植物生長調(diào)節(jié)劑對紫霞黃櫨組織培養(yǎng)的影響

吳凡+趙蓓蓓+王浩

摘要：以紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）為材料，組培紫霞黃櫨外植體，獲得最適宜紫霞黃櫨的組培條件，得到一套紫霞黃櫨苗木資源大規(guī)模生產(chǎn)的組織培養(yǎng)技術規(guī)范。最適宜的誘導分化培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，扦插苗、一年生枝條和二年生枝條作為外植體的誘導率分別達到96.7%、93.3%和73.3%。外植體材料在5～8月適宜采集。增殖培養(yǎng)最適宜條件為以改良MS培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.4，添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA并添加1 mg/L維生素C，評價得分4.23分，增殖系數(shù)最高達到8.97。生根培養(yǎng)使用MS改良培養(yǎng)基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA時生根率達到53%。移栽以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質(zhì)，溫度控制為25 ℃，相對濕度保持在90%，移栽后組培苗成活率達到70%。使用該方法可大幅提高紫霞黃櫨增殖數(shù)量。

關鍵詞：紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）；組織培養(yǎng)；改良MS培養(yǎng)基

中圖分類號：Q943.1；S687 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2942-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.036

Abstract： Continus coggygria var. ‘Zixia was used as the material to cultivate the explants of ‘Zixia through tissue culture. Aim to obtain the optimum culture condition of ‘Zixia and study the key technology of tissue culture and rapid propagation for ‘Zixia，in order to get a set of large-scale production of ‘Zixia seedling tissue culture technical specifications. The optimum inducing differentiation medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，the sprouting rate of cutting seedling，annual branches and biennial branches were 96.7%， 93.3% and 73.3% respectively. The suitable time for obtained explants were May to August. The optimum conditions for the proliferation culture were as follows：us modified MS medium，the pH was adjusted to 5.4， add 100 μmol/L 6-BA，1 μmol/L NAA， 10 μmol/L IAA， and 1 mg/L VC. The score was 4.23 and the proliferation coefficient reached 8.97. In the rooting culture stage was use modified MS medium，add with 0.3 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA， the rooting rate was 53%. During the transplanting stage， the perlite with sterile was used as the substrate，the temperature of greenhouse was controlled at 25 ℃，the relative humidity was kept at 90%，and the survival rate of plantlet was 70%. The use of this method can greatly improve proliferation of Cotinus coggygria var. ‘Zixia.

Key words： Continus coggygria var. ‘Zixia； tissue culture； modified MS medium

紫霞黃櫨（Cotinus coggygria var. ‘Zixia）是漆樹科（Anacardiaceae）黃櫨屬（Cotinus spp.）落葉小喬木或灌木。紫霞黃櫨品種是黃櫨的實生苗中發(fā)現(xiàn)的變異株，其當年生嫩芽、葉片和枝條在整個生長季呈紫紅色，并保留了黃櫨樹種耐寒、耐旱、耐瘠薄和耐堿性土壤的生長特性[1]，當年苗高可達1 m左右，可運用于園林工程進行塊狀和帶狀種植，其長大成苗后可在庭院中孤植，也可在綠地中群植。紫霞黃櫨觀賞性佳，環(huán)境適應性強，應用范圍廣泛，其景觀效果壯觀，是良好的具有北京市綠化植物潛力的彩葉樹種資源[2]。然而，紫霞黃櫨作為黃櫨的變異株，苗木數(shù)量少，扦插繁殖成活率低，從而大大限制了其生產(chǎn)效率。

組織培養(yǎng)是良種苗木快速繁育的有效途徑[3]。張永紅[4]、李彧[5]、苗青等[6]都對黃櫨屬或漆樹科植物進行過組培研究報道。但是通過實踐探究發(fā)現(xiàn)，黃櫨和美國紅櫨的組織培養(yǎng)技術并不完全適用于紫霞黃櫨的擴繁增殖，主要存在問題有外植體消毒困難、污染率高、增殖階段增殖系數(shù)低、褐化現(xiàn)象嚴重、繼代培養(yǎng)困難、生根階段生根率低[7-11]。國內(nèi)鮮見對紫霞黃櫨進行組織培養(yǎng)方式快繁的研究，本研究通過探究消毒方法、培養(yǎng)基配方和生長調(diào)節(jié)劑對紫霞黃櫨外植體組織培養(yǎng)的影響，旨在篩選出一整套最適宜紫霞黃櫨外植體組織培養(yǎng)的條件，提高其快繁效率，為北京市提供大量優(yōu)質(zhì)的彩葉綠化資源。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

紫霞黃櫨苗木材料由北京市黃垡苗圃提供，分別剪取生長健康、長勢良好的成年植株上的一年生嫩枝、芽和二年生硬枝作為材料。獲得紫霞黃櫨無菌外植體的方法：實生苗一年生枝條和二年生枝條均使用75%乙醇滅菌30 s后用無菌水沖凈，HgCl2處理8 min。組培室培養(yǎng)條件均為溫度25 ℃，光照時間16 h/d，光照度2 000 lx。

1.2 藥品和設備

6-BA、NAA、IAA、2，4-D等藥品采購于Sigma aldrich公司；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備公司；YS-CZ-DD單人超凈工作臺、YS-LED-18照明燈管：易生石木（北京）生物科技有限公司。SYQ-DSX-280A高溫高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。PLT-250培養(yǎng)瓶：濟南普朗特生物科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 誘導分化培養(yǎng)基設計 誘導分化培養(yǎng)基采用MS基礎培養(yǎng)基，分別選取1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA，0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L NAA，采用雙因素隨機區(qū)組試驗設計法（表1），添加30 mg/L蔗糖，6 g/L瓊脂并將pH調(diào)至5.7，將滅菌后的外植體材料接入誘導分化培養(yǎng)基，每個處理接10個外植體，平行重復3次。

1.3.2 繼代增殖培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基選擇 將誘導分化后的外植體分別接入DKW、WPM、MS、1/2 MS、MS改良基礎培養(yǎng)基，并添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.7，每個處理接10個外植體，平行重復3次。

1.3.3 培養(yǎng)基pH對外植體增殖的影響 選用改良MS培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH分別調(diào)至4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0。

1.3.4 繼代培養(yǎng)基添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑正交試驗 根據(jù)正交試驗設計表[12]設計四因素四水平正交試驗，分別選取0、1、10、100 μmol/L 4種濃度水平的6-BA、NAA、IAA、2，4-D 4種植物生長調(diào)節(jié)劑。將紫霞黃櫨無菌外植體莖段接入MS改良培養(yǎng)基，并按照表1添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑，30 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，調(diào)節(jié)pH至5.6～5.8。每瓶接種1個莖段，每個處理共接10個外植體，平行重復3次。

1.3.5 生根培養(yǎng)基設計 將長勢良好的紫霞黃櫨外植體轉(zhuǎn)入MS改良培養(yǎng)基中，添加30 g/L蔗糖，6 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.4，然后分別添加0.1、0.2 mg/L NAA，0.1、0.2、0 mg/L IBA進行雙因素隨機區(qū)組生根培養(yǎng)試驗，每個處理接10個外植體，平行重復3次。培養(yǎng)30 d對比生根情況。

1.3.6 生根苗移栽 取出生根的紫霞黃櫨組培苗，洗凈培養(yǎng)基，栽入營養(yǎng)缽中，基質(zhì)為珍珠巖，生根苗溫室溫度控制在25 ℃，空氣相對濕度90%，移栽后30 d統(tǒng)計成活率。

1.4 統(tǒng)計與分析

外植體分化培養(yǎng)，組培苗增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)每3 d定時進行觀察統(tǒng)計，測定其出芽率、增殖系數(shù)和生根率。分別于培養(yǎng)后15 d和30 d時統(tǒng)計生長狀況。

污染率=（污染株數(shù)/接種總數(shù)）×100%

成活率=（成活個數(shù)/接種總數(shù)）×100%（受污染的外植體視為死亡）

出芽率=（出芽株數(shù)/接種總數(shù)）×100%

增殖系數(shù)=（試驗后叢生芽數(shù)量/試驗前叢生芽數(shù)量）×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

試驗數(shù)據(jù)分析采用IMB SPSS Statistics 19軟件進行單因素方差分析[13]；正交試驗數(shù)據(jù)采用Minitab 17軟件進行正交試驗數(shù)據(jù)分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NAA、6-BA對外植體叢生芽誘導的影響

使用紫霞黃櫨一年生嫩枝作為外植體時，誘導培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。對照組誘導率為13.33%，說明一年生嫩枝材料適宜誘導培養(yǎng)。但添加植物生長調(diào)節(jié)劑后大部分處理誘導效果均沒有扦插苗作為外植體時誘導率高。僅1號處理添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時誘導率高，達到93.33%。2號、3號、6號、7號、11號和12號處理誘導率較高，分別達到63.3%、60.0%、56.7%、70.0%、63.3%和66.7%。

使用紫霞黃櫨二年生硬枝作為誘導材料時，結(jié)果如圖2所示。對照組誘導率為0，不能誘導出芽。所有處理的效果均不如使用扦插苗或一年生嫩枝作為材料，1號處理誘導率最高，達到73.33%。

2.2 繼代增殖培養(yǎng)基礎培養(yǎng)基選擇

不同增殖培養(yǎng)基接種紫霞黃櫨外植體培養(yǎng)試驗結(jié)果如圖3所示，在使用不同培養(yǎng)基對紫霞黃櫨外植體進行誘導時，增殖效果由好至壞依次為MS改良培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基和DKW培養(yǎng)基，增殖系數(shù)分別為6.27、3.94、2.38、0和0。

2.3 培養(yǎng)基pH對組培苗增殖的影響

不同pH培養(yǎng)基接種紫霞黃櫨外植體進行培養(yǎng)，試驗結(jié)果如圖4所示，pH由4.8～6.0逐漸升高的過程中，外植體培養(yǎng)的評價得分呈先升高再降低的趨勢。其中，在pH為5.4時增殖系數(shù)達到4.7。

2.4 繼代培養(yǎng)基添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的正交試驗

由圖5可知，1號處理4種植物生長調(diào)節(jié)劑濃度均為0，作為對照組，增殖系數(shù)為0。培養(yǎng)15 d后增殖效果最好的是14號處理，增殖系數(shù)8.97，組間偏差小，并且組培苗莖伸長明顯，長勢良好；8號和10號處理結(jié)果次之，增殖系數(shù)分別為5.47和5.50，同樣莖部伸長明顯；2號、6號、7號和13號處理增殖系數(shù)分別為3.33、4.50、4.72和3.89，其中的外植體產(chǎn)生大量愈傷組織，并在愈傷組織上產(chǎn)生不定芽，但是芽并不能向上伸長；11號、12號、15號和16號的增殖系數(shù)分別為2.33、3.85、2.67和4.16，組間差異較大，外植體生長狀態(tài)不穩(wěn)定；3號、4號、5號、9號試驗處理效果差，組培苗死亡較多，愈傷組織不明顯，不能增殖。endprint

利用Minitab進行方差分析多重比較，結(jié)果見表3。從表3可以看出，在α=0.05水平下，4種植物生長調(diào)節(jié)劑對紫霞黃櫨外植體增殖影響的大小順序為NAA>6-BA>2，4-D>IAA，相比較IAA，其余3種植物生長調(diào)節(jié)劑對紫霞黃櫨外植體的增殖具有顯著影響。

從圖6的極差分析多重比較中發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度在100 μmol/L、NAA濃度為1 μmol/L、IAA在濃度為10 μmol/L時處理效果最好。2，4-D的4種濃度處理中，0 μmol/L即不添加2，4-D時效果最好，隨著2，4-D濃度增大，極差逐漸下降并且趨勢明顯，雖然2，4-D對外植體增殖有顯著影響，但是其對于紫霞黃櫨組培苗生長起負面作用。

2.5 生根培養(yǎng)結(jié)果

如圖7所示，使用MS改良培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，不添加IBA、NAA時，生根率為0。在NAA分別為0.1、0.2 mg/L時，隨著IBA從0.1、0.2、0.3 mg/L逐漸升高，生根率也逐漸升高；在添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA時生根率最高，達到53%。

2.6 生根苗的馴化移栽

將已生根的紫霞黃櫨組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈殘留瓊脂，移栽至玻璃溫室的營養(yǎng)缽中，以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質(zhì)，溫室內(nèi)25 ℃，相對濕度保持在90%。30 d后觀察其成活情況，成活率達到70%。健壯的組培苗易于成活并且能長出新葉。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

誘導分化階段無論是一年生嫩枝、芽還是二年生硬枝都使用MS基礎培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，并取得了較好的誘導效果。相比較而言，扦插苗的整體誘導率高于一年生嫩枝和二年生硬枝，隨著6-BA和NAA濃度的逐漸升高，反而對其誘導產(chǎn)生了抑制作用?？梢酝茰y低濃度的NAA在新生芽誘導中起調(diào)控作用，高濃度的NAA對新生芽誘導的抑制性較強。

在增殖培養(yǎng)基的選擇試驗中發(fā)現(xiàn)WPM和DKW不適用于紫霞黃櫨的組織培養(yǎng)，這可能是由于其中微量元素比例不合適。在以往的黃櫨和美國紅櫨組培試驗中都使用MS培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基[15-17]，MS培養(yǎng)基適宜于大部分外植體的組培，但是對于紫霞黃櫨的增殖效果卻不理想，培養(yǎng)約15 d后外植體開始出現(xiàn)葉片發(fā)黃、萎蔫和脫落等現(xiàn)象，這有可能是氮元素過多導致的。通過改良后，得到改良MS培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)階段較適宜紫霞黃櫨增殖生長，所以當使用1/2MS或是MS改良培養(yǎng)基將大量元素減半后，組培苗的長勢明顯比使用MS培養(yǎng)基有所提高，并且不易出現(xiàn)葉片、莖段發(fā)黃死亡的現(xiàn)象。紫霞黃櫨作為彩葉樹種，其葉片中葉綠素與花青素、胡蘿卜素的比例較小，葉片中葉綠素含量和其他具體成分與生長機理尚未探明，有待進一步研究。

從試驗結(jié)果可以看出，紫霞黃櫨外植體在4.5～6.0的pH條件下都可以存活，但是在pH為4.5、4.8和6.0時存活情況較差，并且不能增殖；在pH為5.1～5.7可較好生長，pH 5.4左右應為最佳pH，增殖系數(shù)4.7。

在4種植物生長調(diào)節(jié)劑處理的增殖培養(yǎng)正交試驗中，參照Peter等[18]的方法，選取6-BA、NAA、 IAA、2，4-D，分別采用0、1、10、100 μmol/L 4種濃度進行四因素四水平正交試驗，培養(yǎng)15 d后增殖效果最好的是14號處理，評價得分4.23分，增殖系數(shù)8.97，組間偏差小，并且組培苗莖伸長明顯，長勢良好，底部有愈傷組織形成，發(fā)生不定芽，將愈傷組織切開后可繼續(xù)培養(yǎng)并發(fā)生不定芽；8號和10號處理生長表現(xiàn)良好，并且莖部伸長明顯，這可能是由于這兩組處理中含有適量的6-BA并且有較多含量的IAA造成的。

6-BA在0～100 μmol/L范圍內(nèi)濃度越高，對組培苗生長影響越好，當使用大于100 μmol/L濃度時效果有待探討；NAA與其他3種植物生長調(diào)節(jié)劑相互作用時，在1 μmol/L濃度時對組培苗生長效果明顯，隨著NAA濃度提高，組培苗長勢減弱，并且基部容易產(chǎn)生較大的愈傷組織；IAA在10 μmol/L時最為適宜；2，4-D不添加時效果最好，隨著2，4-D濃度增加組培苗生長效果變差。通過數(shù)據(jù)分析得到的最優(yōu)組合為100 μmol/L 6-BA+1 μmol/L NAA+10 μmol/L IAA。

生根難度大一直以來是制約木本植物組培快繁的問題之一。生根培養(yǎng)階段，在MS改良培養(yǎng)基的基礎上添加0.2 mg/L NAA、0.3 mg/L IBA時生根率最高，但生根率僅有53%，尚不能滿足大量培育生產(chǎn)的要求。因為受材料數(shù)量限制，生根試驗僅用了0.1～0.3 mg/L IBA和0.1、0.2 mg/L NAA，在試驗范圍內(nèi)生根率隨著激素濃度升高而升高，后續(xù)試驗可以繼續(xù)提高2種植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度觀察組培苗生根率。

移栽階段時，實際試驗中發(fā)現(xiàn)紫霞黃櫨組培苗個體間差異大，重復性不強。從同一植株取得材料表現(xiàn)相近，其中在誘導培養(yǎng)階段長勢良好的外植體在增殖培養(yǎng)階段也會有相應地表現(xiàn)，并且在生根后移栽時易于成活。

3.2 結(jié)論

以紫霞黃櫨為材料，通過采用組織培養(yǎng)技術培育外植體，最適宜的誘導分化培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，一年生枝條和二年生枝條作為外植體的誘導率分別達到93.3%和73.3%。增殖培養(yǎng)最適宜條件為使用改良MS培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.4，同時添加100 μmol/L 6-BA、1 μmol/L NAA、10 μmol/L IAA，增殖系數(shù)最高達到8.97。生根培養(yǎng)階段使用MS改良培養(yǎng)基，添加0.3 mg/L IBA和0.2 mg/L NAA時生根率達到53%。移栽階段以消毒滅菌后的珍珠巖作為基質(zhì)，溫度控制為25 ℃，相對濕度保持在90%，移栽后組培苗成活率達到70%。使用該方法可整體大幅提高紫霞黃櫨增殖的數(shù)量，為今后大規(guī)模培育該品種苗木資源提供理論依據(jù)。endprint

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