窖泥理化指標(biāo)與微生物含量相關(guān)性研究

高家坤 李靜心 何宏魁,,3 李安軍,,3 宰紅玉

窖泥理化指標(biāo)與微生物含量相關(guān)性研究

高家坤1李靜心2何宏魁1,2,3李安軍1,2,3宰紅玉1

窖泥是生產(chǎn)濃香型白酒的基礎(chǔ)，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。本研究利用qPCR技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖泥微生物含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)結(jié)合常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，pH與窖泥細(xì)菌含量呈正相關(guān)（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與窖泥細(xì)菌含量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明窖泥pH和腐殖質(zhì)含量可作為衡量微生物含量的理化指標(biāo)。

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，發(fā)酵過(guò)程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面的復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過(guò)程。在濃香型白酒窖池發(fā)酵過(guò)程中，大曲微生物、窖泥微生物與糟醅微生物區(qū)系的形成和演變左右著發(fā)酵過(guò)程中窖池內(nèi)微生物物質(zhì)能量代謝的走向，與濃香型白酒獨(dú)特風(fēng)格的形成息息相關(guān)。但長(zhǎng)期以來(lái)，由于受到科研力量分散以及技術(shù)手段落后的限制，廣大科研工作者對(duì)發(fā)酵過(guò)程中窖泥微生物區(qū)系的研究和認(rèn)識(shí)還非常有限。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種核酸定量技術(shù)，此技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中引入了熒光基團(tuán)，通過(guò)檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)過(guò)程，最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量。熒光定量PCR技術(shù)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的研究中，但在窖泥微生物中的應(yīng)用較少。張勁等使用qPCR技術(shù)對(duì)不同窖齡窖泥中主要產(chǎn)甲烷菌群進(jìn)行研究，探討了菌群含量與窖齡的關(guān)系；胡貝利用qPCR技術(shù)對(duì)古菌、細(xì)菌及相關(guān)菌群在不同酒廠不同窖齡窖泥中的拷貝數(shù)進(jìn)行了分析，這些qPCR對(duì)窖泥的研究結(jié)果為本研究提供了依據(jù)。

窖泥是生產(chǎn)濃香型白酒的基礎(chǔ)，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。本研究對(duì)濃香型白酒窖泥的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行研究，同時(shí)結(jié)合qPCR技術(shù)對(duì)窖泥微生物含量進(jìn)行分析，通過(guò)SPSS對(duì)窖池的理化指標(biāo)與微生物含量進(jìn)行相關(guān)分析，試圖尋找二者之間的相關(guān)性。

材料與方法

材料

樣品采集。隨機(jī)抽取12個(gè)窖池，每個(gè)窖池取池底窖泥250g。窖泥取樣方式為五點(diǎn)取樣法。取1g窖泥提取DNA，200g窖泥測(cè)定理化指標(biāo)，其余窖泥樣品-80℃凍存。

試驗(yàn)試劑。50×TAE溶液，上海生工Agarose M，TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒，，TAKARA SYBR Fast qPCR Mix。

試驗(yàn)儀器。UVP高級(jí)化學(xué)發(fā)光成像工作站，賽多利斯G-26C高速冷凍離心機(jī)，北京六一電泳儀，Thermo qPCR儀及耗材，Thermo離心機(jī)，Nano核酸微量測(cè)定儀。

試驗(yàn)方法

樣品總DNA的提取。樣品基因組的提取按照TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取，提取的DNA置于-20℃保存。

樣品理化指標(biāo)的測(cè)定。取200g新鮮窖泥樣，測(cè)定其水分、pH值、銨態(tài)氮、有效磷、腐殖質(zhì)、脫氫酶活性等常規(guī)理化指標(biāo)。

水分（含揮發(fā)分）測(cè)定：稱取20g新鮮窖泥樣品，置于135℃烘箱中烘干2h，取出后置于干燥器內(nèi)自然冷卻，稱量冷卻后樣品的質(zhì)量，計(jì)算窖泥水分含量。

pH測(cè)定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入50mL H2O，混勻30min后用pH計(jì)測(cè)定窖泥pH值。

銨態(tài)氮測(cè)定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入10% NaCl溶液定容至250mL，30min后吸取5mL上清液置于擴(kuò)散皿，內(nèi)圈加入2mL硼酸溶液，外圈加入2mL 40% NaOH溶液，混勻并在室溫下靜置24h， 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定并計(jì)算窖泥中銨態(tài)氮的含量。

脫氫酶活性：參考文獻(xiàn)所述方法。

有效磷的測(cè)定：參考文獻(xiàn)所述方法。

腐殖質(zhì)測(cè)定：稱取2g風(fēng)干窖泥，加入70mL堿性焦磷酸鈉溶液，沸水浴提取30min后定容至100mL。吸取5mL上清液加入等體積0.8M 重鉻酸鉀和15mL濃硫酸，沸水浴30min后加入20mL蒸餾水和鄰菲羅啉指示劑，硫酸亞鐵滴定并計(jì)算窖泥中腐殖質(zhì)的含量。

微生物含量的測(cè)定。本試驗(yàn)采用引物GJ-F 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和GJ-R 5’-ATTACCGCG GCTGCTGG-3’ 擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因，擴(kuò)增片段約177bp。以每個(gè)窖池的DNA樣品為模板進(jìn)行qPCR，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到每條窖池細(xì)菌的拷貝數(shù)。qPCR反應(yīng)體系（10uL）：2×qPCR mix 5μL，GJ-F 0.5μL，GJ-R 0.5μL，dd H2O 3μL，DNA模板1μL。qPCR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸10s，變性、退火、延伸進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后制作熔解曲線。

數(shù)據(jù)處理。使用SPSS軟件對(duì)窖泥理化指標(biāo)和窖泥細(xì)菌含量進(jìn)行相關(guān)性分析，擬找出與窖泥細(xì)菌含量相關(guān)的理化指標(biāo)。

結(jié)果與分析

窖泥理化指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)12個(gè)窖泥樣品的常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，分別測(cè)定了水分、pH值、銨態(tài)氮、腐殖質(zhì)、脫氫酶活性等常規(guī)理化指標(biāo)（表1）。結(jié)果表明，水分、有效磷、腐殖質(zhì)等常規(guī)理化指標(biāo)變化不大，pH、銨態(tài)氮和脫氫酶活性在各個(gè)窖池間有一定差距，這些指標(biāo)的差異可能是窖池間差異的主要原因。

表1 窖泥常規(guī)理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

窖泥細(xì)菌含量

使用qPCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)12個(gè)樣品窖泥中的細(xì)菌含量進(jìn)行分析檢測(cè)，分析細(xì)菌在不同窖池中的含量情況，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，各窖池細(xì)菌含量均超過(guò)109，但不同窖池間的細(xì)菌含量有所差別，細(xì)菌含量最高的5號(hào)窖池與含量最低的12號(hào)窖池之間相差接近100倍，說(shuō)明不同的窖池之間存在細(xì)菌含量的差異，這種差異可能是造成窖池間差異的直接原因。

表2 窖泥細(xì)菌的qPCR測(cè)定結(jié)果

理化指標(biāo)與細(xì)菌含量的相關(guān)性研究

使用SPSS 22.0軟件對(duì)窖泥理化指標(biāo)與細(xì)菌含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，pH和細(xì)菌含量相關(guān)性較高（圖1），達(dá)到了0.771（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與細(xì)菌含量相關(guān)性稍低，為-0.613（P＜0.05），其他理化指標(biāo)與細(xì)菌含量不具有相關(guān)性。經(jīng)分析，這是由于窖池中微生物的最適pH值為弱酸性，當(dāng)pH值偏低時(shí)總酸含量也隨之增高，影響了微生物的生長(zhǎng)，從而使得微生物含量偏低。腐殖質(zhì)是窖泥微生物的重要養(yǎng)分，微生物含量越豐富，腐殖質(zhì)的利用率越高，微生物含量越低，窖泥中腐殖質(zhì)的殘留就越高，因此腐殖質(zhì)與細(xì)菌含量呈負(fù)相關(guān)。

表3 窖池環(huán)境因子與細(xì)菌含量的相關(guān)性

圖1 pH與細(xì)菌含量的相關(guān)性

本試驗(yàn)利用qPCR技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖泥微生物含量進(jìn)行了定量，同時(shí)結(jié)合窖泥理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)pH與窖泥細(xì)菌含量呈正相關(guān)（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與窖泥細(xì)菌含量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。本試驗(yàn)的結(jié)果表明窖泥的pH和腐殖質(zhì)含量可以作為直接衡量窖泥微生物含量的理化指標(biāo)，方便了在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)窖泥的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

(作者單位：1. 安徽古井貢酒股份有限公司；2. 安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；3. 安徽瑞思威爾科技有限公司)