50FA立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)。

    1.4 方法

    1.4.1引物設(shè)計檢索GenBank數(shù)據(jù)庫得到hM?TERF3基因(Gene ID:557786089)的轉(zhuǎn)錄本,PCR引物設(shè)計參照hMTERF3基因序列完整的轉(zhuǎn)錄本1(NM_015942.4)。上游引物P1(引入HindⅢ酶切位點):5'-GCGAAGCTTATGGCTTTGTCAGCCCA-3',下游引物P2(引入BamHⅠ酶切位點):5'-GCGGG?TACCAAGCGTTTTTAAGAATT-3',下劃線部分為酶切位點,之前為保護堿基。預(yù)期的DNA擴增片段長度為1 254 bp。

    1.4.2hMTERF3基因的PCR擴增和電泳檢測以重組克隆質(zhì)粒pGEM-hMTERF3為模板,用上、下游引物進行PCR擴增hMTERF3基因,反應(yīng)體系為25 μL,其中模板DNA 1 μL,上游引物和下游引物各1 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán),72℃再延伸5 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物,1%瓊脂糖凝膠電泳,以檢測擴增產(chǎn)物的片段大小。

    1.4.3 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核載體的構(gòu)建與PCR鑒定將hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后,與真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-14分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳,并經(jīng)過凝膠回收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將外源目的基因和真核表達載體酶切純化的產(chǎn)物按照3:1的摩爾比混合,用T4 DNA連接酶16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,然后取200 μL菌液涂布于含氨芐青霉素100 μg∕mL的LB固體培養(yǎng)基中。次日,隨機挑取10個單菌落,分別接種于3 mL含50 μg∕mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中,37℃,200 r∕min振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液進行菌落PCR擴增以鑒定是否存在插入片段。菌落PCR鑒定引物為P1∕P2,反應(yīng)體系25 μL,其中菌液1 μL,上游引物和下游引物各1 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán),72℃再延伸5 min。擴增產(chǎn)物取5 μL,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,以確定擴增產(chǎn)物大小。如果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示大小正確則用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

    1.4.4 p3×FLAG-CMV-hMTERF3真核表達載體的酶切鑒定和測序鑒定將提取的重組真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3同時用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將酶切鑒定正確的重組真核表達質(zhì)粒進行測序鑒定,重組質(zhì)粒的測序引物:上游引物5'-CGCAAAT?GGGCGGTAGGCGTG-3',下游引物5'-CCAGCTTG?GTTCCCAATAGA-3'。DNA測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

    2 結(jié)果

    2.1hMTERF3基因的PCR產(chǎn)物電泳分析利用PCR從pGEM-hMTERF3克隆載體擴增得到hMTERF3基因完整的開放閱讀框(open reading frame,ORF)片段。hMTERF3基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1 254 bp處可見清晰、單一的的擴增條帶,與預(yù)期的片段大小一致。見圖1。

    圖1 hMTERF3基因PCR擴增產(chǎn)物

    2.2 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的構(gòu)建目的基因和p3×FLAG-CMV-14空載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞,挑取單克隆擴大培養(yǎng),并采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3,用空載體作為對照進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示,提取質(zhì)粒的質(zhì)量良好,純度較高,無蛋白質(zhì)和RNA的污染。見圖2。

    圖2 p3×FLAG-CMV-hMTERF3重組質(zhì)粒電泳圖

    2.3 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的鑒定重組表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3的菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示在1 254 bp處可見一條特異性的目的條帶。見圖3。提取純化的重組表達載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳檢測可見大小約為6 310 bp的載體條帶與1 254 bp的目的條帶兩個片段??蛰d體p3×FLAG-CMV-14經(jīng)上述兩個酶雙酶切后,僅見一條6 310 bp的載體條帶。見圖4。

    圖3 菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3

    圖4 HindⅢ∕BamHⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒p3× FLAG-CMV-hMTERF3

    2.4 重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3的序列分析鑒定對質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3上的多克隆位點內(nèi)的外源DNA進行序列分析鑒定,測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank檢索到的編碼序列(NM_ 015942.4)同源性為100%,說明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。見圖5。

    3 討論

    線粒體是細胞中的重要細胞器,細胞的能量供應(yīng)來自于線粒體。隨著人們對線粒體基因轉(zhuǎn)錄機制和人類線粒體疾病的深入研究,對人類MTERF蛋白家族的研究已成為一個熱點〔9-10〕。MTERF3基因是MTERF基因超家族中進化最保守的成員,在低等的果蠅到高等的哺乳動物細胞中都存在同源基因〔11〕。hMTERF3基因定位于人類8號染色體(8q22.1),基因全長22 216 bp,含有11個外顯子和10個內(nèi)含子〔6〕。hMTERF3基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物共417個氨基酸,N端1~68個氨基酸為進入線粒體的導(dǎo)肽,其后349個氨基酸為成熟的hMTERF3蛋白。我們在前期研究中,成功地在大腸埃希菌中原核表達和純化了hMTERF3蛋白,并制備了小鼠抗hMTERF3多克隆抗體。進一步采用細胞免疫熒光的方法證實,hMTERF3蛋白定位在人宮頸癌HeLa細胞的線粒體上〔12〕。WRDENBERG等〔13〕的研究顯示,哺乳動物MTERF3不僅負性調(diào)節(jié)mtDNA轉(zhuǎn)錄,而且能通過調(diào)節(jié)線粒體中核糖體大亞基的組裝,影響核糖體的生物合成〔7〕。HYV?RINEN等用二維瓊脂糖凝膠電泳法對mtDNA復(fù)制中間體的研究發(fā)現(xiàn),在胚腎293T細胞中過表達hMTERF3能抑制線粒體DNA復(fù)制,造成細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)的下降〔13-14〕。這些結(jié)果進一步提示,hMTERF3可能還參與抑制mtDNA復(fù)制過程中復(fù)制中間體的形成及復(fù)制叉的延伸。

    圖5 Blast程序比對重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3部分測序結(jié)果

    近年來的研究發(fā)現(xiàn),在人類肝癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中mtDNA含量和線粒體呼吸鏈酶活性降低,這提示惡性腫瘤中參與線粒體基因表達調(diào)控的蛋白因子可能存在著表達異?!?5-17〕。ZHANG等的研究表明,hMTERF3基因擴增和表達異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切〔8〕。但hMTERF3基因在腫瘤細胞中具體作用機制亟待進一步研究。

    本實驗中使用的p3×FLAG-CMV-14是一個典型的真核表達載體,能在哺乳動物細胞中高效表達外源基因,從而實現(xiàn)目的基因的過表達。構(gòu)建的真核表達載體為質(zhì)粒,比病毒載體安全性更高,真核表達載體p3×FLAG-CMV-14含有多克隆位點,便于目的基因插入至載體〔18〕。同時,載體上含有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和新霉素抗性基因(Neor)使得質(zhì)粒容易篩選,構(gòu)建好的重組真核表達載體能夠穩(wěn)定在宿主細胞內(nèi)復(fù)制和高效表達。p3×FLAGCMV-14載體上的FLAG標記物是專為標記目的蛋白質(zhì)設(shè)計的多肽標記物,其特點是標記物的序列不是來自任何已知的蛋白質(zhì)。該標記物是由8個氨基酸組成的多肽,具有親水性,可以置于外源蛋白質(zhì)的羧基末端〔19〕。目前,已有商品化的FLAG抗體可識別標記物,方便進行外源蛋白質(zhì)的檢測。通過本實驗構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒,可為下一步研究hMTERF3基因?qū)δ[瘤細胞氧化磷酸化活性和惡性生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。

    〔1〕時多,王璐,周運恒,等.線粒體基因表達的調(diào)控及其與某些疾病的關(guān)系〔J〕.生命的化學(xué),2006,26(3):250-252.

    〔2〕ROBERTI M,POLOSA P L,BRUNI F,et al.The MTERF family proteins:mitochondrial transcription regulators and beyond〔J〕.BiochimBiophysActa,2009,1787(5):303-311.

    〔3〕熊偉,余敏,左紹遠.線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達中的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2015,31(3):223-231.

    〔4〕ROBERTI M,POLOSA P L,BRUNI F,et al.MTERF fac?tors:a multifunction protein family〔J〕.Biomol Concepts,2010,1(2):215-224.

    〔5〕ROBERTI M,BRUNI F,LOGUERCIO POLOSA P,et al.MTERF3,the most conserved member of the mTERF-fami?ly,is a modular factor involved in mitochondrial protein synthesis〔J〕.Biochim Biophys Acta,2006,1757(9∕10):1199-1206.

    〔6〕高菁霞.線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子(mTERF)對細胞增殖影響的研究〔D〕.昆明:云南大學(xué),2007.

    〔7〕PARK C B,ASIN-CAYUELA J,CáMARA Y,et al.MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcription〔J〕.Cell,2007,130(2):273-285.

    〔8〕ZHANG C,WU N,GAO F,et al.MTERFD1 functions as an oncogene〔J〕.Oncotarget,2016,8(10):1-8.

    〔9〕BONAWITZ N D,CLAYTON D A,SHADEL G S.Initiation and beyond:multiple functions of the human mitochondrial transcription machinery〔J〕.Mol Cell,2006,24(6):813-825.

    〔10〕孫美濤,王昀,李月,等.hMTERF3基因啟動區(qū)的生物信息學(xué)分析〔J〕.大理大學(xué)學(xué)報,2017,2(2):40-45.

    〔11〕MONTOYA J,LóPEZ-PéREZ M J,RUIZ-PESINI E.Mi?tochondrial DNA transcription and diseases:Past,present and future〔J〕.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics,2006,1757(9):1179-1189.

    〔12〕楊勇琴,張成桂,孫美濤,等.人MTERF3蛋白的原核表達與多克隆抗體制備〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2016,29(10):1020-1025.

    〔13〕WREDENBERG A,LAGOUGE M,BRATIC A,et al.MTERF3 regulates mitochondrial ribosome biogenesis in invertebrates and mammals〔J〕.PLoS Genet,2013,9(1):e1003178.

    〔14〕HYV?RINEN A K,POHJOISM?KI J L,HOLT I J,et al.Overexpression of MTERFD1 or MTERFD3 impairs the completion of mitochondrial DNA replication〔J〕.Mol Biol Rep,2011,38(2):1321-1328.

    〔15〕李海霞,張淑蘭.線粒體DNA在婦科惡性腫瘤中的研究進展〔J〕.國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2009,36(1):53-55.

    〔16〕韓琤波,李凡,楊雪飛,等.胃癌線粒體DNA拷貝量的變化〔J〕.世界華人消化雜志,2004,12(2):258-261.

    〔17〕高園,聶鴻靖,楊棟,等.肝癌患者單個核細胞線粒體DNA拷貝數(shù)與抗氧化能力的變化〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2016,32(1):1-5.

    〔18〕嚴會文,蘇敏,高杰,等.大鼠PAX6基因真核表達載體構(gòu)建及鑒定〔J〕.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2016,41(3):288-293.

    〔19〕張海洋,馮慕華,徐彤,等.人核呼吸因子2基因真核表達載體的構(gòu)建與鑒定〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報,2014,13(2):37-42.

    Construction and Identification of Eukaryotic Expression Vector of Human MTERF3

    Sun Meitao1,Mei Wen1,Yang Zefang1,Ding Xiaoqian1,Zhang Ruopeng2,Zhang Xiaojuan3,Xiong Wei1*
    (1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Department of Reproductive Medicine,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;3.Department of Respiratory Medicine,Dali Teaching Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

    Objective:To construct and identify the eukaryotic expression vector of FLAG-tagged human MTERF3 gene.Methods:The human MTERF3 gene was amplified by Polymerase Chain Reaction(PCR).The recombinant products of the p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were gained by T4 DNA ligase connecting MTERF3 gene fragment and eukaryotic expression vector p3×FLAG-CMV-14 with restriction enzymes HindⅢand BamHⅠ.The recombinant pasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 were identified by colony PCR, double restriction enzyme digest and DNA sequencing.Results:A specific band of 1 254 bp was detected from recombinant plasmid p3×FLAG-CMV-hMTERF3 by digestion of HindⅢand BamHⅠ.The sequencing and identification showed that homology between this sequence and the human MTERF3 gene sequence from GenBank was 100%,and the size and the direction of the inserted gene were right.Conclusion:The eukaryotic expression vector of human MTERF3 was constructed successfully,which may lay the foundation for a further study of the interaction mechanism between behavior of MTERF3 in tumor cells and its development.

    human MTERF3;eukaryotic expression vector;identification

    Q78

    A

    2096-2266(2017)08-0018-05

    10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.005

    (責(zé)任編輯 李楊)

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31601155;81560458);云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項目(2014Z126);大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃資助項目(CXCY-X-2016-18);大理大學(xué)大學(xué)生科研基金資助項目(KYSX201609)

    2017-01-04

    2017-01-21

    孫美濤,碩士研究生,主要從事細胞分子生物學(xué)研究.

    *通信作者:熊偉,副教授,博士.

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