西瓜細菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析

楊丙燁，付丹，胡方平，蔡學清

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西瓜細菌性果斑病菌鞭毛基因的功能分析

楊丙燁，付丹，胡方平，蔡學清

（福建農(nóng)林大學植物保護學院，福州350002）

【目的】西瓜細菌性果斑病由西瓜噬酸菌(,) 引起，是一種嚴重的世界性病害。細菌的鞭毛通常被認為是細菌的運動器官，在細菌的侵染過程中也起重要作用，已有報道表明這種作用可受鞭毛蛋白基因的調(diào)控，目前西瓜細菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因的功能及其調(diào)控機理尚不清楚，本研究旨在探討該基因在鞭毛形成和致病性等生物學特性中的作用?！痉椒ā恳怨卟【吧椭虏【?號基因組DNA為模板，設計一系列引物，PCR擴增敲除基因的上下游片段，通過回收、酶切、連接、轉化等步驟構建敲除載體和互補載體，然后采用三親雜交法，根據(jù)同源重組的原理，構建基因缺失突變菌株及其互補菌株，并對其鞭毛的形態(tài)特征、致病性、過敏反應、游動性、群體感應、菌膜、生長速率、菌落形態(tài)等生物學特性進行測定；進一步提取細菌總RNA，以谷氨酰胺合成酶基因為參照來校正目標基因的表達量，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法，比較野生菌株、敲除菌株和互補菌株部分鞭毛蛋白基因、、、、、和的表達量差異?！窘Y果】通過抗性基因的篩選和PCR驗證，成功構建了果斑病菌鞭毛蛋白基因缺失突變菌株1-fliS及其互補菌株1-fliShb，并對所得菌株的生物學特性和鞭毛進行觀察，結果表明，與野生菌株相比，鞭毛蛋白基因缺失突變菌株的游動性、菌膜形成能力減弱，互補后游動性、菌膜形成能力基本恢復；缺失突變菌株對甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果實的致病性降低，互補后對西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果實的致病力完全恢復。電鏡測試顯示，突變菌株鞭毛變短，長度約為野生菌株的1/3—1/4，互補后鞭毛合成能力基本恢復，鞭毛長度約為野生菌的4/5；光學顯微鏡下，可觀察到在NA平板上的野生菌株菌落周圍有明顯的由細菌顫泳形成的特殊暈圈，而缺失突變菌株在NA平板上不能形成這種暈圈，互補后暈圈形成能力部分恢復；缺失突變菌株的生長速率比野生菌株慢，互補后生長速率沒有恢復；野生菌株、突變菌株和互補菌株在過敏性反應和群體感應方面無差異。qRT-PCR分析結果顯示，基因缺失突變后，表達量較野生菌株明顯降低，、和表達量較野生菌株明顯升高，和表達量略微上升，表達量基本不變；互補菌株中、和表達量部分恢復，、和表達量沒有恢復，與突變菌株相同。【結論】鞭毛基因對果斑病菌鞭毛絲的形成、游動性、菌膜形成能力、生長速率、菌落形態(tài)、致病性等均有調(diào)控作用。

西瓜果斑病菌（西瓜噬酸菌）；細菌性果斑病；；生物學特性

0 引言

【研究意義】西瓜噬酸菌（）可以引起包括西瓜和甜瓜在內(nèi)的葫蘆科作物細菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB），是一種嚴重的世界性病害[1]。該病一般由種子傳播，在西瓜整個生長期均可侵染，致使果肉腐爛，失去食用價值。在適宜的環(huán)境條件下，果斑病一旦暴發(fā)，難以控制，常常給瓜農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。從1987年開始，該病在中國海南、甘肅、吉林、黑龍江等地陸續(xù)被報道[3-6]。細菌的鞭毛蛋白基因與病菌的致病性相關，但是有關果斑病菌鞭毛蛋白基因的研究較少，因而開展果斑病菌鞭毛蛋白基因研究，對進一步探明該基因在果斑病菌致病性等生物學功能中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】現(xiàn)已研究表明，鞭毛蛋白基因與鞭毛的形成、菌株的游動性、毒性等有著密切的關系，如Yokoseki等對鼠傷寒沙門氏菌（）突變體的研究表明，鞭毛蛋白基因的缺失導致該菌的鞭毛變短且數(shù)量是野生菌的2倍左右[7-8]；Xu等[9]研究顯示，在假結核耶爾森菌（）中，缺失突變株鞭毛明顯變短、游動性減弱，菌膜形成能力增強，互補后菌株鞭毛長度恢復野生狀態(tài)；RADOMSKA等[10]對空腸彎曲桿菌（）的鞭毛蛋白基因研究表明，該基因的缺失導致其喪失游動性，且鞭毛變短；劉麗云等[11]研究認為，在弗氏枸櫞酸桿菌（）中缺失菌株游動性降低，可以導致巨噬細胞的黏附性減弱和細胞毒性下降?！颈狙芯壳腥朦c】果斑病菌的鞭毛蛋白基因是否具有相同或相似的生物學功能，目前尚未見報道。筆者課題組從構建的果斑病菌Tn5插入突變體庫中篩選到一株鞭毛蛋白基因（Aave_4398）被插入突變的突變株，該突變株的致病性顯著降低，該基因在果斑病菌生物學特性中的作用需要進一步明確?！緮M解決的關鍵問題】通過構建敲除載體和互補載體，獲得鞭毛蛋白基因突變株和互補菌株，分析該基因對果斑病菌生物學功能的影響，為解析果斑病菌鞭毛蛋白基因的功能，進一步明確果斑病菌的致病機理和鞭毛調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2015年10月至2017年1月在福建農(nóng)林大學植物保護學院完成。

1.1 菌株和質(zhì)粒

西瓜果斑病菌野生菌株1號（RifR）、敲除菌株1-fliS（RifR、GmR）、互補菌株1-fliShb（RifR、GmR、KmR）。大腸桿菌DH5、質(zhì)粒PBBR1MCS-2（KmR）、質(zhì)粒pMD19T-Gm由筆者實驗室保存；助手菌DH5（PRK 600）（CmR）、群體感應信號報告菌NTL4由中國農(nóng)業(yè)大學張力群教授惠贈；群體感應陽性對照菌株Ecc-1、敲除載體PK18mobsacB（KmR）由中國農(nóng)業(yè)科學院趙廷昌研究員惠贈。

1.2 培養(yǎng)基

LB、NA、KB培養(yǎng)基配制參照方中達《植病研究方法》[12]，ABM培養(yǎng)基配制參照劉鵬[13]的方法，半固體M9DCAA培養(yǎng)基參照Tremblay等[14]的方法。

1.3 引物

本試驗中所用的引物見表1。

表1 本試驗所用的引物

下劃線表示酶切位點 The restriction enzyme cutting sites were underlined

1.4 敲除載體的構建

參照《分子克隆實驗指南》[17]，分別使用引物fliSup F/R、fliSdown F/R擴增基因的上游和下游片段，回收PCR液；用限制性內(nèi)切酶R I、I分別酶切上游PCR擴增產(chǎn)物和pMD19T-Gm質(zhì)粒DNA，通過T4 ligase連接，將上游片段連接到pMD19T-Gm質(zhì)粒上，轉化至感受態(tài)細胞DH5，挑取陽性克隆子進行PCR和雙酶切驗證，并委托上海生工生物工程有限公司測序，得到質(zhì)粒pMD19T-up-Gm；同樣，將基因的下游片段連接到pMD19T-up-Gm質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒pMD19T-up- Gm-down；用限制性內(nèi)切酶R I和d III分別酶切質(zhì)粒pMD19T-up-Gm-down和敲除載體PK18mobsacB的質(zhì)粒DNA。將up-Gm-down基因片段連接到敲除載體PK18mobsacB上，轉化，挑陽性克隆子進行PCR和酶切驗證，得到的質(zhì)粒命名為PK18-up-Gm-down，即敲除載體。

1.5 基因敲除及驗證

基因敲除采用三親雜交的方法[18]；使用引物Gm F/R、fliS F/R、fliS F/fliSin、fliSupout/GENT3OUT、fliSdown out/GENT5OUT進行PCR擴增，驗證基因是否敲除。

1.6 互補菌株的構建

利用引物fliS F/R進行PCR擴增，獲得目的基因片段，用限制性內(nèi)切酶I和I分別酶切目的基因片段和質(zhì)粒PBBR1MCS-2，通過T4 ligase連接，轉化，挑取單克隆子進行PCR驗證，測序，NCBI比對，得到互補載體PBBR-fliS。采用三親雜交的方法將互補載體PBBR-fliS轉入敲除菌株1-fliS，挑選陽性克隆子進行PCR和酶切驗證。

1.7 生物學測定

1.7.1 煙草過敏性反應 參照汪新等[19]的方法，煙草葉片背面注射OD600=0.6的菌液，24 h內(nèi)觀察過敏性反應。

1.7.2 游動性測定 參照Tremblay等[14]的方法，取1 μl OD600=1.0細胞懸浮液點接于半固體M9DCAA培養(yǎng)基，28℃正置培養(yǎng)2 d或以上，比較觀察細菌的運動痕跡，測量游動半徑，使用SPSS軟件中LSD法進行單因素方差分析，比較野生菌株、敲除菌株和互補菌株之間的差異。

1.7.3 菌落形態(tài) 參照Bahar等[20]的方法，稀釋涂布NA平板，培養(yǎng)96 h后，于體式顯微鏡（Nikon SMZ800N）下觀察并拍照。

1.7.4 菌膜測定 參照Petrocelli等[21]的方法，略加改進。吸取OD600=1.5菌液150 μl，加至盛有15 ml新鮮KB液體的大試管中，并在試管中放置一個玻璃片，28℃靜置培養(yǎng)。7 d后，向培養(yǎng)液中加入750 μl 1%的結晶紫染色40 min，吸出試管中液體，用蒸餾水沖洗3次，觀察被結晶紫染色的菌膜，并拍照；另外，結晶紫染色后用1 mL的95%（v/v）乙醇脫色，在紫外分光光度計下測A570。

1.7.5 群體感應測定 參照劉鵬等[22]的方法，將待測菌液調(diào)至OD600=1.5，Ecc-1為陽性對照，每種菌液吸2 μl點接于ABM平板上，12 h后觀察結果。

1.7.6 生長曲線的測定 參照陳嬌梅[23]的方法，按1﹕1 000的比例取OD600=1.5的菌液，加到50 ml新鮮的KB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)，4 h后開始取樣并測OD600，每2 h測一次，直到進入穩(wěn)定期。

1.7.7 電鏡觀察 參照Gavin等[24]的方法，將活化后的待測菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，加無菌水沒過菌苔，靜置10 min后，將銅網(wǎng)置于菌液中吸附1—2 min，用1%磷鎢酸鉀負染后，在透射電鏡下（Hitachi，HT7700）觀察鞭毛并拍照。

1.7.8 致病性測定 甜瓜菌液浸種：參照李俊閣[25]的方法，將甜瓜種子于OD600=0.8待測菌液中浸泡20 min，放置于1%的水瓊脂上，28℃光照12 h，黑暗12 h交替培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

西瓜苗噴霧接種：參照李明明等[26]的方法，將待測菌株過夜搖培，調(diào)OD600=0.8，噴霧接種至2葉期西瓜苗，清水為對照，第3天開始觀察發(fā)病情況。

西瓜果實接種：參照蔡學清等[27]的方法，略加改進，用滅過菌的小槍頭針刺西瓜果皮造成傷口，將OD600=0.8的菌液用無菌棉涂抹在傷口上并將棉花敷于傷口上，清水對照。28℃培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況。

1.8 部分鞭毛相關基因表達量分析

在菌液OD600約為1.0時，使用TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司）提取RNA。使用Promega公司的GoScriptTMReverse Transcription system和GoTaq?qPCR Mix分別進行反轉錄和熒光定量PCR。以谷氨酰胺合成酶基因為內(nèi)參，使用Eppendorf Realplex實時定量PCR儀進行試驗。

2 結果

2.1 敲除菌株的獲得

通過PCR分別擴增基因的上下游片段，并將擴增獲得的片段分別連接到敲除載體PK18mobsacB，轉化挑取陽性克隆子，利用引物fliSup F/fliSdown R進行PCR擴增，通過凝膠電泳獲得一條大小約2 600 bp的片段，即up-Gm-down基因片段；另外，通過雙酶切得到一條約5 600 bp（PK18mobsacB）的片段和一條約2 600 bp（up-Gm-down）的片段，這表明已將基因的上下游片段連接到敲除載體PK18mobsacB上，將獲得的敲除載體命名為PK18-up-Gm-down。

通過三親雜交的方法將敲除載體PK18-up-Gm- down導入西瓜果斑病菌1號菌株中，挑取陽性克隆子，用引物Gm F/R進行PCR擴增，可以擴增得到大小855 bp的單一條帶，表明敲除載體成功導入果斑病菌中；由于引物fliS F/R位于上下游片段內(nèi)部，使用其擴增也得到大小為855 bp的條帶，為了明確被代替，在基因內(nèi)部設計fliSin引物，使用fliS F/fliSin擴增，野生菌株可以擴增得到約300 bp條帶，克隆子擴增不到相應片段，表明基因被抗性基因代替；使用引物GENT3OUT和fliSup out引物以及GENT5OUT和fliSdown out進行PCR擴增，分別得到大小1 031、942 bp單一條帶，說明敲除過程中基因交換的位置和其在基因組中的位置一致；將敲除獲得的菌株命名為1-fliS。

2.2 互補菌株的獲得

通過PCR擴增基因片段，并將擴增獲得的片段連接到互補載體PBBR1MCS-2，轉化挑取陽性克隆子，以fliS F/R為引物進行PCR擴增，得到大小605 bp單一片段。送生工測序，測序結果通過NCBI與西瓜噬酸菌基因組AAC00-1（GenBank登錄號NC-008752）進行比對，比對結果一致性為100%，互補載體構建成功，命名為PBBR-fliS。

通過三親雜交的方法將互補載體PBBR-fliS導入敲除菌株1-fliS中，挑取陽性克隆子，使用引物fliS F/R進行PCR擴增，得到大小605 bp單一片段，敲除菌株1-fliS得到855 bp的單一片段，表明基因轉入敲除菌株中；用果斑病菌特異性引物SEQID5/4m擴增，可得到與野生菌一致的單一目標條帶；將獲得的菌株命名為1-fliShb。

2.3 生物學測定

2.3.1 煙草過敏反應 煙草過敏反應測定結果表明，野生菌株、敲除菌株和互補菌株接種煙草葉片后24 h均可觀察到壞死斑。

2.3.2 菌落形態(tài)觀察 NA平板上培養(yǎng)4 d后觀察，野生菌1號菌株，中間凸起，菌落邊緣具有一圈較透明的由細菌顫泳形成的特殊暈圈；敲除菌株1-fliS菌落邊緣較光滑，沒有暈圈形成；互補菌株1-fliShb菌落邊緣也能形成較透明的暈圈，但暈圈直徑較野生菌?。▓D1）。

2.3.3 菌膜測定 敲除菌株1-fliS形成菌膜的能力明顯弱于野生菌1號菌株和互補菌株1-fliShb（圖2）；定量測定結果表明，野生菌株和互補菌株的菌膜之間沒有顯著差異（＞0.05），但與敲除菌株差異顯著（＜0.05）（圖3）。

2.3.4 游動性測定 在0.3%的半固體M9DCAA培養(yǎng)基上靜置5 d后觀察，敲除菌株1-fliS相對游動面積為0，互補菌株1-fliShb游動面積略小于野生菌株（圖4），方差分析表明，野生菌株和敲除菌株以及互補菌株和敲除菌株游動半徑之間均顯著差異（＜0.05）（表2），由此說明基因與細菌的運動性相關。

1號：野生菌株Wild strain；1-fliS：敲除菌株Deletion mutant；1-fliShb：互補菌株Complementary strain。圖2—圖11同 The same as Fig. 2- Fig. 11實心箭頭指示菌落周圍的暈圈The solid arrow pointed to bacterial haloes

圖2 不同菌株產(chǎn)生的菌膜

不同小寫字母表示差異顯著（鄧肯氏新復極差法，P＜0.05）。表2同

圖4 不同菌株的游動性測定

2.3.5 群體感應 陽性對照（CK）平均顯色直徑為3.83 cm，突變菌株1-fliS及其互補菌株1-fliShb和野生菌1號菌株沒有明顯差異，顯色平均直徑均為0.45 cm（圖5）。說明基因在西瓜果斑病菌1號菌株中，對病原菌的高絲氨酸內(nèi)酯類群體感應信號分子的分泌沒有影響。

表2 不同菌株游動性

圖5 不同菌株的群體感應信號測定

2.3.6 生長曲線 野生菌株、敲除菌株和互補菌株的生長趨勢基本一致，但野生菌1號菌株的生長速度最快，敲除菌株和互補菌株的生長速度較野生菌株慢，特別是生長初期，這可能是由于插入外源基因，菌株在生長初期受到干擾所造成的（圖6）。

圖6 西瓜果斑病菌的生長曲線

2.3.7 電鏡觀測 透射電子顯微鏡（Hitachi HT7700）觀測結果顯示，敲除菌株1-fliS鞭毛長度明顯比野生菌1號菌株的鞭毛短，約為其1/3—1/4；互補菌株1-fliShb的鞭毛長度約為野生菌株的4/5，說明互補后鞭毛合成能力基本恢復（圖7）。

2.3.8 致病性測定 甜瓜菌液浸種：浸種接種后4 d，野生菌株、敲除菌株和互補菌株處理長出的幼苗子葉均出現(xiàn)水漬狀病斑；接種后8 d，野生菌株和互補菌株處理長出的幼苗子葉全部褐變壞死，幼苗死亡，而敲除菌株1-fliS處理長出的幼苗子葉發(fā)病明顯低于野生菌株和互補菌株，清水對照未發(fā)?。▓D8）。

西瓜苗噴霧接種：西瓜苗噴霧接種后3 d，野生菌和互補菌株處理的出現(xiàn)病斑，敲除菌株處理的未見發(fā)病，接種后5 d，野生菌株處理產(chǎn)生的病斑嚴重程度較互補菌株的高，但敲除菌株處理的仍未見病斑出現(xiàn)（圖9）。

西瓜果實接種：接種后3 d，野生菌株和互補菌株處理的開始發(fā)病，敲除菌株處理和清水對照未見病斑，接種后5 d，敲除菌株1-fliS處理的發(fā)病程度明顯低于野生菌株和互補菌株處理的（圖10）。

2.4 部分鞭毛相關基因表達量分析

瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測（BioDrop）結果顯示提取細菌總RNA質(zhì)量高，可用于后續(xù)試驗。實時熒光定量PCR結果顯示，基因缺失突變后，表達量明顯降低，、和表達量明顯升高，和表達量略微上升，表達量基本不變（圖11）。其中，、和表達量在基因互補后均有所恢復，認為這3個基因表達量的變化可能與的缺失有直接關系。

實心箭頭表示鞭毛The solid arrow pointed to flagella

圖8 甜瓜浸種致病性測定（接種后8 d）

圖9 西瓜苗致病性測定（接種后5 d）

圖10 西瓜果實致病性測定（接種后5 d）

3 討論

研究表明，細菌的鞭毛蛋白基因與鞭毛的形成、菌株的游動性、毒性等有著密切的關系，然而目前關于果斑病菌鞭毛蛋白基因的生物學功能還不是十分清楚。筆者課題組曾通過構建Tn5突變體庫篩選獲得一株被插入的突變株，在此基礎上，本研究通過基因定點敲除的方法獲得該基因的敲除突變株，結果表明該基因突變導致其對西瓜、甜瓜的致病性降低，游動性、菌膜形成能力減弱等。對假結核耶爾森菌、弗氏枸櫞酸桿菌和空腸彎曲桿菌的研究結果均顯示突變菌株的游動性明顯降低[9-11]，本研究結果也顯示突變菌株1-fliS的游動性明顯弱于野生菌。Capdevila等[28]研究表明，鞭毛蛋白特異的胞漿伴侶蛋白基因的缺失可以引起多數(shù)FliC蛋白堆積在細胞質(zhì)形成包涵體而不能分泌出去，或FliC錯誤聚合或不能形成穩(wěn)定的聚合體，不能運輸?shù)郊毎鈴亩绊懻５谋廾z的形成，電鏡下表現(xiàn)為鞭毛的又短又細；Furukawa等[29]研究表明，缺失突變體中形成非折疊的FliC，其輸出被限制，表現(xiàn)為FliC的表達水平明顯增加，影響正常的鞭毛絲的形成，電鏡下也表現(xiàn)為鞭毛變短。本研究在對突變菌株進行鞭毛觀察時發(fā)現(xiàn)，敲除菌株1-fliS的鞭毛長度變短，約為野生菌株的1/3—1/4，與Capdevila等的研究結果一致[28-29]，但Yokoseki等對鼠傷寒沙門氏菌突變體的研究發(fā)現(xiàn)，插入突變基因導致鞭毛變短且數(shù)量增多[7-8]，這可能與細菌種類或鞭毛調(diào)控機制差異有關，具體原因還有待于進一步研究。另外，本試驗對缺失突變菌株和互補菌株實時定量PCR研究表明，缺失突變菌株表達量上升，表達量降低，而基因互補后，和的表達量沒有完全恢復到野生菌株的水平，在電子顯微鏡下觀察到的互補菌株的鞭毛長度也沒能完全恢復到野生菌株狀態(tài)，筆者推測鞭毛蛋白基因通過調(diào)控和的表達從而調(diào)控果斑病菌鞭毛的形成，至于對其他鞭毛基因的影響尚需進一步驗證。

圖11 部分鞭毛相關基因相對表達量檢測

大部分植物病原細菌的致病性與菌膜形成能力呈正相關，Luo等[30]通過Tn5插入突變研究表明，果斑病菌菌膜形成能力下降導致該病菌的致病性降低，本研究結果顯示，基因敲除后，導致果斑病菌的菌膜形成能力明顯低于野生菌株，從而導致該病菌的致病性降低，因而，果斑病菌的鞭毛蛋白基因與果斑病菌菌膜的形成有關，是該病菌致病的重要因子。

4 結論

獲得了果斑病菌鞭毛蛋白基因的敲除菌株和互補菌株，敲除菌株1-fliS鞭毛變短，游動性減弱，菌膜形成能力減弱，對西瓜、甜瓜致病力減弱。果斑病菌胞漿伴侶蛋白基因對該病菌鞭毛的合成、菌膜形成能力及致病性等生物學特性起重要作用。

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（責任編輯 岳梅）

Function Analysis of Flagellar Genein

YANG BingYe, Fu Dan, Hu FangPing, CAI XueQing

(College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forest University, Fuzhou 350002)

【Objective】Bacterial fruit blotch (BFB) caused by() is one of the most serious diseases in the world. Flagella are always considered as movement organ of bacteria and play an important role in their infection, and they have been reported that they could be controlled by flagellar protein gene. The function of geneinis still unclearThe objective of this study is to investigate the function of geneofineffecting on flagellum formation and pathogenicity. 【Method】 A set of primes were designed based on the genomic DNA No.1 ofwild strain. The upstream and downstream fragments knocked out genewere amplified by PCR, respectively. The gene knockout and complementary vectors were constructed through PCR amplification, recovery, digestion, connection and transformation. The strains with knockout geneand complementation were constructed with the method of triparental hybridization. Morphological characteristics of flagella, pathogenicity, hypersensitive response, motility, quorum sensing, biofilm formation, growth rate, colonial morphology, etc have been tested among the wild type, the mutant and the complementary strains. In addition, the total RNA of the bacteria was extracted, and a real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was carried out usingas an internal control for normalization. Then the expression of genes,,,,,,andin the wild type, the mutant and the complement strains were compared.【Result】The deletion mutant and complementary strain were obtained successfully by screening of gentamicin resistance and PCR verifying, named as mutant 1-fliS and complementary strain 1-fliShb. The results showed that the deletion mutant had weakened motility and biofilm formation, and the complementary strain was almost recovered. Compared with the wild strain, the pathogenicity of the mutant on watermelon and melon was reduced and the complementary strain was recovered completely. The length of flagellum of the deletion mutant was 1/3-1/4 of that of the wild strain, and the complementary strain almost recovered and it was about 4/5 of that of the wild strain. The wild strain could form typical haloes obviously by bacteria migrating via twitching on NA medium, but the deletion mutant did not form haloes on NA medium and the complementary strain recovered partially. The growth rate of deletion mutant was slower than the wild strain and the complementary strain was not recovered. There were no difference among the wild, mutant and complement strains on hypersensitive response and quorum sensing. The results of qRT-PCR showed that in the mutant the expressions of genedecreased obviously compared with the wild strain. In addition, the expressions of,andincreased obviously, the expressions ofandincreased slightly, the expressions ofwas constant compared with the wild strain, the expressions of genes,andrecovered partially in complementary strain and, the expressions of,anddid not recover. 【Conclusion】 The flagellar genecould regulate the flagellum formation, motility, biofilm formation, growth rate, colony morphology and pathogenicity of.

; bacterial fruit blotch;; biological characteristics

2017-02-08；接受日期：2017-04-05

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003066-2）、福建省自然科學基金（2014J01084）、福建農(nóng)林大學發(fā)展基金（KF2015058）、福建農(nóng)林大學科技創(chuàng)新專項基金（CXZX2016133）

楊丙燁，E-mail：913833576@qq.com。通信作者蔡學清，E-mail：caixq90@163.com