凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白酶解多肽的凝集與抑菌活性

李長平 黃 河 王 帆 鐘名其 陳潔輝 章躍陵

(汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系, 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 汕頭 515063)

凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白酶解多肽的凝集與抑菌活性

李長平 黃 河 王 帆 鐘名其 陳潔輝 章躍陵

(汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系, 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 汕頭 515063)

以凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)為研究對象, 通過分子篩層析、Tricine-SDS-PAGE、Westernblotting、凝集實(shí)驗(yàn)、抑菌實(shí)驗(yàn)和Edman N端測序等方法探索血藍(lán)蛋白酶解多肽的凝集和抑菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 血藍(lán)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后可產(chǎn)生分子量約為6—70 kD的7條多肽, 該酶解混合物對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有顯著的凝集活性, 與未酶解的血藍(lán)蛋白相比, 其凝集活性可提高4—16倍。在此基礎(chǔ)之上, 進(jìn)一步分離純化該7條多肽, 發(fā)現(xiàn)多肽-3對副溶血弧菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性, 且具有較好的濃度依賴性。在濃度為75 μg/mL時, 其抑菌率為(93.76±1.60)%, 與陰性對照組相比, 存在極顯著性差異 (P＜0.01)。進(jìn)一步研究顯示該多肽位于血藍(lán)蛋白N端α-螺旋區(qū)域。由此推測, 凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白在體外經(jīng)胰蛋白酶酶解后可產(chǎn)生具有凝集、抑菌等免疫活性的多肽, 這對研究血藍(lán)蛋白的降解機(jī)制及其在先天免疫中的作用具有重要意義。

凡納濱對蝦; 血藍(lán)蛋白; 胰蛋白酶; 酶解多肽; 凝集; 抑菌

血藍(lán)蛋白是存在于節(jié)肢動物和軟體動物中一種含銅呼吸蛋白, 近年來研究發(fā)現(xiàn)其不僅具有輸氧功能, 而且還具有酚氧化酶活性[1—3]、抗病毒[4,5]、抗菌[6—9]、溶血[10,11]和抗腫瘤[12,13]等多種免疫學(xué)功能。尤其是, 隨著對血藍(lán)蛋白研究的深入, 人們發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白還可產(chǎn)生多種功能性降解多肽。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)淡水小龍蝦(Pacifastacus leniusculus)被感染時, 其血淋巴中可產(chǎn)生1種源于血藍(lán)蛋白C-末端的抗菌肽astacidin 1。Destoumieux-Garzon等[15]從南美白對蝦(Penaeus vannamei)和南美藍(lán)對蝦(Penaeus stylirostris)的血漿中分離出PvHCt (2.7 kD, 南美白對蝦), PsHCt1 (7.9 kD, 南美藍(lán)對蝦), PsHCt 2 (8.3 kD, 南美藍(lán)對蝦)等3種具有抗真菌活性的多肽,其與血藍(lán)蛋白C-末端的相似性為95%—100%。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)[16,17]凡納濱對蝦在感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后, 其血清中出現(xiàn)分子量分別為28.5和6.0 kD的2種血藍(lán)蛋白降解新肽段, 可能具有抗菌活性。但迄今為止, 這些功能性降解多肽形成的分子機(jī)制尚不清楚, 還有待進(jìn)一步研究。

有趣的是, 我們最近發(fā)現(xiàn), 對蝦血藍(lán)蛋白功能性降解多肽的產(chǎn)生可能與胰蛋白酶的酶解有關(guān)[18]。因此, 進(jìn)一步探索對蝦血藍(lán)蛋白胰蛋白酶酶解多肽的特征及其免疫學(xué)活性, 對揭示血藍(lán)蛋白產(chǎn)生降解多肽的分子機(jī)制和尋找新的對蝦疾病免疫學(xué)防治策略等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料 凡納濱對蝦購買于廣東省汕頭市鮀浦農(nóng)貿(mào)市場, 實(shí)驗(yàn)用副溶血弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

實(shí)驗(yàn)試劑 胰蛋白酶(Trypsin)、三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、過硫酸銨(Ammonium persulphate)等購自廣州威佳科技有限公司; 十二烷基硫酸鈉(Sodi-um dodecyl sulfate)、考馬斯亮藍(lán)R-250(Coomassie brilliant blue R-250)、甘氨酸(Glycine)等試劑購自上海生物工程有限公司; 兔抗對蝦血藍(lán)蛋白多克隆抗血清為本實(shí)驗(yàn)室接種制備, 羊抗兔IgG-HRP購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司; PVDF膜為MILLIPORE公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

副溶血弧菌懸液的制備 采用課題組既往報道的方法進(jìn)行[19]。將副溶血弧菌接種、擴(kuò)培、離心、洗滌、計數(shù), 并稀釋為3.0×107CFU/mL的菌懸液, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對蝦血清的制備 參照張澤蕙等[17]的方法進(jìn)行, 用1 mL注射器直接從正常對蝦心臟抽取血淋巴, 4℃冰箱過夜, 12000 r/min離心20min, 取血清,–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Sephadex G-100柱層析純化血藍(lán)蛋白 參照Qiu等[20]的方法純化對蝦血藍(lán)蛋白。其大致流程如下: 選用Sephadex G-100按常規(guī)方法裝柱, 加入對蝦血清1.0 mL, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)洗脫,流速1 mL/min, 自動部分收集器收集血藍(lán)蛋白洗脫峰, Bradford法測定蛋白濃度, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血藍(lán)蛋白的酶解 參照Cheison等[21]的方法選用胰蛋白酶酶解血藍(lán)蛋白。其大致流程如下: 50 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)配制1—10 μg/mL胰蛋白酶溶液, 37℃恒溫水浴鍋中酶解相同體積的50 μg/mL血藍(lán)蛋白60s, 之后即刻加入還原性上樣緩沖液(0.125 mol/L Tris, pH 6.8; 0.2 mol/L DTT, 4%SDS, 20%甘油, 0.02%溴酚藍(lán)), 放入冰盒中終止反應(yīng)。

Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting

Tricine-SDS-PAGE參照Sch?gger[22]的方法進(jìn)行, 配制4%T, 3%C濃縮膠; 10%T, 3%C夾層膠和16.5%T, 3%C分離膠。取40 μL的50 μg/mL血藍(lán)蛋白酶解混合物進(jìn)行電泳, 電泳結(jié)束后, 進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色或選用半干式電轉(zhuǎn)儀根據(jù)凝膠面積按0.8 mA/cm2電轉(zhuǎn)90min。電轉(zhuǎn)后, 5%脫脂奶粉(0.02 mol/L TBS, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4)室溫封閉1h, 兔抗血藍(lán)蛋白多克隆抗血清(1:1000)和羊抗兔IgG-HRP (1: 1000)分別室溫孵育2h和1h, TTBS充分洗滌, DAB顯色拍照。

切膠回收 采用上海生物工程有限公司的PAGE膠蛋白微量回收試劑盒方法, 對血藍(lán)蛋白酶解條帶進(jìn)行切膠回收。

凝集活性分析 參照課題組前期報道的方法[23], 分實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組用TBS-Ca2+將血藍(lán)蛋白酶解混合液進(jìn)行2倍梯度稀釋, 各取 10 μL滴加在潔凈的載玻片上, 并分別在其上滴加等量待測副溶血弧菌懸液, 輕輕搖動1min。置37℃ 30min,顯微鏡觀察細(xì)菌凝集狀態(tài)。以各樣品發(fā)生凝集反應(yīng)的最高稀釋度為凝集效價, 血藍(lán)蛋白酶解混合液濃度與凝集效價的比值為凝集比活。以不添加血藍(lán)蛋白酶解混合液的TBS-Ca2+為陰性對照。

抑菌活性分析 參照Destoumieux-Garzón等[15]和Qiu等[24]報道的方法進(jìn)行。將副溶血弧菌于37℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期, 0.85% 無菌生理鹽水配制菌濃度為1×104CFU/mL的菌懸液。取20 μL膠回收蛋白進(jìn)行2倍梯度稀釋, 然后分別與等體積菌液在96孔板中混合, 置37℃搖床培養(yǎng)1h后添加100 μL LB培養(yǎng)基, 再培養(yǎng)24h, 采用酶標(biāo)儀于600 nm處測定吸光度(OD), 并按如下公式計算抑菌率: 抑菌率=(陰性對照菌OD值–實(shí)驗(yàn)組OD值)／陰性對照菌OD值×100%。生理鹽水為陰性對照, 每個樣品3個重復(fù)。

Edman N端測序分析 采用Tricine-SDSPAGE和半干式電轉(zhuǎn)技術(shù)將上述血藍(lán)蛋白酶解多肽轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 送上海生物工程有限公司進(jìn)行Edman N端測序分析。

統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理, 用方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計顯著性分析, 所有測定結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n≥3)。

2 結(jié)果

2.1 血藍(lán)蛋白及其酶解多肽特征分析

如圖 1A所示, 分子篩層析所得血藍(lán)蛋白SDSPAGE電泳表現(xiàn)為兩條電泳條帶, 分別為75和77 kD,且與兔抗血藍(lán)蛋白多克隆血清反應(yīng)呈顯著陽性。

由圖 1b可知, 血藍(lán)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后可產(chǎn)生分子量為6—70 kD的7條多肽(分別命名為多肽1—7)。且均與兔抗血藍(lán)蛋白血清呈顯著陽性。由此推測, 該7條酶解多肽均為血藍(lán)蛋白酶解多肽, 可用于下一步研究。

2.2 血藍(lán)蛋白酶解多肽凝集活性分析

選取副溶血弧菌探索血藍(lán)蛋白酶解多肽的細(xì)菌凝集活性, 結(jié)果如表 1和圖 2所示, 血藍(lán)蛋白(50 μg/ mL)經(jīng)胰蛋白酶(1、5和10 μg/mL)酶解后所得酶解多肽混合物, 可與副溶血弧菌發(fā)生明顯的凝集反應(yīng),其凝集活性為0.024—0.039 μg/mL, 為未酶解血藍(lán)蛋白的4—16倍, 其中濃度為5 μg/mL的胰蛋白酶酶解血藍(lán)蛋白所得酶解多肽混合物的凝集活性最高。

2.3 血藍(lán)蛋白酶解多肽抑菌活性分析

在上述基礎(chǔ)之上, 進(jìn)一步采用切膠回收純化血藍(lán)蛋白的7條酶解多肽進(jìn)行抑菌活性分析, 如圖 3所示, 在多肽濃度為75 μg/mL時, 多肽3對副溶血弧菌具有較好的抑菌活性, 其抑菌率約(93.76± 1.60)%, 與陰性對照組相比, 具有極顯著性差異(P＜0.01)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 隨著多肽濃度的逐步降低, 其抑菌活性表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

圖 1 凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白及其胰蛋白酶酶解多肽電泳和免疫印跡分析

表 1 血藍(lán)蛋白酶解多肽對副溶血弧菌凝集活性分析Tab. 1 Agglutinative activity of the peptides hydrolyzed from hemocyanin with trypsin against V. parahaemolyticus

選取多肽3進(jìn)一步進(jìn)行Edman N端測序分析,其N端10個氨基酸為DVQQXCKDVLY, 經(jīng)BLAST進(jìn)一步分析, 發(fā)現(xiàn)其位于凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白小亞基(序列號X82502.1)N端α-螺旋區(qū)。

3 討論

既往研究表明, 對蝦血藍(lán)蛋白是一種具有酚氧化酶活性、抗病毒、抗菌、溶血和抗腫瘤等多種免疫學(xué)功能的蛋白, 同時其可降解產(chǎn)生具有免疫學(xué)功能的降解多肽[15,25], 但迄今為止, 其降解機(jī)制尚不是很清楚?？上驳氖? 近年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)免疫分子衍生功能性降解多肽的形成可能與絲氨酸蛋白酶或蛋白酶復(fù)合體的降解有關(guān), 如人潘氏細(xì)胞(Paneth cell)中defensin-5的表達(dá)與胰蛋白酶有關(guān)[26]; 亞洲蟾蜍(Bufo bufo)胃腺體細(xì)胞中的抗菌肽buforin I可能是由胃蛋白酶介導(dǎo)H2A (a pepsin mediated)而產(chǎn)生[27]。Sheshadri等[28]發(fā)現(xiàn)血紅蛋白在天冬氨酸蛋白酶作用下可以降解產(chǎn)生抵抗間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)的抗菌肽。尤其值得一提的是, 我們在前期研究中運(yùn)用蛋白酶酶解位點(diǎn)預(yù)測軟件Ex-PASy: PeptideCutter, http://web.expasy.org/peptide_ cutter/, 發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶可能與血藍(lán)蛋白降解多肽的形成有關(guān)。同時,我們還發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦在維生素C和中藥的刺激下血藍(lán)蛋白降解多肽增加的同時胰蛋白酶表達(dá)水平也明顯上升[29]。這些研究結(jié)果提示, 對蝦血藍(lán)蛋白降解多肽的形成可能與胰蛋白酶的酶解作用密切相關(guān), 故進(jìn)一步對其進(jìn)行研究具有重要意義。

圖 2 血藍(lán)蛋白酶解多肽對副溶血弧菌凝集活性分析(×400)

圖 3 血藍(lán)蛋白酶解多肽抑菌活性分析Fig. 3 Antibacterial activity of the peptides of hemocyanin’s hydrolyzed with trypsin**表示在P＜0.01水平有顯著性差異** indicates significant difference (P＜0.01)

本研究采用Tricine-SDS-PAGE、Western-blot-ting等技術(shù)發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白在胰蛋白酶作用下可產(chǎn)生7條分子量為6—70 kD的降解多肽, 該血藍(lán)蛋白酶解多肽不僅可以與副溶血弧菌發(fā)生明顯的凝集反應(yīng), 而且與未酶解血藍(lán)蛋白相比, 其凝集活性可提高4—16倍。在此基礎(chǔ)之上, 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多肽3對副溶血弧菌具有明顯的抑菌活性, 不過與Lee等[14]發(fā)現(xiàn)的淡水小龍蝦1.9 kD的血藍(lán)蛋白降解多肽的抗菌活性相比相對較弱, 可能與物種差異、多肽大小以及純化方法等有關(guān)。尤其值得一提的是, Edma N端測序分析表明多肽3 可能源于血藍(lán)蛋白N端的α螺旋區(qū), 與Lee等[14]和Destoumieux-Garzon等[15]以及我們前期發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白功能性降解多肽來源于血藍(lán)蛋白C端的結(jié)果[17]存在明顯的差異。由此推測, 多肽3可能是一種不同來源的新的血藍(lán)蛋白功能性降解多肽。

綜上所述, 對蝦血藍(lán)蛋白在胰蛋白酶酶解后可以產(chǎn)生具有細(xì)菌凝集和抑菌活性的降解多肽, 為進(jìn)一步揭示血藍(lán)蛋白的降解機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。但其在生物內(nèi)具體的降解機(jī)制以及這些降解多肽的免疫學(xué)功能等仍需進(jìn)一步研究和探索。

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AGGLUTINATIVE AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE PEPTIDES HYDROLYZED FROM LITOPENAEUS VANNAMEI HEMOCYANIN WITH TRYPSIN

LI Chang-Ping, HUANG He, WANG Fan, ZHONG Ming-Qi, CHEN Jie-Hui and ZHANG Yue-Ling
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology, Department of Biology, Shantou University, Shantou 515063, China)

Previous studies have demonstrated antibacterial and antifungal activities of hemolymph-derived hemocyanin upon pathogen infection with unknown mechanisms. To investigate how peptides derive from hemocyanin, multiple methods including size-exclusion chromatography, Tricine-SDS-PAGE, immunoblotting, bacterial agglutinative and antibacterial assays were applied. The results showed that shrimp Litopenaeus vannamei hemocyanin could produce seven peptides via trypsin digestion, ranging from 6 to 70 kD, which could be identified by rabbit anti-shrimp hemocyanin antibody specifically. These peptides aggregated with Vibrio parahaemolyticus in vitro, whose agglutinative activity was 4—16 folds higher than that of full length hemocyanin. The peptide 3 possessed obvious antibacterial activities against V. parahaemolyticus with a antibacterial rate (93.76±1.60)% at the concentration of 75 μg/mL, which was significantly higher than that of the control group (P＜0.01). In addition, N-terminal Edman Sequencing analysis showed that the peptide 3 was located in the α-helix region of N-terminus of shrimp L. vannamei hemocyanin small subunit. These discoveries will help to understand how the hemocyanin derived peptides are formed and to establish effective strategies for shrimp disease control.

Litopenaeus vannamei; Hemocyanin; Trypsin; Hydrolyzed peptides; Agglutinative; Antimicrobial

S945.4

A

1000-3207(2017)05-1042-06

10.7541/2017.130

2016-07-20;

2016-11-10

國家自然科學(xué)基金(31372558); 廣東省自然科學(xué)基金(S2013010015190); 廣東省高等學(xué)校重大科研項目培育計劃類項目(2014GKXM043)資助 [Supported by National Natural Science Foundation of China (31372558); Natural Science Foundation of Guangdong Province (S2013010015190); National Key Growth Project of Guangdong Province College (2014GKXM043)]

李長平(1991—), 男, 河北承德人; 碩士研究生; 主要從事水產(chǎn)動物免疫生物學(xué)研究。E-mail: 14cpli@stu.edu.cn

章躍陵(1971—), 教授, 博士生導(dǎo)師; E-mail: zhangyl@stu.edu.cn