子癇前期患者胎盤組織p-p38與caspase-3、8的表達及臨床意義

徐 佳，劉朵朵，馬向東，陳必良

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科，陜西 西安 710032)

子癇前期患者胎盤組織p-p38與caspase-3、8的表達及臨床意義

徐 佳，劉朵朵，馬向東，陳必良

(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科，陜西 西安 710032)

目的 研究p-p38、caspase-3、caspase-8在子癇前期患者胎盤中的表達及臨床意義。方法 選擇2016年 6月至2017年 2月在西京醫(yī)院婦產科住院分娩的孕婦80例，分為子癇前期組40例，正常妊娠組40例，采用免疫組化法及蛋白印跡法檢測子癇前期患者和正常妊娠婦女胎盤滋養(yǎng)細胞中p-p38、caspase-3、caspase-8的表達。結果 p-p38、caspase3、caspase8在子癇前期胎盤和正常妊娠胎盤中均有表達；在子癇前期患者胎盤中p-p38、caspase-3、caspase-8表達與正常胎盤相比顯著升高(2.08±0.04vs 1.44±0.04、1.72±0.03 vs 1.12±0.06、1.59±0.04 vs 1.18±0.01，t值分別為71、60、61，均P<0.01)。結論 胎盤組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的異常表達可能促進滋養(yǎng)細胞凋亡增加，推進子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

p-p38;caspase-3;caspase-8；子癇前期；滋養(yǎng)細胞

子癇前期(preeclampsia,PE)是產科常見的嚴重并發(fā)癥，是孕產婦和圍產兒病死率升高的主要原因[1]。研究表明子癇前期胎盤中滋養(yǎng)細胞凋亡過多，導致其浸潤功能下降、浸潤過淺即胎盤淺著床，最終引起胎盤灌注不足、缺血缺氧，因此子癇前期的發(fā)生及進展與滋養(yǎng)細胞凋亡密切相關，但調控滋養(yǎng)細胞凋亡的機制尚不清楚[2]。研究發(fā)現，p38MAPK通過多種途徑在炎癥反應和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，凋亡蛋白caspase-3、caspase-8是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白酶，均參與細胞凋亡凋控[3]。本研究探討子癇前期患者胎盤組織中p-p38及凋亡蛋白caspase-3、caspase-8的表達，為子癇前期的發(fā)病機制提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2016年6月至2017年2月第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科行剖宮產的子癇前期患者40例，平均孕周為(33.4±3.1)周，平均年齡為(26.8±3.8)歲；選擇同期行擇期剖宮產的正常足月單胎妊娠孕婦40例為對照，平均孕周為(39.1±0.7)周，平均年齡(27.6±3.2)歲。子癇前期診斷標準參照謝幸主編的第8版《婦產科學》。兩組孕婦排除標準：多胎妊娠、原發(fā)性高血壓、妊娠期糖尿病、肝腎疾病、感染、妊娠合并免疫系統疾病史等。

1.2方法

1.2.1標本收集及處理

全部組織標本均在剖宮產手術中收集，待胎盤娩出后，立即從胎盤母體面中央處取材，取胎盤組織約1cm×1cm×1cm大小,快速在冷生理鹽水中清洗3次，放入EP管中，置于液氮罐內；另取0.5cm×0.5cm組織，以PBS緩沖液清洗3次后放入10%中性福爾馬林液固定，按常規(guī)制備成石蠟塊，4℃冰箱保存。整個操作過程的時間在15min以內完成。

1.2.2免疫組化檢測胎盤組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的定位表達

采用免疫組化SP法。p-p38、caspase-3、caspase-8免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。胎盤組織固定8h后常規(guī)逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟過夜，包埋后制成6μm切片。石蠟切片經常規(guī)脫蠟、水合，于枸櫞酸鹽(EDTA)緩沖液中進行抗原修復，用1%H2O2、0.5%牛血清蛋白(BSA)處理后，加入兔抗人ADAMI9抗體(1：200)，4℃孵育過夜后，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育30min，DBA(二氨基聯苯胺四鹽酸)顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水封片。陽性結果判斷標準：標本組織細胞中有(棕)黃色顆粒沉著。根據棕色反應的陽性面積比判斷結果。

1.2.3Western blot法檢測胎盤組織中p-p38 及caspase-3、caspase-8

取胎盤組織 100mg置入裂解液中,冰浴勻漿,裂解液含 5%N P-40,10mmol/L Tris HCl pH7.4,150mmol/LNaCl,1mmol/L EDTA,1mmol/L Na3VO4pH10.0,1μg/mL aprotinin,100μg/mL PMSF。用Bradford 法檢測蛋白濃度。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，上樣量每孔30μg，濃縮膠電泳電壓100V，分離膠電泳電壓120V。半干轉蛋白至PVDF膜上，70mA ,35min。TBS T洗脫2次，每次10min，10%脫脂奶粉室溫封閉 3h ,加入 2.5%BSA稀釋的p-p38以及caspase-3、caspase-8、兔抗人多克隆抗體(1：400),4 ℃孵育過夜 , TBST 漂洗3 次每次10min后 ,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG(1：3 000),37孵育1h ,TBST洗3次，每次10min。 按照ECL檢測試劑盒(Pierce公司)說明進行顯色、曝光、X光片沖洗，將X光片透視掃描后，印跡的灰度值經Gel-Pro Analyzer軟件分析 (United Bio公司)，并以actin的灰度值作為內參進行結果的均一。

1.3統計學方法

采用SPSS17．0軟件進行統計學分析。p-p38、caspase-3、caspase-8表達水平組間比較，用ANOVA方差分析和t檢驗,以P<0.05作為差異有統計學意義的檢驗標準。

2 結果

2.1兩組孕婦胎盤中p-p38、caspase-3、caspase-8的免疫組化染色

鏡下，p-p38和caspase-3、caspase-8在子癇前期組細胞滋養(yǎng)細胞中可見大量棕黃色顆粒的陽性表達，而正常妊娠組內僅可見少量陽性表達。通過免疫組化染色發(fā)現，p-p38、caspase-3、caspase-8定位于胎盤組織中細胞滋養(yǎng)細胞，在絨毛間質細胞中也可見少量表達，陽性定位在細胞漿，見圖1。采用Mias圖象分析系統對其進行定量分析,在子癇前期組和對照組之間，p-p38、caspase-3、caspase-8的表達有統計學意義(0.08±0.01 vs 0.02±0.004，0.07±0.01 vs 0.01±0.002，0.09±0.02 vs 0.02±0.003，t值分別為37.5、40.0、23.0，均P<0.01)。

注：圖A、C、E正常組胎盤滋養(yǎng)細胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表達(×40，SAB法染色)； 圖B、D、F子癇前期組胎盤滋養(yǎng)細胞p-p38、caspase-3、caspase-8的表達顯著增強(×40，SAB法染色)；G 陰性對照。

表1 p-p38、caspase-3、caspase-8在兩組胎盤滋養(yǎng)細胞中陽性面積表達比值

注：*與正常組比較P<0.01，有顯著性意義。

2.2Western blot檢測胎盤組織中p-p38、caspase-3、caspase-8的表達

子癇前期胎盤組織p-p38蛋白水平較正常妊娠組增高，顯著高于其在正常妊娠組的表達(2.18±0.04 vs 1.21±0.02)，差異有統計學意義。子癇前期組胎盤組織中caspase-3、caspase-8蛋白表達水平顯著高于正常妊娠組(1.72±0.03 vs 0.96±0.06、1.59±0.04 vs 0.98±0.01)，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖2 兩組孕婦胎盤組織中p-p38的蛋白表達水平

圖3 兩組孕婦胎盤組織中caspase-3的蛋白表達水平

圖4 兩組孕婦胎盤組織中caspase-8的蛋白表達水平

表2 p-p38 、caspase-3、caspase-8在胎盤組織中的表達

注：*與正常組比較P<0.01，有顯著性意義。

3 討論

3.1子癇前期的研究背景

子癇前期是產科常見的妊娠期特有疾病，嚴重威脅母嬰健康，是導致孕產婦及圍產兒病率和死亡的重要原因之一。在妊娠過程中，胎盤的功能是通過滋養(yǎng)細胞的增殖、凋亡、侵襲等實現的。由胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡增加引起各種病理妊娠多有報道，研究認為當患者胎盤組織中多種因素引起胎盤灌流不足，胎盤缺血缺氧，促使滋養(yǎng)細胞過度凋亡，引起胎盤滋養(yǎng)細胞浸潤能力下降，導致胎盤淺著床[4]，進一步使胎盤血流減少，滋養(yǎng)細胞凋亡急劇增加，導致病理妊娠如子癇前期、胎兒生長受限等。因此，子癇前期的發(fā)病與滋養(yǎng)細胞的凋亡機制密切相關。p38MAPK是重要的細胞應激信號傳導通路，內外源性刺激可激活p38磷酸化，參與細胞凋亡、誘導細胞基因表達以及促進細胞增殖及分化等，研究證實激活p38MAPK磷酸化能夠調節(jié)凋亡前期信號，導致細胞功能紊亂、凋亡壞死[5-6]。Caspase家族是一組在細胞凋亡機制中發(fā)揮重要作用的蛋白酶，又稱為“天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶”。因此，對子癇前期胎盤組織中凋亡機制的研究，可以為子癇前期的預防和治療提供新的理論依據。

3.2 p-p38和caspase-3、casepase-8與子癇前期發(fā)病關系研究

本研究通過免疫組化分析p-p38和caspase-3、caspse-8在胎盤組織中表達，在子癇前期組細胞滋養(yǎng)細胞中均可見大量棕黃色顆粒的陽性細胞。通過對其陽性面積分析可得，p-p38和caspase-3、caspse-8在子癇前期中的表達且顯著高于正常孕婦對照組。通過Western blot實驗方法同樣證實p-p38和caspase-3、caspse-8在子癇前期患者胎盤組織中高表達，且顯著高于對照組。本研究中子癇前期胎盤組織中caspase-3、caspse-8增高提示，在子癇前期中滋養(yǎng)細胞凋亡顯著增加，進一步證實了子癇前期發(fā)病機制中滋養(yǎng)細胞凋亡增加的假說，與國外學者所類似研究得到的結果相一致[7]。研究結果表明，在子癇前期患者胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡過程中，p38磷酸化后通過，激活caspase家族活性，激活啟動caspase 8，促使效應caspase 3激活，誘導Bax/Bcl-2增加、Cox-2上調，使細胞DNA修復功能喪失，失去正常增殖分化能力形成凋亡[8]。

本研究中子癇前期胎盤組織中p-p38顯著增加，提示子癇前期胎盤滋養(yǎng)細胞缺血缺氧引起病理損傷，可激活p38磷酸化，進而啟動跨核被膜調控，可刺激機體產生過多炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-4等，同時調節(jié)鈣離子泵，使血管內皮細胞受損和功能障礙，通過增強c-myc、c-jun和c-fos基因表達、磷酸化p53，參與Fas/FasL的表達，誘導caspase家族的啟動，參與和調節(jié)細胞凋亡[9]。

由此我們可以推測，子癇前期胎盤血流灌注不足，滋養(yǎng)細胞持續(xù)缺血缺氧，激活p-p38磷酸化，進而激活凋亡級聯反應的啟動者caspase-8的表達增加，通過凋亡級聯反應激活細胞凋亡途徑，引起執(zhí)行者caspase-3隨之增加，從而引起滋養(yǎng)細胞凋亡增加。這種改變一方面既可以解釋為子癇前期的病因，目前已有研究發(fā)現子癇前期孕婦在臨床癥狀出現以前，胎盤絨毛中已有缺氧、凋亡增加；而另一方面，在誘導滋養(yǎng)細胞、血管內皮細胞過多凋亡，加重胎盤功能障礙，促進子癇前期的發(fā)展[10]。

綜上所述，p-p38、caspase-3、caspase-8在胎盤組織的異常表達與滋養(yǎng)細胞的凋亡可能是子癇前期發(fā)病因素之一，其具體機制有待進一步研究。在后續(xù)研究中，將進一步探討p-p38、caspase-3、caspase-8在子癇前期動物模型中的表達，為預防和治療子癇前期提供新的理論依據。

[1]謝幸,茍文麗.婦產科學[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:64-65.

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[專業(yè)責任編輯：楊文方]

Expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia

XU Jia, LIU Duo-duo, MA Xiang-dong, CHEN bi-liang

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To investigate the expressions and significance of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of patients with preeclampsia (PE). Methods Totally 80 pregnant women delivering in department of gynecology and obstetrics in Xijing Hospital during June 2016 to February 2017 were enrolled in study, and they were divided into PE group (40 cases) and control group (40 cases). P-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta of cases in two groups were detected with immunohistochemistry and western blot. Results P-p38, caspase-3 and caspase-8 were all expressed in placenta of cases in two groups. The levels of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in cases in PE group were significantly higher than those in control group (2.18±0.04 vs 1.44±0.04, 1.72±0.03 vs 1.12±0.06, 1.59±0.04 vs 1.18±0.01) (tvalue was 71, 60 and 61, respectively, allP<0.01). Conclusion The abnormal expressions of p-p38, caspase-3 and caspase-8 in placenta are related to the increase of trophoblast apoptosis, and they may participate the pathogenesis of PE.

p-p38; caspase-3; caspase-8; preeclampsia (PE); trophoblast

2017-03-06

徐 佳(1984—)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事圍產醫(yī)學與婦科腫瘤的研究。

陳必良，教授/博導。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.024

R714.2

A

1673-5293(2017)08-0961-04