血紅素加氧酶-1對大鼠體外循環(huán)術(shù)后肺組織抗炎性損傷的研究

生偉 潘麗華 池一凡 孫龍 牛兆倬 林明山

基礎(chǔ)研究

血紅素加氧酶-1對大鼠體外循環(huán)術(shù)后肺組織抗炎性損傷的研究

生偉 潘麗華 池一凡 孫龍 牛兆倬 林明山

目的 觀察鈷原卟啉誘導(dǎo)肺組織血紅素加氧酶-1（HO-1）表達在大鼠體外循環(huán)術(shù)后肺組織損傷中發(fā)揮的抗炎性損傷作用，并對其作用機制進行分析。方法 雄性Wistar大鼠144只，隨機分為3組：A組（對照組）、B組（鈷原卟啉，CoPP）、C組［鈷原卟啉（CoPP）+鋅原卟啉（ZnPP）］。建立改良大鼠體外循環(huán)肺損傷模型。制模前24 h，A組大鼠腹腔注射生理鹽水，B組腹腔注射CoPP（5 mg/kg），C組腹腔注射CoPP（5 mg/kg）和ZnPP（5 mg/kg）。制模成功后采用斷頸法分別于體外循環(huán)前（T0），體外循環(huán)結(jié)束即刻（T1），體外循環(huán)后2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）將大鼠處死，每個時間點8只。取肺組織檢測相應(yīng)的指標(biāo)。用多聚甲醛固定部分右肺組織，然后用石蠟包埋,以用于HO-1蛋白表達的免疫組化方法測定。剩余肺組織置于液氮中凍存?zhèn)溆茫糜跈z測肺組織勻漿膽紅素的含量，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）表達。結(jié)果 B組大鼠肺組織中HO-1蛋白表達在體外循環(huán)（CPB）開始前后均有明顯增加，其活性測定結(jié)果與蛋白表達結(jié)果一致，在各時間點均強于A組和C組（P＜0.05）；各組HO-1蛋白表達在T2期最高，A、B、C三組分別為0.1852±0.070、0.2873±0.091、0.1917±0.082。B組大鼠肺組織TNF-α含量在CPB后各時間點均低于A組和C組（P＜0.05）；三組TNF-α的含量在T2期最高，分別為（480.42±41.67）pg/ml、（358.19±32.35）pg/ml、（466.53±39.42）pg/ml。結(jié)論 CoPP可以誘導(dǎo)肺組織HO-1的高表達，而且經(jīng)過CPB后仍保持較高的表達。內(nèi)源性HO-1高表達在體外循環(huán)肺損傷中具有抗炎作用，可有效抑制TNF-α炎性細(xì)胞因子分泌，從而減輕體外循環(huán)術(shù)后肺的炎性損傷。

血紅素加氧酶-1； 體外循環(huán)； 肺損傷； 炎癥反應(yīng)

血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase 1，HO-1）作為一種內(nèi)源性的保護基因[1]，在肺臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用。本實驗旨在研究HO-1在體外循環(huán)術(shù)后對肺組織炎性損傷發(fā)揮的保護作用，并探討其發(fā)揮保護作用可能的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 本實驗以雄性Wistar大鼠為研究對象，共144只，體重250～350 g，由青島市藥品檢驗所動物實驗中心提供。按照隨機原則將大鼠分為3組，每組48只。A組（對照組，n=48）：模型建立前24 h腹腔注射生理鹽水；B組［鈷原卟啉（CoPP）組，n=48］：模型建立前24 h腹腔注射CoPP（5 mg/kg）；C組［鈷原卟啉（CoPP）+鋅原卟啉（ZnPP）組，n=48］：模型建立前24 h腹腔注射CoPP（5 mg/kg）和ZnPP（5 mg/kg）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 改良大鼠體外循環(huán)肺損傷模型的建立：采用復(fù)合誘導(dǎo)麻醉，通過右側(cè)頸內(nèi)動脈和頸靜脈通路建立體外循環(huán)（CPB）。貯血器置于大鼠心臟平面以下40 cm左右，靜脈血經(jīng)過變溫器變溫,膜肺氧合后通過蠕動泵灌注進入右側(cè)頸內(nèi)動脈。CPB開始前經(jīng)股靜脈置管注入肝素（500 IU/kg），全血活化凝血時間（ACT）在480 s以上才能開始轉(zhuǎn)流。胸骨正中切口，切開心包，分離主肺動脈，平均動脈壓在CPB過程中維持在55～60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。轉(zhuǎn)流漸趨平穩(wěn)，CPB開始后10 min阻斷肺動脈，停止機械通氣，并在循環(huán)50 min后開放肺動脈，將頸靜脈插管退回至右心房內(nèi)，恢復(fù)機械通氣，逐漸復(fù)溫，30 min內(nèi)肛溫達到36.0℃左右停止體外循環(huán)。改良大鼠體外循環(huán)肺損傷模型模擬圖見圖1。

1.2.2 標(biāo)本采集 建立改良大鼠CPB肺損傷模型后，采用斷頸法分別于體外循環(huán)前（T0），體外循環(huán)結(jié)束即刻（T1），體外循環(huán)后2 h（T2）、6 h（T3）、12 h（T4）、24 h（T5）各期將實驗動物殺死，每個時間點8只。取肺組織作相應(yīng)指標(biāo)檢測。打開胸腔，取右肺組織，用4%的多聚甲醛固定部分肺組織，然后石蠟包埋,以備HE染色及各指標(biāo)的免疫組織化學(xué)法測定。余肺組織置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 觀察指標(biāo) ①肺組織HO-1蛋白表達的位置及強度：采用免疫組化鏈霉素親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測，陽性表達為棕黃色顆粒。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0病理圖文分析系統(tǒng)分析圖像，隨機選擇5個不同視野，測定陽性產(chǎn)物表達的平均光密度值（OD值），HO-1蛋白陽性表達的強度用5個不同視野OD值的均值來表示。②肺組織HO-1活力測定：根據(jù)HO-1降解血紅素生成一氧化碳和膽紅素的原理，計算肺組織中生成膽紅素的量評估肺組織HO-1的活性。選擇464 nm和530 nm雙波長分光光度法測定肺組織勻漿中膽紅素生成量。膽紅素摩爾吸光系數(shù)為40 mol·L-1·cm-1，其結(jié)果用pmol·mg-1·h-1表示。③肺組織TNF-α的含量測定：稱取所需檢測肺組織50 mg置入預(yù)冷的生理鹽水中，制成10%肺組織勻漿液，分離上清液，并用液氮盡快將其冷凍，將冷凍好的上清液標(biāo)本置于-80℃的低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。各組大鼠肺組織TNF-α的含量表達測定選用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），按照檢測試劑盒具體操作說明進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)方差分析進行正態(tài)性檢驗，計量資料為正態(tài)分布，全部數(shù)據(jù)采用±s表示，各組組間、組內(nèi)數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織中HO-1蛋白表達 主要表達在細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色染色。采用免疫組化方法顯示肺組織細(xì)胞中HO-1蛋白陽性表達主要分布在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞，在肺組織血管內(nèi)皮也有少量表達。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，B組肺組織HO-1蛋白表達在CPB前后各期均顯著強于A組和C組（P＜0.05）。各組大鼠肺組織在經(jīng)過CPB后HO-1蛋白表達增加，在T2點表達最多。平均光密度值結(jié)果分析支持以上描述。免疫組化檢測的HO-1表達見表1及圖2。

2.2 肺組織HO-1活力測定 各組大鼠肺組織HO-1活力經(jīng)過CPB后逐漸增加，在T2點活力最強，其后逐漸降低。B組肺組織HO-1活力在CPB前后各期均高于A組和C組（P＜0.05）。肺組織HO-1活力測定結(jié)果與免疫組化法檢測的HO-1蛋白表達情況相一致。見表2。

2.3 肺組織TNF-α的含量測定 各組大鼠肺組織TNF-α的含量在 CPB前未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；CPB后TNF-α的含量逐漸增加，到T2點增加最明顯，之后逐漸下降。在CPB后各期，B組TNF-α的含量均低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

機體的某些組織器官以及一些細(xì)胞在一定應(yīng)激條件下，會誘導(dǎo)生成HO-1，發(fā)揮抗炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激[1,2]及抗增生、抗細(xì)胞調(diào)亡的效應(yīng)[3,4]。肺損傷（lung injury，LI）是心臟外科領(lǐng)域尤其是體外循環(huán)術(shù)后發(fā)生最早、最普遍，也是最難治療的并發(fā)癥之一[5,6]。目前有許多研究證實HO-1在肺臟疾病中發(fā)揮保護作用。大多心臟外科手術(shù)需要經(jīng)過體外循環(huán)甚至深低溫停循環(huán)這樣一個非生理過程，對于經(jīng)過這樣一個復(fù)雜的病理生理過程后，HO-1是否仍能發(fā)揮肺損傷保護作用，如果其仍能起到保護作用，其具體的機制又如何？目前國內(nèi)外研究較少。本實驗重點研究在體外循環(huán)術(shù)后肺組織炎性損傷的檢測，探討HO-1在體外循環(huán)術(shù)后對肺損傷發(fā)揮的抗炎性損傷作用，并具體研究其發(fā)揮保護作用可能的機制。

本實驗表明，在CPB前各組大鼠肺組織HO-1表達較少，表明正常情況下HO-1表達較少。CPB后大鼠肺組織HO-1表達逐漸增加，表明CPB帶來缺血再灌注損傷的同時，也啟動了HO-1表達的內(nèi)在保護系統(tǒng)。本研究表明，在CPB前及CPB后各時間點CoPP組HO-1表達明顯高于對照組，表明鈷原卟啉可以誘導(dǎo)肺組織HO-1蛋白的表達；而加入鋅原卟啉后HO-1表達與對照組無明顯差異，說明鋅原卟啉抑制了肺組織HO-1蛋白的表達。

目前已經(jīng)有大量的數(shù)據(jù)資料證實，體外循環(huán)過程中不可避免地引起諸多細(xì)胞因子的激活[7,8]。在體外循環(huán)這一非生理性的灌注過程以及其結(jié)束后的再灌注損傷過程中細(xì)胞因子在機體內(nèi)發(fā)生的變化非常大，而這些炎性物質(zhì)的變化又反過來對體外循環(huán)過程中各組織器官產(chǎn)生較為復(fù)雜的影響。體外循環(huán)過程中肺的缺血再灌注損傷是由大量細(xì)胞因子和許多炎癥介質(zhì)一起介入的一個非免疫性的炎癥損傷過程。這些炎癥介質(zhì)會導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷，在再灌注發(fā)生時會引起組織器官的損傷，發(fā)生一系列的病理改變。在釋放的眾多細(xì)胞因子中，TNF-α可能是最早釋放的一種，它也是一系列細(xì)胞因子的啟動因子[9]。本實驗表明，體外循環(huán)開始后各組大鼠肺組織炎性因子TNF-α均持續(xù)性升高，提示炎性反應(yīng)的發(fā)生。已有的實驗表明，IL-6、TNF-α能夠?qū)е路闻K早期炎癥反應(yīng)的發(fā)生，還會引起一些毒性產(chǎn)物的釋放，并會引起肺毛細(xì)血管通透性的增加、結(jié)構(gòu)和功能的改變，使肺內(nèi)炎性滲出增加和肺水腫發(fā)生，對肺臟產(chǎn)生直接的損傷[10,11]。TNF-α能夠激活一系列促炎因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，進而引發(fā)廣泛的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。與此同時，氧自由基大量產(chǎn)生，能夠使中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加，從而導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生。本研究中，三組大鼠TNF-α在體外循環(huán)后各時間點均有不同程度地升高，且在CPB術(shù)后2 h達高峰。鈷原卟啉（CoPP）組大鼠肺組織的TNF-α在體外循環(huán)后各時間點低于對照組，表明體外循環(huán)過程中確實發(fā)生了炎癥反應(yīng)。而內(nèi)源性HO-1高表達具有明顯的抗炎癥反應(yīng)的作用，它能夠使炎性細(xì)胞因子TNF-α的分泌明顯減少，因此進一步抑制其他炎性細(xì)胞的激活、炎癥刺激的遷移以及炎癥反應(yīng)過程中細(xì)胞黏附的發(fā)生發(fā)展，從而抑制肺組織炎性損傷的發(fā)生發(fā)展。而加入了鋅原卟啉（ZnPP）的大鼠肺組織的TNF-α與對照組無明顯差異，表明HO-1的這種抗炎作用可被HO-1特異性抑制劑所抑制。

表1 各組大鼠不同時間點肺組織HO-1的表達比較（±s）

表1 各組大鼠不同時間點肺組織HO-1的表達比較（±s）

注：A組：對照組；B組：鈷原卟啉（CoPP）組；C組：鈷原卟啉（CoPP）+鋅原卟啉（ZnPP）組。與本組TO時比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) T0 T1 T2 T3 T4 T5 A組 8 0.1142±0.058 0.1425±0.064a 0.1852±0.070a 0.1683±0.076a 0.1518±0.065a 0.1439±0.066aB組 8 0.1820±0.067b 0.2386±0.085ab 0.2873±0.091ab 0.2578±0.084ab 0.2375±0.087ab 0.1849±0.072abC組 8 0.1138±0.061c 0.1486±0.064ac 0.1917±0.082ac 0.1712±0.075ac 0.1572±0.069ac 0.1430±0.059ac

表2 各組大鼠不同時間點肺組織HO-1的活力測定比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點肺組織HO-1的活力測定比較（±s）

注：A組：對照組；B組：鈷原卟啉（CoPP）組；C組：鈷原卟啉（CoPP）+鋅原卟啉（ZnPP）組。與與本組TO時比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) T0 T1 T2 T3 T4 T5 A組 8 115±12 125±13a 159±14a 140±14a 135±16a 121±9aB組 8 153±15b 346±29ab 692±52ab 480±45ab 420±33ab 317±30abC組 8 121±17c 138±18ac 161±20ac 145±16ac 140±15ac 129±12ac

表3 各組大鼠肺組織TNF-α的含量測定比較（pg/ml，±s）

表3 各組大鼠肺組織TNF-α的含量測定比較（pg/ml，±s）

注：A組：對照組；B組：鈷原卟啉（CoPP）組；C組：鈷原卟啉（CoPP）+鋅原卟啉（ZnPP）組。與與與本組TO時比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) T0 T1 T2 T3 T4 T5 A組 8 120.52±11.68 345.41±31.26a 480.42±41.67a 391.75±36.35a 323.82±28.49a 230.36±25.72aB組 8 118.46±11.25 251.37±24.28ab 358.19±32.35ab 302.37±27.72ab 220.25±25.16ab 170.57±20.15abC組 8 119.32±11.39 343.45±30.28ac 466.53±39.42ac 378.83±35.12ac 317.28±27.23ac 219.67±22.46ac

綜上所述，鈷原卟啉可以誘導(dǎo)肺組織HO-1的高表達，使其活性增加，而且經(jīng)過體外循環(huán)這一復(fù)雜的病理生理過程后，仍保持較高的表達。內(nèi)源性HO-1高表達在體外循環(huán)肺損傷中具有抗炎作用，可有效抑制TNF-α炎性細(xì)胞因子分泌，從而減輕體外循環(huán)術(shù)后肺的炎性損傷。因此，通過各種途徑誘導(dǎo)HO-1在肺組織的高表達，能夠為心臟外科領(lǐng)域體外循環(huán)過程中肺功能的保護提供一種新的方法。

（本文圖片見后插二）

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Research on the anti-inflammation effect and mechanism of heme oxygenase-1 on lung injury after cardiopulmonary bypass

SHENG Wei＊，PAN Li-hua，CHI Yi-fan，et al.＊Department of Cardiovascular Surgery，Qingdao Municipal Hospital，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266071，China Corresponding author：SUN Long，E-mail：sw8011@126.com

ObjectiveThe aim of this study is to determine the anti-inflammation effects of heme oxygenase-1 on lung injury after cardiopulmonary bypass,and to investigate its probable mechanisms.Methods144 male Wistar rats were divided into 3 groups:group A（control group），group B（cobalt protoporphyrin，CoPP），group C［CoPP and zinc protoporphyrin（ZnPP）］randomly.A modified rat model of CPB-induced lung injury was established.Normal saline was injected 24 h before modified rat model establishment in group A intraperitoneally，and CoPP（5 mg/kg）in Group B，CoPP（5 mg/kg）and ZnPP（5 mg/kg）in group C respectively.After the modified rat model was established，the lung tissues were taken at different time for the relevant indicators test:before CPB（T0），0 min after CPB（T1），2 h after CPB（T2），6 h（T3），12 h（T4）and 24 h（T5）.Partial right lung tissue of rats in each group was fixed by paraformaldehyde as soon as excision，and then it was embedded in paraffin，then used for the test the expression of HO-1 protein in each group by immunohistochemistry.The rest of thelung tissue was placed in liquid nitrogen for detection of lung tissue homogenate bilirubin content，and the determination of TNF-α expression by ELISA method.ResultsThe HO-1 protein expressions in lung tissue in group B were higher than those in group A and group C in any given time interval，and the same as HO-1 activity（P＜0.05），the expressions of HO-1 protein of group A，B and C at T2 stage were 0.1852±0.070，0.2873±0.091，0.1917±0.082 respectively.TNF-α content in group B at all time point after bypass were lower than those of group A and group C（P＜0.05），the TNF-α contents of group A，B and C at T2 stage were（480.42±41.67）pg/ml，（358.19±32.35）pg/ml，（466.53±39.42）pg/ml respectively.ConclusionCoPP can induce a large amount of HO-1 expression in lung tissue，and it is still highly expressed after CPB，so as to play an important part in anti-inflammation，and reduce lung injury.

Heme oxygenase-1； Cardiopulmonary bypass； Lung injury； Inflammation reaction

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.08.025

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2017）08-0764-04

2017-01-16）

青島市衛(wèi)計委課題（項目編號：2013-WSZD012）

266071 山東省青島市，青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院心臟中心（生偉、池一凡、孫龍、牛兆倬、林明山）；威海市立醫(yī)院心內(nèi)科（潘麗華）

孫龍，E-mail：sw8011@126.com