白細(xì)胞介素-1促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞分泌促血管生成及炎癥因子

潘毛毛，呂婷，張潔塵，聶舒，繆飛，王宏偉

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院皮膚科，上海200040

潘毛毛，呂婷，張潔塵，聶舒，繆飛，王宏偉

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院皮膚科，上海200040

目的探討IL-1對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblast，HDF）的細(xì)胞抑制率、促血管生成因子和炎癥因子分泌的影響。方法CCK8法檢測(cè)不同濃度IL-1對(duì)HDF的細(xì)胞抑制率，ELISA法檢測(cè)3，10ng/m L IL-1處理HDF 24h后上清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、IL-6的表達(dá)。結(jié)果0.3、1、3、10ng/m L IL-1對(duì)HDF的抑制率分別為（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%。3、10ng/m L IL-1作用于HDF 24h后，兩組上清的VEGF、FGF水平較空白對(duì)照組均升高（FGF<0.05，VEGF<0.01），3，10ng/m l IL-1兩個(gè)濃度組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、10ng/m L IL-1兩組HDF上清中IL-6濃度較空白對(duì)照組均增加（<0.05，<0.001），且10ng/ m L IL-1組較3ng/m L組IL-6濃度更高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(<0.001)。結(jié)論IL-1可促進(jìn)HDF分泌VEGF、FGF和IL-6，提示IL-1可能通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌促血管生成和炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

人真皮成纖維細(xì)胞；白介素-1；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；白介素-6

成纖維細(xì)胞，作為合成、重塑細(xì)胞外基質(zhì)的主要效應(yīng)細(xì)胞，還通過分泌生長(zhǎng)因子和機(jī)械收縮，支持血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。白細(xì)胞介素-1 (interleukin1，IL-1)參與活化正常成纖維細(xì)胞，使其表達(dá)腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。IL-1能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrow th factor，VEGF)及其受體的表達(dá)，在腫瘤介導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮重要作用[3,4]。目前IL-1是否通過成纖維細(xì)胞分泌可溶性細(xì)胞因子，參與腫瘤血管生成和慢性炎癥反應(yīng)尚不清楚，故本研究擬通過觀察IL-1對(duì)體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblast cell，HDF）分泌VEGF、FGF、IL-6的影響，初步探討IL-1對(duì)成纖維細(xì)胞分泌促血管生成因子及炎癥因子的影響，為進(jìn)一步完善IL-1通過成纖維細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管生成和進(jìn)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及來源HDF、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基FM購(gòu)自ScienCell公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自Gibco公司；青霉素-鏈霉素購(gòu)自Invitrogen-Gibco公司；人重組IL-1 10g購(gòu)自PeproTech公司；human VEGF、IL-6ValukineELISA試劑盒購(gòu)自R＆D公司；human FGFELISA試劑盒、CCK8試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HDF細(xì)胞培養(yǎng)HDF置于含2%FBS、1%FGS、1%青霉素-鏈霉素的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%左右胰酶消化2m in，800r/min，5min離心收集下層細(xì)胞，1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)IL-1對(duì)HDF細(xì)胞抑制率：HDF以6×104個(gè)/m L，100L/孔的密度鋪96孔板，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，加入10L不同濃度（0.3，1，3，10ng/m L）的IL-1與細(xì)胞共孵育24h，加入CCK8試劑10L/孔，孵育90m in酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。細(xì)胞抑制率=（[對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/（對(duì)照組-空白組）]×100%

1.2.3 HDF上清液的制備 無血清DMEM重懸混勻HDF細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按3×105個(gè)/m L，1m L/孔的密度鋪12孔板，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24h。第2天12孔板HDF細(xì)胞棄上清，PBS沖洗2次，添加（空白對(duì)照組不添加，低濃度LC組3ng/m L，高濃度HC組10ng/m L）人重組IL-1的無血清DMEM培養(yǎng)液各1m L，37℃，5%CO2作用24h。第3天收集上清，4℃，3 000g，15m in離心，小心吸取上層液體，行雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.2.4 細(xì)胞因子的測(cè)定采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清中FGF、VEGF、IL-6水平，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作：準(zhǔn)備洗滌劑、稀釋劑、標(biāo)準(zhǔn)品母液，加入標(biāo)準(zhǔn)品

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)用單因素方差分析，<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 IL-1對(duì)HDF的形態(tài)改變和細(xì)胞抑制率200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，在0.3，1ng/m L IL-1刺激下，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無差異；在3，10ng/m L IL-1刺激下，HDF折光性增強(qiáng)，邊界銳化，細(xì)胞間連接增多，更向長(zhǎng)梭形發(fā)展，未見凋亡細(xì)胞。0.3，1，3，10ng/ m L IL-1對(duì)HDF的抑制率分別為（1.22±0.78）%，（3.72±1.21）%，（9.10±2.60）%，（14.42±3.36）%，均不超過15%，見圖1。

圖1 不同濃度IL-1處理HDF24 h后的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞抑制率

2.2 IL-1對(duì)HDF分泌促血管因子的影響低濃度LC組和高濃度HC組3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，兩組上清的FGF水平均升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=5.159，<0.05），低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LC組和HC組3，10ng/m l的IL-1作用于HDF24h后，兩組上清的VEGF水平均升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=16.23，<0.01），低濃度LC組和高濃度HC組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 IL-1對(duì)HDF分泌IL-6的影響LC組和HC組3，10ng/m L的IL-1作用于HDF 24h后，上清中IL-6濃度與對(duì)照組相比均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=50.59，LC組<0.05，HC組<0.001），高濃度的HC組與低濃度LC組相比HDF上清中IL-6升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.001)，見圖3。

圖2 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清HGF、VEGF濃度

3 討論

腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞，通過直接接觸腫瘤細(xì)胞或者分泌可溶性成分，促進(jìn)血管形成、腫瘤細(xì)胞存活和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelia-mechenchymal transition, EMT)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，是一個(gè)極具吸引力的降低腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的治療靶點(diǎn)[5]。皮膚腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)存在標(biāo)本難獲得、培養(yǎng)過程復(fù)雜、細(xì)胞不能穩(wěn)定傳代等缺點(diǎn)，而腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞是由正常成纖維細(xì)胞活化而來，因此我們選用HDF替代腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞，初步探討IL-1對(duì)體外培養(yǎng)的HDF的作用。

圖3 不同濃度IL-1作用HDF 24 h后上清IL-6濃度

Seok Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)IL-1能促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴性。我們?yōu)榱撕Y選適宜的IL-1作用濃度，檢測(cè)常用實(shí)驗(yàn)濃度IL-1對(duì)HDF的細(xì)胞抑制率，發(fā)現(xiàn)3，10ng/m L的IL-1對(duì)HDF的細(xì)胞抑制率均不足15%，且形態(tài)學(xué)上激活成纖維細(xì)胞，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采用以上兩個(gè)濃度。與既往研究不同，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)IL-1對(duì)HDF有促增殖作用，可能與選擇的成纖維細(xì)胞類型、具體濃度不同有關(guān)。

VEGF和FGF在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚胎絨毛膜實(shí)驗(yàn)的初試活化階段有協(xié)同作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化和基質(zhì)降解，是腫瘤血管生成關(guān)鍵的促血管生長(zhǎng)因子[7]。KIM等[8]研究顯示1ng/m L的IL-1刺激內(nèi)皮細(xì)胞和滑膜細(xì)胞24h后，上清中VEGF增加。我們研究發(fā)現(xiàn)3，10ng/m L的IL-1刺激HDF增強(qiáng)分泌VEGF、FGF，提示IL-1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞參與血管生成和發(fā)展，與其他學(xué)者研究結(jié)果類似，推測(cè)在皮膚腫瘤中，IL-1誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中各種成纖維細(xì)胞（包括肌成纖維細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞等活化的成纖維細(xì)胞）分泌多種促血管生成因子，直接促進(jìn)腫瘤血管生成，并參與構(gòu)建促瘤的腫瘤微環(huán)境。

最新研究證實(shí)IL-6升高與口咽部鱗癌、食管鱗癌預(yù)后不良和早期復(fù)發(fā)高度相關(guān)，IL-6主要通過JAK/ STAT3通路介導(dǎo)EMT，也通過VEGF增強(qiáng)了血管和淋巴管生成，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9]。Paik等[10]研究顯示眼眶成纖維細(xì)胞在10ng/m L IL-1刺激24h后分泌的IL-6濃度增強(qiáng)13倍。諸多研究表明，IL-1誘導(dǎo)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞合成IL-6[11]，本實(shí)驗(yàn)我們也觀察到IL-1具有刺激HDF分泌IL-6的作用，而且高濃度組分泌水平高于低濃度組，可見IL-1促進(jìn)HDF分泌IL-6可能存在濃度依賴性。本研究提示IL-1促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞成分泌大量IL-6，除了協(xié)同VEGF、FGF等參與腫瘤血管和淋巴管生成外，還可能通過IL-6誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。

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IL-1 Promotes the Secretion of Angiogenic and Inflammatory Factors in Human Dermal Fibroblast

Pan Maomao,LüTing,Zhang Jiechen,Nie Shu,M iao Fei,Wang Hongwei*
Departmentof Dermatology,Huadong HospitalAffiliated to Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China

Objective Toexplore the roleof interleukin-1(IL-1)in inhibiting thegrow th ofhuman dermal fibroblast (HDF)and in promoting HDFsecretion ofangiogenic and inflammatory factors.Methods CCK8wasapplied in detecting the grow th inhibiting rateof HDF treatedw ith IL-1 of differentconcentrationswhile ELISA wasapplied in detecting theexpression levelsofvascularendothelialgrow th factor(VEGF),fibroblastgrow th factor(FGF)and IL-6 in HDF treatedw ith 3and 10ng/ m L IL-1 for 24 hours.Results The grow th inhibiting rate of HDF treated w ith 0.3ng/m L IL-1,1 ng/m L IL-1,3 ng/m L IL-1 and 10ng/m L IL-1 was(1.22±0.78)%,(3.72±1.21)%,(9.10±2.60)%and(14.42±3.36)%respectively;theexpressions ofVEGFand FGFin3and 10ng/m l IL-1 group increased significantly andwerehigher than those inblank controlgroup(VEGF<0.01,FGF<0.05)while there existed no statisticaldifference in the expressionsbetween 3 and 10ng/m l IL-1 group;the expressions of IL-6 in 3 and 10ng/m l IL-1 group were higher than that in blank controlgroup<0.05,<0.001)while the expression of IL-6 in 10ng/m l IL-1 group wasmuch higher than that in 3ng/m l IL-1 group(<0.001).Conclusions IL-1 can promote HDFsecretion of VEGF,FGFand inflammatory cytokine IL-6,which indicates that IL-1 may promote the tumorigenesis,invasion andmetastasis..

human dermal fibroblast(HDF);interleukin-1(IL-1);fibroblastgrow th factor(FGF);vascular endothelialgrow th factor(VEGF);IL-6

2017-06-12）

（本文編輯：陳培蓮）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81572671）

王宏偉，hongweiwang2005@aliyun.com

*Corresponding author:Wang Hongwei,E-mail:hongweiwang2005@aliyun.com