miR-375通過(guò)抑制KLF4促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

潘恩山,李煜罡,朱曉光

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科，廣州 510315)

miR-375通過(guò)抑制KLF4促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

潘恩山,李煜罡,朱曉光

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科，廣州 510315)

目的 探討miR-375在前列腺癌(PCa)細(xì)胞中的表達(dá)、作用及機(jī)制。方法 培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，Transwell分析PCa細(xì)胞的遷移和侵襲；qPCR分析miR-375、KLF4 mRNA在PCa細(xì)胞中的表達(dá)；Western blot分析KLF4蛋白在PCa細(xì)胞中的表達(dá)；生物信息學(xué)分析miR-375的靶基因，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果 miR-375在PCa中高表達(dá)，抑制miR-375的表達(dá)顯著抑制PCa細(xì)胞的遷移和侵襲；通過(guò)生物信息學(xué)分析miR-375的潛在靶基因含有KLF4，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證KLF4為miR-375的靶基因；KLF4在PCa細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，抑制miR-375的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)KLF4蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步研究表明抑制KLF4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-375 抑制物對(duì)PCa細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用。結(jié)論 miR-375抑制KLF4的表達(dá)促進(jìn)PCa的遷移和侵襲，發(fā)揮癌基因的作用；其可以作為PCa的治療靶點(diǎn)，為PCa的治療提供新的方向。

miR-375;KLF4;前列腺腫瘤;細(xì)胞運(yùn)動(dòng);腫瘤侵潤(rùn)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種嚴(yán)重威脅男性生命的惡性腫瘤，在美國(guó)、歐洲乃至全世界PCa的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中排第2位，僅次于肺癌，其導(dǎo)致的死亡排第5位[1]。PCa在中國(guó)的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，但是近年來(lái)也呈逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)全國(guó)2004-2005年第3次死因回顧抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCa導(dǎo)致的死亡排第13位，其病死率遠(yuǎn)低于世界平均水平，然而與1990-1992年死因調(diào)查結(jié)果相比病死率上升了209.84%；2003-2007 年中國(guó)PCa發(fā)病率為8.60/10萬(wàn)，病死率為3.29/10萬(wàn)，分別位列第7位和第12位，比2004-2005進(jìn)一步增加[2]。而至2011年調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCa在全部癌癥發(fā)病和死亡構(gòu)成進(jìn)一步增加[3]。PCa的發(fā)病可能與生活方式、壽命延長(zhǎng)、人口老齡化及前列腺特異性抗原(PSA)早期診斷技術(shù)的提高有關(guān)；而PCa的死亡則和初診患者已局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了根治性治療的機(jī)會(huì)相關(guān)[4]。由于PCa易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是骨轉(zhuǎn)移，所以尋找抑制PCa轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

微RNA(microRNA,miRNA)與PCa的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。有研究表明miR-146b、miR-320a等在PCa中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)PCa細(xì)胞的凋亡，抑制PCa的增殖、遷移和侵襲，在PCa中發(fā)揮抑癌基因的作用[5-6]。而miR-301a、miR-449a和miR-221等在PCa中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)能夠抑制PCa的增殖、遷移和侵襲，在PCa中發(fā)揮癌基因的作用[7-9]。以上研究表明miRNA在PCa中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用，具有很好的穩(wěn)定性和特異性，可以作為潛在的新型腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。miR-375是miRNA的一種，有研究表明miR-375在PCa組織中的表達(dá)顯著增加[10]，和PCa的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能夠作為早期診斷的標(biāo)志物[11-12]。miR-375還能通過(guò)miR-93/miR-106b/miR-375-CIC-CRABP1信號(hào)通路調(diào)節(jié)PCa的增殖[13]，但是對(duì)miR-375能否調(diào)節(jié)PCa的遷移和侵襲及其機(jī)制仍不清楚。

本研究通過(guò)檢測(cè)miR-375在PCa細(xì)胞中的表達(dá)，明確miR-375在PCa細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，同時(shí)分析miR-375作用的靶基因及信號(hào)通路，探討miR-375調(diào)節(jié)PCa的遷移和侵襲的機(jī)制，為轉(zhuǎn)移的PCa的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和PCa細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、TRIzol試劑、Lipofectamine RNAi MAX和Lipofectamine 2000、has-miR-375抑制物、has-miR-375 mimic購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；siRNA-KLF4合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；所有引物購(gòu)自上海生物工程有限公司；KLF4野生型3′-UTR和突變型3′-UTR由蘇州金唯智合成并連接到psi-CHECK-2載體；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購(gòu)自美國(guó)ABI公司；抗KLF4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；其他生化試劑購(gòu)自上海生物工程有限公司及Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RWPE-1、LNCaP、DU145和PC3均在含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素G和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度大約為80%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代。

1.2.2 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PCa細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板中(每孔大約1×105個(gè)細(xì)胞)，第2天觀察細(xì)胞融合度大約為50%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine RNAi MAX分別轉(zhuǎn)染300 nmol/L miR-NC、miR-375抑制物至PCa細(xì)胞，或者共轉(zhuǎn)染300 nmol/L miR-375抑制物和10 μmol/L siRNA-KLF4或者si-NC至PCa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine RNAi MAX說(shuō)明書。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)miRNA及相應(yīng)基因miRNA表達(dá) 收集細(xì)胞樣品，加入1 mL Trizol提取液提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit；cDNA逆轉(zhuǎn)錄采用TaqMan Reverse Transcription Reagents、200 ng總RNA及Oligo dT；操作嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明書。采用SYBR Green法用于qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為：cDNA 5.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 4.0 μL,總反應(yīng)體積為 20 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。每份樣品重復(fù)測(cè)量3次。檢測(cè)引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè) 12 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，吸凈上清后留沉淀。沉淀中直接加入細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后取出分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，恒定電流0.5 A轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后將PVDF膜放入10 mL稀釋過(guò)的抗KLF4抗體(1∶2 000)中4 ℃過(guò)夜。去除抗KLF4抗體，30 mL 1×TBST洗膜3次，每次5 min。加入10 mL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。30 mL 1×TBST洗膜3次，每次5 min，暗室進(jìn)行曝光?；叶炔捎肐mage J分析。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) PCa的遷移檢測(cè)：將Transwell侵襲小室置入24孔板中，在Transwell小室的下室加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染后的PCa細(xì)胞重懸，加入200 μL重懸液(共5×104個(gè)細(xì)胞)到Transwell小室的上室；細(xì)胞培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽將上室內(nèi)部擦干凈，小室的下表面用PBS浸泡清洗。首先以4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，然后0.1%結(jié)晶紫染色液染色，自來(lái)水沖洗3次，顯微鏡下拍照，并隨機(jī)選取6個(gè)不同區(qū)域，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)為遷移細(xì)胞數(shù)。PCa的侵襲檢測(cè)：首先在孔徑為8 μm的Transwell侵襲小室微孔膜表面均勾涂抹20 μL 0.5 g/L Matrigel人工基質(zhì)膠，37 ℃放置30 min使其聚成凝膠狀。其余操作步驟同遷移檢測(cè)。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因 miR-375使用預(yù)測(cè)軟件miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/)和Targetscan(http://www.targetscan.org)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)KLF4 mRNA可能為miR-375的靶基因。為了確定KLF4 mRNA的3′-UTR是否為miR-375的直接靶蛋白，KLF4 mRNA的野生型全長(zhǎng)3′-UTR 及突變型3′-UTR合成并連接到psi-CHECK-2載體，分別命名為KLF4-WT和KLF4-MUT。PCa細(xì)胞共轉(zhuǎn)染200 nmol/L miR-NC或miR-375抑制物和100 ng質(zhì)粒(KLF4-WT或者KLF4-MUT)，24孔板培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞裂解，海腎(Renilla)和螢火蟲(chóng)(firefly)熒光素酶熒光強(qiáng)度使用Dual-Luciferase雙熒光報(bào)告分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-375在PCa細(xì)胞中的表達(dá) 采用qPCR檢測(cè)miR-375在PCa細(xì)胞中的表達(dá)。miR-375在正常前列腺細(xì)胞RWPE-1及PCa細(xì)胞LNCaP、PC3和DU145中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、2.580±0.376、3.760±0.428和6.210±0.573，單因素方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和RWPE-1相比，LNCaP、PC3和DU145中miR-375表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中以DU145中miR-375表達(dá)量最高，采用DU145作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

a：P<0.05，與RWPE-1比較。

圖1 miR-375在RWPE-1、LNCaP、PC3和DU145中的表達(dá)

2.2 miR-375抑制物降低miR-375的表達(dá) 采用qPCR檢測(cè)miR-375抑制物對(duì)miR-375在DU145中表達(dá)的影響，結(jié)果圖2所示。miR-375在Si-NC組和miR-375抑制物組中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000和0.240±0.088，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組中miR-375表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-375抑制物能夠顯著降低miR-375在DU145中的表達(dá)。

2.3 miR-375抑制物抑制DU145細(xì)胞的遷移侵襲 Si-NC和miR-375抑制物轉(zhuǎn)染48 h后采用Transwell檢測(cè)DU145細(xì)胞的遷移和侵襲能力，圖3所示。Si-NC組和miR-375抑制物組的遷移細(xì)胞數(shù)分別(355±78)個(gè)和(168±43)個(gè)，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；表明抑制miR-375的表達(dá)能夠抑制DU145的遷移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Si-NC組和miR-375抑制物組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別(223±45)個(gè)和(110±26)個(gè)，與Si-NC組比較，miR-375抑制物組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制miR-375的表達(dá)能夠抑制DU145的侵襲。

a:P<0.05

圖2 miR-375抑制物抑制miR-375的表達(dá)

a:P<0.05

圖3 miR-375抑制物抑制DU145細(xì)胞的遷移侵襲

A：生物信息學(xué)分析KLF4 mRNA 3′UTR存在的miR-375結(jié)合位點(diǎn)；B：Western blot檢測(cè)KLF4在PCa細(xì)胞中的表達(dá)，a表示P<0.05(與RWPE-I比較)；C：KLF4-WT組和KLF4-MUT組的熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)，a表示P<0.05；D：Western blot檢測(cè)KLF4-WT+miR-NC和KLF4-WT+miR-375組KLF4蛋白表達(dá)；E：qPCR檢測(cè)KLF4-WT+miR-NC和KLF4-WT+miR-375組KLF4 mRNA表達(dá)

圖4 在DU145細(xì)胞中驗(yàn)證KLF4為miR-375的靶基因

2.4 miR-375的靶基因?yàn)镵LF4 通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)KLF4可能是miR-375的潛在靶基因，結(jié)果如圖4A所示。采用Western blot檢測(cè)KLF4在PCa細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖4B所示。KLF4在正常前列腺細(xì)胞RWPE-1及PCa細(xì)胞LNCaP、PC3和DU145中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、0.530±0.076、0.389±0.042和0.210±0.043，單因素方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與RWPE-1比較，LNCaP、PC3和DU145中KLF4的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-375和KLF4的表達(dá)趨勢(shì)相反，說(shuō)明KLF4可能被miR-375負(fù)調(diào)控。為了進(jìn)一步證明KLF4是miR-375的靶基因，采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果如圖4C所示。KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的熒光活性變化倍數(shù)分別為1.000±0.000和0.240±0.085，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KLF4-MUT+miR-NC及KLF4-MUT+miR-375組的熒光活性變化倍數(shù)分別為0.930±0.052 和0.890±0.095，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)采用qPCR檢測(cè)KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的KLF4 mRNA分別為1.000±0.000和0.940±0.054，兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果如圖4E所示。同時(shí)采用Western blot 檢測(cè)KLF4-WT+miR-NC組和KLF4-WT+miR-375組的表達(dá)發(fā)現(xiàn)KLF4蛋白表達(dá)顯著降低，結(jié)果如圖4D所示。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明miR-375可與KLF4的3′-UTR區(qū)上的位點(diǎn)結(jié)合，miR-375與KLF4存在直接調(diào)控關(guān)系。

2.5 抑制KLF4表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-375抑制物對(duì)DU145細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用 本研究發(fā)現(xiàn)miR-375抑制物能夠促進(jìn)KLF4的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。為了進(jìn)一步研究miR-375和KLF4的關(guān)系，本研究在轉(zhuǎn)染miR-375抑制物的同時(shí)轉(zhuǎn)染si-KLF4，抑制KLF4的表達(dá)，分析共轉(zhuǎn)染miR-375抑制物和si-KLF4對(duì)DU145細(xì)胞的遷移侵襲的影響。共轉(zhuǎn)染miR-375抑制物和si-KLF4能夠顯著降低KLF4的表達(dá)，結(jié)果如圖5B所示。共轉(zhuǎn)染48 h后采用Transwell檢測(cè)DU145細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-375抑制物+si-NC組和miR-375抑制物+si-KLF4組的遷移細(xì)胞數(shù)分別(141±47)個(gè)和(325±78)個(gè)，結(jié)果如圖6A～C所示。miR-375抑制物+si-NC組和miR-375抑制物+si-KLF4組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別(123±31)個(gè)和(256±48)個(gè)，結(jié)果如圖6D～F所示。和miR-375抑制物+si-NC組相比，miR-375抑制物+si-KLF4組遷移侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。抑制KLF4的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-375抑制物對(duì)DU145細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用。

A：Western blot檢測(cè)miR-NC和miR-375抑制物組KLF4的表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)共轉(zhuǎn)染miR-375抑制物和si-KLF4(或Si-NC)組KLF4的表達(dá)，a：P<0.05

圖5 不同組的KLF4表達(dá)

A～C:細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；D～F:細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

圖6 抑制KLF4表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-375抑制物對(duì)DU145細(xì)胞的遷移侵襲的抑制作用

3 討 論

本研究結(jié)果表明miR-375在PCa細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，和以往的研究相同[11]。同時(shí)本研究結(jié)果表明miR-375在DU145細(xì)胞中表達(dá)比其他PCa細(xì)胞PC3和LNCaP中的表達(dá)高，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這3種細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力從小到大依次為L(zhǎng)NCaP、PC3和DU145細(xì)胞，該結(jié)果說(shuō)明miR-375的表達(dá)和PCa的遷移和侵襲存在關(guān)系，和Nguyen等[14]研究的結(jié)果類似，其結(jié)果表明miR-375在高轉(zhuǎn)移PCa組織中表達(dá)最高，其次為低轉(zhuǎn)移PCa和未轉(zhuǎn)移PCa。

miR-375在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能扮演癌基因或者抑癌基因的作用。Shi等[15]研究表明在骨肉瘤中miR-375能夠通過(guò)抑制PIK3CA從而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，扮演抑癌基因的角色。在結(jié)腸癌中，有研究表明miR-375能夠抑制KLF4的表達(dá)從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[16]，而另有研究表明miR-375能夠抑制PHLPP1的表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的西妥昔單抗耐藥性[17]。miR-375在PCa中能夠抑制PCa細(xì)胞的增殖[13,18]，但是對(duì)遷移和侵襲的作用還不清楚。本研究結(jié)果表明miR-375抑制物能夠顯著抑制miR-375的表達(dá)，抑制miR-375的表達(dá)能夠顯著抑制PCa細(xì)胞的遷移和侵襲。從該結(jié)果來(lái)看，miR-375在PCa中發(fā)揮癌基因的作用。

為了進(jìn)一步了解miR-375在PCa中發(fā)揮癌基因的作用機(jī)制，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析表明KLF4為miR-375的潛在的作用靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證該分析，本研究采用雙熒光素酶分析驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-375+KLF4-WT組的相對(duì)熒光素酶活性顯著抑制而miR-375+KLF4-MUT組的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著變化，這表明miR-375和KLF4 3′ UTR之間存在相互聯(lián)系；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-375+KLF4-WT組的KLF4 mRNA無(wú)顯著變化，而KLF4的蛋白表達(dá)顯著降低，說(shuō)明miR-375不影響KLF4的mRNA水平，而是直接影響KLF4的翻譯。該結(jié)果表明在PCa細(xì)胞中KLF4是miR-375作用的靶基因。有研究表明在結(jié)腸癌中KLF4是miR-375作用的靶基因，影響結(jié)腸癌的增殖[16]。

KLF4在生物體中有著廣泛的功能，在腫瘤中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用。在結(jié)腸癌、胃癌及肝癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)KLF4表達(dá)降低，而在原發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌、口腔鱗癌中KLF4的表達(dá)升高。Li等通過(guò)研究證實(shí)KLF4對(duì)皮膚癌細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力具有抑制作用，KLF4在皮膚癌中可能是一個(gè)抑癌基因[19]。在肝癌中，KLF4通過(guò)結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄抑制因子共同抑制Slug的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞上表皮間質(zhì)化(EMT)進(jìn)程，抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力并發(fā)揮其抑癌作用[20]。在乳腺癌中，KLF4高表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，最終影響細(xì)胞增殖及凋亡，并促發(fā)腫瘤的形成，發(fā)揮癌基因的作用[21]。本研究表明在PCa中miR-375能夠抑制KLF4的表達(dá)，尤其在高轉(zhuǎn)移的PCa細(xì)胞DU145中，KLF4表達(dá)顯著降低。抑制miR-375表達(dá)能夠促進(jìn)KLF4的表達(dá)。抑制miR-375表達(dá)的同時(shí)抑制KLF4的表達(dá)能夠促進(jìn)PCa的遷移和侵襲，表明抑制KLF4的表達(dá)能夠促進(jìn)PCa的遷移和侵襲。Wang等[22]研究表明KLF4能夠抑制PCa的增殖、遷移和侵襲。另有研究表明，抑制KLF4的表達(dá)能夠促進(jìn)PCa細(xì)胞的遷移和侵襲[23]，與本研究結(jié)果類似。

總之，本研究表明miR-375能夠抑制KLF4的表達(dá)促進(jìn)PCa的遷移和侵襲，發(fā)揮癌基因的作用。本研究進(jìn)一步表明miR-375可以作為PCa的治療靶點(diǎn)，為PCa轉(zhuǎn)移的治療提供新的方向。

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miR-375 promotes prostate cancer cell migration and invasion by targeting KLF4

PanEnshan,LiYugang,ZhuXiaoguang

(DepartmentofUrology,TCM-IntegratedCancerofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou，Guandong510315,China)

Objective To explore the expression,role and mechanism of miR-375 in prostate cancer (PCa) cells.Methods PCa cells were cultured and transfected with plasmid,the migration and invasion of PCa were detected by Transwell;the expression of miR-375 and KLF4 mRNA were detected by qPCR;the expression of KLF4 were detect by Western blot;the potential target genes of miR-375 were analyzed by bioinformatics and verified by dual luciferase report.Results The expression of miR-375 were significantly up-regulated in the PCa;Inhibited the expression of miR-375 could significantly inhibit the migration and invasion of PCa cells.KLF4 was the potential target genes of miR-375,which verified through bioinformatics analysis and dual luciferase report.The expression of KLF4 were significantly down-regulated in the PCa.Inhibited the expression of miR-375 could significantly up-regulated the expression of KLF4.Inhibited the KLF4 expression was able to reverse the suppressive effect miR-375 has on the migration and invasion of PCa cells.Conclusion miR-375 promotes the migration and invasion of PCa via inhibiting the expression of KLF4 and play the oncogene role.MiR-375 can be used as therapeutic targets for PCa,and provide a new direction for the treatment of PCa.

microRNA 375;KLF4;prostatic neoplasms;cell movement;neoplasm invasiveness

潘恩山(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療泌尿男性疾病研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.005

R737.25

A

1671-8348(2017)23-3184-05

2017-03-28

2017-05-19)

論著·基礎(chǔ)研究