耐力運動對大鼠心肌GR和MR表達(dá)的影響

王蘊紅+張雪琳+趙明華

摘 要：研究不同訓(xùn)練狀態(tài)大鼠心肌糖皮質(zhì)激素受體（GR）和鹽皮質(zhì)激素受體（MR）的表達(dá)規(guī)律，探討其在運動心肌適應(yīng)過程中可能產(chǎn)生的作用。方法：大鼠分別采用一次耐力運動、4周和10周的遞增負(fù)荷耐力運動訓(xùn)練方案，并在末次運動后0 h、3 h、24 h 取材，采用Western blot 方法測定左室心肌相應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果：腎上腺重量以及腎上腺/體重在4周和10周的訓(xùn)練大鼠均顯著增加；而心肌GR和MR的表達(dá)在4周遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后與安靜對照組比較顯著下降，經(jīng)過10周遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后，受體表達(dá)量與安靜對照組無明顯差異。一次、4周和10周的耐力運動對大鼠心肌p-SGK1/SGK1沒有明顯影響；但心肌HSP70的表達(dá)量隨著運動訓(xùn)練的持續(xù)，呈遞增性提高。結(jié)論：大鼠心肌GR和MR表達(dá)以及受體與配體的親和力與運動訓(xùn)練狀態(tài)有關(guān)，這些變化可能參與了運動心肌的適應(yīng)過程。

關(guān)鍵詞：運動；心肌；糖皮質(zhì)激素受體；鹽皮質(zhì)激素受體；血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1

中圖分類號：G 804.2 文章編號：1009-783X（2017）04-0375-04 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract：Objective：To characterize the expression pattern of glucocorticoid receptor （GR） and mineralocorticoid receptor （MR） of different exercise training status in hearts so as to investigate their roles in exercise -induced cardiac adaptation. Methods： Rats were subjected to either a single bout of exercise， 4-week or 10-week exercise training respectively and then euthnized at 0h， 3h and 24h after last run. Protein level of left ventricle was measured by Western blotting. Results： Adrenal weight to body weight ratio was significantly increased in 4-week and 10-week trained rats. After 4-week training， the basal expressions of GR and MR were significantly decreased， but no change was observed in GR and MR expression after 10-week of training. No change was observed in p-SGK1 to SGK1 ratio in all exercised groups， while a significant increase in the expression of HSP70 both in response to acute exercise and at the basal level in the exercise trained rats. Conclusion： The expression pattern of GR and MR， and the affinity of glucocorticoid receptor might influence with training status and these adaptive changes might be involved in exercise-induced cardiac adaptation.

Keywords： exercise； cardiac muscle； GR； MR； SGK1

糖皮質(zhì)激素是主要的應(yīng)激激素，它對心肌細(xì)胞的作用不僅由GR（glucocorticoid receptor）介導(dǎo)，還可由MR（mineralocorticoid receptor）介導(dǎo)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，GR在心臟的正常發(fā)育和功能中起關(guān)鍵的作用[3-4]，而MR則在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3，5-6]。另有研究顯示，高水平運動員安靜時糖皮質(zhì)激素水平輕微升高，而下丘腦—垂體—腎上腺對急性運動的反應(yīng)性下降[7]。這些結(jié)果提示，循環(huán)中糖皮質(zhì)激素水平與運動誘發(fā)的心肌適應(yīng)可能有關(guān)。有報道顯示，長期循環(huán)中糖皮質(zhì)激素升高是心臟病獨立的致病因素[4]，糖皮質(zhì)激素能夠誘發(fā)心肌肥大[8-9]；但也有研究認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素不僅能刺激促生長的基因表達(dá)，還能夠促進(jìn)肌肉萎縮的基因表達(dá)[2]。提示激素作用可能與相關(guān)受體介導(dǎo)的信號通路激活有關(guān)。盡管已有研究表明心肌GR表達(dá)受運動訓(xùn)練的影響[10]，但GR和MR在運動心肌表達(dá)的規(guī)律及其在運動適應(yīng)中的作用，還未見報道。而闡明GR和MR受體在運動訓(xùn)練中的表達(dá)和功能變化規(guī)律，有助于認(rèn)識糖皮質(zhì)激素在運動誘發(fā)心肌功能和結(jié)構(gòu)變化中的作用；因此，我們通過建立不同的運動訓(xùn)練動物模型，觀察大鼠心肌GR和MR及相關(guān)信號分子的激活水平在運動訓(xùn)練中的變化，探討其在運動心肌適應(yīng)過程中可能產(chǎn)生的作用。

1 研究方法

1.1 實驗方法

8周雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠120只，購自北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK（京）2012-0001]。經(jīng)過1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分組。每組10只，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食，自然采光，室溫25 ℃ 左右，相對濕度45%～55%。

研究分別采用3個跑臺運動訓(xùn)練方案。其中：一次急性運動模型參照Bedford運動方案建立，即大鼠進(jìn)行一次速度和坡度逐漸遞增的1 h耐力運動；4周和10周的運動訓(xùn)練模型則參照本實驗室以往耐力訓(xùn)練模型建立。即動物每周訓(xùn)練6 d，1 h/d，坡度、速度逐漸遞增，使4周末速度達(dá)到 25 m/min，運動時間達(dá)到60 min， 坡度10 °，該運動動物能夠出現(xiàn)心重/體重升高（見表1）。10周的運動訓(xùn)練方案在前4周同4周訓(xùn)練模型，之后繼續(xù)遞增運動負(fù)荷直到速度為 22 m/min， 坡度15 °，該訓(xùn)練方案使運動動物在第5～10周的訓(xùn)練中，受傷率和死亡率隨運動周數(shù)的增加而遞增，到10周末的運動動物訓(xùn)練負(fù)荷難以繼續(xù)增加（見表1）。模型建立后，運動動物在末次運動后的固定時間點（0 h，3 h，24 h）取材，對照組大鼠同時取材，分離心臟和腎上腺，并稱重。在預(yù)冷生理鹽水中沖洗，并分離左室心肌。采用Western blot 方法測定相應(yīng)指標(biāo)。GR、MR、pSGK1、SGK1、HSP70抗體等主要試劑購自Epitomics 和Santacruz公司。endprint

1.2 數(shù)理統(tǒng)計法

數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤或標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件對western blot結(jié)果采用雙因素方差分析，Bonferroni法多重比較；腎上腺及腎上腺重/體重2組之間比較，采用t檢驗處理，顯著性水平取P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 運動大鼠腎上腺重量變化

4周和10周的訓(xùn)練大鼠與相應(yīng)的對照組相比，心重/體重比明顯增加（2.93±0.23 VS 3.20±0.26，P<0.05；2.62±0.16 VS 3.02±0.26，P<0.01）。4周和10周的訓(xùn)練大鼠腎上腺重量以及腎上腺重與體重的比值也均顯著增加（見表2）。

2.2 運動大鼠心肌GR 和MR表達(dá)

一次急性耐力運動后心肌GR的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，而經(jīng)過4周的遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后GR的表達(dá)顯著下降（P<0.05）；但這些訓(xùn)練大鼠末次運動后GR表達(dá)水平在運動后即刻明顯升高（P<0.05）。經(jīng)過10周的遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后，大鼠心肌GR表達(dá)量與安靜對照組無明顯差異。一次急性耐力運動就能夠引起心肌MR的表達(dá)提高（P<0.05）；經(jīng)過4周耐力訓(xùn)練后MR的表達(dá)顯著下降（P<0.01），而且這些訓(xùn)練大鼠在急性運動后MR表達(dá)水平也沒有提高（運動后0 h 和3 h表達(dá)量都明顯低于安靜對照組P<0.05或P<0.01）。經(jīng)過10周的遞增負(fù)荷耐力訓(xùn)練后，大鼠心肌MR表達(dá)量與安靜對照組無明顯差異（如圖1和圖2所示）。

2.3 運動心肌血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（SGK1）的激活水平

一次急性運動后，p-SGK1/ SGK1在心肌組織中的表達(dá)沒有顯著改變，經(jīng)過4周、10周的運動訓(xùn)練的大鼠在安靜狀態(tài)和急性運動后，都沒有出現(xiàn)該比值的改變，如圖3所示。

2.4 運動心肌熱休克蛋白（HSP70）的表達(dá)

一次急性耐力運動就能夠顯著提高心肌HSP70的表達(dá)（P<0.05），在運動后24 h，心肌表達(dá)仍高達(dá)安靜組的1.5倍（P<0.05）；經(jīng)過4周耐力訓(xùn)練后的大鼠在安靜狀態(tài)下，心肌HSP70的表達(dá)高達(dá)對照組2.0倍（P <0.05）。經(jīng)過10周的耐力訓(xùn)練后，大鼠心肌表達(dá)量更進(jìn)一步升高到8倍之多，與安靜對照組相比呈極顯著差異（P <0.001），如圖4所示。

3 分析與討論

運動訓(xùn)練對下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸的激活與運動負(fù)荷量、強(qiáng)度及持續(xù)時間有關(guān)[7，10]。我們以往的實驗結(jié)果顯示，0 o坡度耐力訓(xùn)練模型的大鼠腎上腺重量和腎上腺/體重均沒有變化，而本實驗中，當(dāng)提高跑臺坡度時，腎上腺重量則顯著提高，前人的研究也證實這一點[11]，這表明運動訓(xùn)練的應(yīng)激程度與腎上腺重量增加密切相關(guān)。此外，運動訓(xùn)練所誘發(fā)的血漿腎上腺皮質(zhì)激素升高及細(xì)胞漿內(nèi)受體的結(jié)合能力也呈動態(tài)變化，長期大負(fù)荷運動的大鼠血清游離皮質(zhì)酮濃度沒有明顯變化，但糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合能力升高[12]。由此推測，運動導(dǎo)致GR和MR受體表達(dá)和活性的變化，也可能與運動訓(xùn)練量和訓(xùn)練狀態(tài)有關(guān)。

心肌存在GR 和MR兩種受體，并且都能與糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素結(jié)合；但兩受體對激素的親和力不同。由于GR對醛固酮的親和力遠(yuǎn)低于MR，只有在極大劑量醛固酮存在的情況下，GR才能產(chǎn)生醛固酮樣效應(yīng)，而MR與鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素的親和力相當(dāng)；但由于循環(huán)中糖皮質(zhì)激素水平遠(yuǎn)高于醛固酮，因此，MR主要介導(dǎo)心肌糖皮質(zhì)激素信號的調(diào)節(jié)作用[5]。由此推測，運動訓(xùn)練大鼠的心肌GR和MR主要介導(dǎo)了糖皮質(zhì)激素對心肌的作用。

糖皮質(zhì)激素直接作用于GR，通過調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)而對心肌的收縮性產(chǎn)生影響[13]，還能抑制缺血/再灌引起的心肌細(xì)胞凋亡[14]。新近的研究顯示，糖皮質(zhì)激素可直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，使心肌肥大的標(biāo)志基因ANF mRNA、β-MHC mRNA及SKA mRNA的表達(dá)升高，上調(diào)IGF-I（IGF-IR）、IL-6（IL-6R）和α1腎上腺素能受體等促進(jìn)心肌肥厚形成的受體表達(dá)[8]。目前還沒有運動誘發(fā)糖皮質(zhì)激素升高對運動心肌結(jié)構(gòu)影響的報道，僅有一項研究顯示，當(dāng)給予運動大鼠外源性糖皮質(zhì)激素時，能夠使心肌肥大更為顯著[9]；但我們的研究模型僅觀察到10周訓(xùn)練大鼠心重/體重升高，并沒有觀察到運動誘發(fā)GR和MR表達(dá)量的升高，相反，當(dāng)訓(xùn)練到4周時，心肌肥大的信號通路Akt/mTOR呈持續(xù)激活狀態(tài)，GR和MR表達(dá)卻顯著下降，而當(dāng)進(jìn)一步訓(xùn)練導(dǎo)致Akt/mTOR信號通路激活水平恢復(fù)到安靜狀態(tài)時，GR和MR表達(dá)量也恢復(fù)到安靜水平。這說明GR和MR的表達(dá)受訓(xùn)練水平和訓(xùn)練狀態(tài)的影響，而與運動誘發(fā)心肌肥大信號通路的激活水平不平衡。這種表達(dá)變化也與病理因素誘發(fā)的GR表達(dá)有明顯不同[15]，這種表達(dá)量的變化是否起到了心臟保護(hù)作用，有待于進(jìn)一步研究證實。

以往研究顯示，MR表達(dá)提高多與心臟功能的異常如心律失常、細(xì)胞凋亡、纖維化、肥大等疾病發(fā)生有關(guān)[5]，給予MR拮抗劑能夠改善這些病理過程，但有關(guān)運動誘發(fā)心肌MR表達(dá)的變化，還未見報道。本研究結(jié)果表明，運動訓(xùn)練引起心肌MR表達(dá)也隨著運動訓(xùn)練狀態(tài)而變化，提示MR也可能參與了運動心臟功能結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。為了探討MR的表達(dá)變化是否由鹽皮質(zhì)激素作用引起，我們測定了不同訓(xùn)練狀態(tài)，SGK1磷酸化水平的變化。研究顯示，SGK1的基因轉(zhuǎn)錄受鹽皮質(zhì)激素介導(dǎo)的MR所調(diào)控[16]。SGK1在TAC早期即可被激活，起到改善心肌細(xì)胞存活的作用，但慢性活化則導(dǎo)致心力衰竭及心律失常[16-17]；因此SGK1參與了病理過程中心肌功能的調(diào)節(jié)。而我們的研究結(jié)果顯示，無論是一次急性運動還是長期的耐力訓(xùn)練，心肌SGK1激活水平都沒有顯著變化，表明運動誘發(fā)的MR表達(dá)及在心臟適應(yīng)性中的作用，是由糖皮質(zhì)激素作用引起，與鹽皮質(zhì)激素受體及其介導(dǎo)的SGK1信號通路無明顯聯(lián)系。

與此相反，在我們的實驗中，隨著訓(xùn)練的繼續(xù)，運動心肌HSP70表達(dá)呈現(xiàn)遞增性的增加。有研究顯示，GR在無糖皮質(zhì)激素作用時，與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HSP90、HSP70和HSP56等伴侶蛋白結(jié)合，不具有刺激轉(zhuǎn)錄的活性，當(dāng)糖皮質(zhì)激素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，GR與HSP90 等解離并發(fā)生構(gòu)象改變，使其結(jié)合活性發(fā)生改變；因此，GR 的結(jié)合活性不僅取決于GR的數(shù)量，還與GR的配體親和力相關(guān)[18]。只有HSP90與GR 的配體結(jié)合域結(jié)合后，GR才具有對糖皮質(zhì)激素的高親和性。而GR與HSP70作用是形成GR-HSP90 復(fù)合體組件的關(guān)鍵，當(dāng)應(yīng)激誘發(fā)的HSP70與GR復(fù)合物產(chǎn)生增加時，會引起GR的親和力下降[19]。HSP70能夠通過與HIP蛋白的相互作用，抑制GR的轉(zhuǎn)錄活性[20]，由此推測，運動誘發(fā)心肌HSP70表達(dá)的升高，可能參與了GR結(jié)合活性的調(diào)節(jié)，這種抑制GR的親和力，降低GR 結(jié)合活性的作用，可能起到了對抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用。endprint

綜上所述，遞增負(fù)荷耐力運動能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞GR和MR表達(dá)量發(fā)生改變。短期耐力訓(xùn)練（4周）導(dǎo)致心肌GR和MR表達(dá)量下降，同時由于心肌HSP70表達(dá)升高，降低GR對糖皮質(zhì)激素的親和力；而較長時間的耐力訓(xùn)練（10周）通過進(jìn)一步提高HSP70表達(dá)，受體對糖皮質(zhì)激素的親和力進(jìn)一步降低而對運動訓(xùn)練產(chǎn)生適應(yīng)，其生理機(jī)制可能是避免運動誘發(fā)糖皮質(zhì)激素升高而造成心肌的損傷。

4 結(jié)論

遞增負(fù)荷耐力運動能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞GR和MR表達(dá)量和配體親和力發(fā)生改變，這種變化與運動的量、運動訓(xùn)練的持續(xù)時間和訓(xùn)練水平有關(guān)，并參與了運動誘發(fā)的心肌適應(yīng)。

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