p38 MAPK在MRP8/14誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡中的作用

王娟，陳小歡，李磊，盧夏英，姜勇

(南方醫(yī)科大學病理生理學教研室 廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣州510515)

·基礎研究·

p38 MAPK在MRP8/14誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡中的作用

王娟，陳小歡，李磊，盧夏英，姜勇

(南方醫(yī)科大學病理生理學教研室 廣東省蛋白質組學重點實驗室，廣州510515)

目的 探討p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)對髓樣相關蛋白8(MRP8)/髓樣相關蛋白14(MRP14)誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡的影響。方法 制備MRP8、MRP14、MRP8/14備用。分別取p38+/+和p38-/-細胞，隨機分為空白對照組、MRP8組、MRP14組、MRP8/14組。MRP8組、MRP14組、MRP8/14組分別加入50 μg/mL MRP8、MRP14和MRP8/14?？瞻讓φ战M加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。各組干預24、48 h，采用MTT法檢測p38+/+和p38-/-細胞活力。采用流式細胞術檢測空白對照組及MRP8/14干預24、48 h組p38+/+和p38-/-細胞凋亡率。采用MTT法檢測空白對照組、MRP8/14組以及TLR4受體抑制劑TAK242或RAGE中和抗體處理的MRP8/14(分別設為MRP8/14+TAK242組、MRP8/14+RAGE組)干預24 h p38+/+細胞活力。采用MTT法和流式細胞術檢測空白對照組、MRP8/14組以及p38激酶抑制劑SB203580處理的MRP8/14(設為MRP8/14+SB203580組)干預24 h p38+/+細胞活力和凋亡率。采用Western blotting法檢測MRP8/14干預0、1、2、4、6、8 h p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化。結果 MRP8組、MRP14組、MRP8/14組干預24、48 h p38+/+、p38-/-細胞活力均低于空白對照組(P均<0.05)，但無論MRP8/14組干預24 h還是48 h，p38-/-細胞活力明顯高于p38+/+細胞(P均<0.05)。MRP8/14干預24、48 h組p38+/+細胞凋亡率均高于空白對照組，且MRP8/14干預48 h組細胞凋亡率更高(P均<0.05)；而MRP8/14干預24、48 h組p38-/-細胞凋亡率均未見明顯變化(P均>0.05)。MRP8/14組、MRP8/14+RAGE組干預24 h p38+/+細胞活力低于空白對照組、MRP8/14+TAK242組干預24 h(P均<0.05)。MRP8/14+SB203580組干預24 h p38+/+細胞活力較MRP8/14組干預24 h明顯升高，細胞凋亡率較MRP8/14組干預24 h明顯降低(P均<0.05)。MRP8/14干預2、4、6 h p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化水平明顯高于干預0、1、8 h(P均<0.05)。結論 p38 MAPK能促進MRP8/14誘導的小鼠成纖維細胞凋亡，其機制可能與TLR4-p38 MAPK信號通路激活有關。

胚胎成纖維細胞；髓樣相關蛋白8；髓樣相關蛋白14；p38絲裂原活化蛋白激酶;細胞凋亡;小鼠

髓樣相關蛋白8(MRP8)、髓樣相關蛋白14(MRP14)是S100蛋白家族的重要成員，被認為是機體重要的內源性損傷相關模式分子，可參與眾多炎癥相關疾病的發(fā)生、發(fā)展[1～3]。S100蛋白通常以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮生物學功能[4]。一般認為，MRP8/14以異源二聚體的形式發(fā)揮生物學功能[5]。成纖維細胞可參與機體損傷修復及瘢痕形成，最近研究發(fā)現，成纖維細胞還可作為“崗哨細胞”啟動機體炎癥反應[6，7]，而MRP8、MRP14均能夠活化成纖維細胞，進而介導組織器官的損傷和纖維化過程[8，9]。關于MRP8、MRP14是否參與成纖維細胞的凋亡過程，目前尚不清楚。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是MAPK家族的重要成員之一，參與多種信號通路引起的級聯反應[10，11]。有研究顯示，MRP8/14介導的細胞凋亡可能與p38 MAPK信號通路有關[12]。2015年3月～2016年12月，本研究觀察了p38 MAPK對MRP8/14誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡的影響，現分析結果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料E.coliDE3感受態(tài)細胞由本實驗室保存。小鼠胚胎成纖維細胞p38+/+和p38-/-細胞系，由美國斯克利普斯研究所韓家淮博士饋贈，本實驗室保存。主要儀器：流式細胞儀，美國BD公司；垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；KodakIS4000R圖像工作站，美國Kodak公司。主要試劑：pET14b-MCS-MRP8、pET14b-MCS-MRP14原核表達載體，由本實驗室構建、保存；DMEM培養(yǎng)液、FBS，美國Gibco公司；LB培養(yǎng)基，美國Affymetrix公司；Ni2+-NTA-Resin，德國Qiagen公司；噻唑藍(MTT)，美國Sigma-Aldrich公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯蛋白V(Annexin V)細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Bradford蛋白定量試劑盒，北京雷根生物技術有限公司；total-p38和磷酸化p38抗體及辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗兔IgG，美國Cell Signaling Technology公司；p38 MAPK抑制劑SB203580，德國Merck公司；Toll樣受體4(TLR4)抑制劑TAK242，美國ApexBio公司；晚期糖基化終產物受體(RAGE)中和抗體，美國R&D公司。

1.2 MRP8/14制備 熱休克法將融合蛋白重組載體轉化E.coliDE3感受態(tài)細胞：取E.coliDE3感受態(tài)細胞懸液100 μL，加入pET14b-MCS-mMRP8或pET14b-MCS-mMRP14質粒50 ng，混勻，冰上放置30 min；42 ℃熱激90 s，冰上放置5 min；加入LB培養(yǎng)基900 μL，37 ℃孵育1.5 h；1 000 r/min離心5 min，吸棄上清700 μL；剩余液體均勻涂布于含氨芐青霉素的培養(yǎng)板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。蛋白純化：待培養(yǎng)板長出轉化菌斑，挑取單菌落，接種于5 mL氨芐西林陽性的LB培養(yǎng)基中過夜；按1∶100稀釋在LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，待菌液光密度(OD)值達到0.6時，加入適量IPTG(終濃度為1 mmol/L)，25 ℃搖床500 r/min繼續(xù)培養(yǎng)10 h；4 ℃ 5 000 r/min離心5 min，收集沉淀；將沉淀重懸于5 mL結合緩沖液(10 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)，冰上超聲波裂解，4 ℃ 39 000×g離心20 min，收集上清。將上清置于含Ni2+-NTA-Resin的層析柱中，分別用10倍體積的結合緩沖液和6倍體積的沖洗緩沖液(20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)洗滌，500 μL洗脫緩沖液(250 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl)洗脫重組蛋白，經PBS透析、0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，SDS-PAGE純化His-MRP8和His-MRP14融合蛋白。根據文獻[13]將MRP8與MRP14等摩爾比混合，室溫孵育30 min，即為MRP8/14。

1.3 MRP8/14對小鼠胚胎成纖維細胞活力影響的觀察 采用MTT法。分別取p38+/+和p38-/-細胞，接種于96孔板中，每孔1×104個；加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細胞充分貼壁后，吸凈舊培養(yǎng)基，加入不含FBS的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。隨機將細胞分為4組：空白對照組、MRP8組、MRP14組、MRP8/14組，每組設5個復孔。MRP8組、MRP14組、MRP8/14組每孔加入50 μg/mL MRP8、MRP14和MRP8/14，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。各組分別干預24、48 h，吸凈舊培養(yǎng)基，加入適量MTT，使其終濃度為0.5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸去孔內培養(yǎng)液，終止反應。然后加入DMSO 100 μL，搖床上低速振蕩10 min。在多光譜微孔板閱讀器上觀察各孔490 nm波長處的OD值。以OD490值代表細胞活力。

1.4 MRP8/14對小鼠胚胎成纖維細胞凋亡影響的觀察 采用流式細胞術。取p38+/+和p38-/-細胞分別按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，隨機將細胞分為空白對照組、MRP8/14干預24 h組、MRP8/14干預48 h組。當細胞生長至約90%融合時，MRP8/14干預24 h組、MRP8/14干預48 h組分別加入50 μg/mL MRP8/14干預24、48 h，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。干預結束，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞。每組各取1×106個細胞，用冰冷的PBS漂洗2次，重懸于500 μL結合緩沖液中，然后加入2 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶，室溫避光孵育15 min。PBS漂洗1次，并重懸于適量流式鞘液中，上機檢測細胞凋亡率。

1.5 TLR4、RAGE抑制劑對MRP8/14干預后p38+/+細胞活力影響的觀察 取p38+/+細胞按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，隨機將細胞分為空白對照組、MRP8/14組、MRP8/14+TAK242組、MRP8/14+RAGE組，MRP8/14+TAK242組、MRP8/14+RAGE組分別用TAK242或RAGE中和抗體封閉1 h。當細胞生長至約90%融合時，MRP8/14組、MRP8/14+TAK242組、MRP8/14+RAGE中和抗體組分別加入50 μg/mL MRP8/14干預24 h，空白對照組僅加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。按1.3中的方法收集細胞并檢測細胞活力。

1.6 p38 MAPK抑制劑對MRP 8/14干預后p38+/+細胞活力影響的觀察 取p38+/+細胞按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，隨機將細胞分為空白對照組、MRP8/14組、MRP8/14+SB203580組，其中MRP8/14+ SB203580組預先用20 μmol/L SB203580處理1 h。當細胞生長至約90%融合時，MRP8/14組、MRP8/14+ SB203580組分別加入50 μg/mL MRP8/14干預24 h，空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。分別按1.3、1.4中的方法收集細胞并檢測細胞活力和凋亡率。

1.7 MRP8/14對p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化影響的觀察 采用Western blotting法。取p38+/+細胞按5×105個/皿接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長至約90%融合時，加入50 μg/mL MRP8/14干預，分別于干預0、1、2、4、6、8 h時收集細胞，加入150 μL細胞裂解液，冰上裂解20 min。利用細胞刮刮取細胞裂解物，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白定量后，每時間點取總蛋白40 μg，行SDS-PAGE，采用半干轉移法將凝膠蛋白轉印至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的1×TBST緩沖液(20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl，0.1% 吐溫-20)室溫封閉1 h，TBST緩沖液漂洗5 min×3次；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗5 min×3次；HRP偶聯的抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液漂洗5 min×3次。ECL化學發(fā)光顯色，采用KodakIS4000R圖像工作站取像分析。

2 結果

2.1 各組干預24、48 h p38+/+及p38-/-細胞活力比較 見表1。

表1 各組干預24、48 h p38+/+及p38-/-細胞活力比較

注：與空白對照組干預24 h比較，*P<0.05；與空白對照組干預48 h相比，#P<0.05；與同組同干預時間p38+/+細胞比較，△P<0.05。

2.2 各組干預后p38+/+、p38-/-細胞凋亡率比較 見表2。

2.3 TLR4、RAGE抑制劑對MRP8/14干預后p38+/+細胞活力的影響 空白對照組p38+/+細胞

表2 各組干預后p38+/+、p38-/-細胞凋亡率比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01?；盍?.63±0.14，MRP8/14組為0.28±0.07，MRP8/14+TAK242組為0.59±0.11，MRP8/14+RAGE組為0.31±0.04。MRP8/14組、MRP8/14+RAGE組p38+/+細胞活力低于空白對照組、MRP8/14+TAK242組(P均<0.05)，而MRP8/14組與MRP8/14+RAGE組、空白對照組與MRP8/14+TAK242組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

2.4 p38 MAPK抑制劑對MRP8/14干預后p38+/+細胞活力和細胞凋亡率的影響 見表3。

表3 各組干預后p38+/+細胞活力和凋亡率比較±s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MRP8/14組比較，#P<0.05。

2.5 MRP8/14干預后p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化水平變化 MRP8/14干預0、1、2、4、6、8 h，p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化水平分別為2.77±0.25、2.80±0.20、22.1±2.52、34.71±2.02、46.00±2.18、2.50±0.50。MRP8/14干預2、4、6 h p38+/+細胞p38 MAPK磷酸化水平明顯高于干預0、1、8 h(P均<0.05)。

3 討論

MRP8和MRP14作為S100蛋白家族的成員，具有豐富的生物學功能，在多種疾病中高表達，近年來受到廣泛關注[1,2，13～16]。MRP8/14的生物學功能極其豐富，可參與細胞骨架重塑、蛋白質磷酸化、鈣離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)、中性粒細胞NADPH氧化酶調節(jié)等，對維持細胞穩(wěn)態(tài)至關重要[17～19]。生理狀態(tài)下，MRP8/14表達于中性粒細胞和單核細胞。病理狀態(tài)下，細胞內MRP8/14可被活化，釋放到細胞外，參與細胞多種生物學功能，包括啟動炎癥反應、介導細胞增殖與分化等[1,20]。已有研究證實，低濃度MRP8/14可促進細胞生長，而高濃度時(50～250 μg/mL)則誘導細胞凋亡，具有雙重作用[21，22]。

成纖維細胞是機體細胞外基質的重要組成部分，主要參與機體創(chuàng)傷修復、瘢痕形成等過程[6，7]。某些亞群的成纖維細胞能被細菌產物、損傷組織釋放產物及促炎性細胞因子等激活，通過促進細胞因子和趨化因子的合成與分泌，調動白細胞殺滅細菌[23，24]。說明成纖維細胞可參與機體的炎癥反應過程。Zhang等[25]研究發(fā)現，MRP8、MRP14可通過促進表皮成纖維細胞的活化導致真皮纖維化；Zhong等[8]研究發(fā)現，心肌細胞釋放的MRP8、MRP14能夠誘導心肌成纖維細胞活化，從而參與心臟疾病過程中心肌細胞的炎癥反應和纖維化；Wu等[26]研究亦發(fā)現，MRP8/14通過活化心肌成纖維細胞介導高血壓中心臟的炎癥和損傷。以上研究說明，MRP8/14能夠誘導多種疾病狀態(tài)下成纖維細胞的活化。但目前關于MRP8/14誘導成纖維細胞增殖和凋亡的報道相對較少。本研究結果顯示，MRP8組、MRP14組、MRP8/14組干預24、48 h p38+/+、p38-/-細胞活力均低于空白對照組，但無論MRP8/14組干預24 h還是48 h，p38-/-細胞活性明顯高于p38+/+細胞。本研究結果還顯示，MRP8/14干預24、48 h組p38+/+細胞凋亡率均高于空白對照組，且MRP8/14干預48 h組細胞凋亡率更高；而MRP8/14干預24、48 h組p38-/-細胞凋亡率均未見明顯變化。提示MRP8/14能誘導成纖維細胞凋亡。

MRP8/14發(fā)揮功能依賴于與靶細胞表面特異性受體的結合。已有報道，MRP8/14的特異性受體包括RAGE、TLR4等[13,21，27]。本研究結果顯示，MRP8/14組、MRP8/14+RAGE組p38+/+細胞活力低于空白對照組、MRP8/14+TAK242組，而MRP8/14組與MRP8/14+RAGE組、空白對照組與MRP8/14+TAK242組比較差異無統(tǒng)計學意義。說明MRP8/14主要通過與細胞膜表面的TLR4結合影響成纖維細胞活性。

p38 MAPK是MAPKs通路中的重要分支，可參與多種信號通路引起的級聯反應[10]。p38 MAPK在介導細胞凋亡中的作用機制尚不明確。有研究表明，p38 MAPK特異性抑制劑SB203580可通過調節(jié)脂多糖干預ERK信號通路活化，繼而促進中性粒細胞凋亡[28]。也有研究發(fā)現，活化的p38 MAPK能夠增強化療藥物引起的細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤效應[29]。Lee等[12]研究發(fā)現，MRP14通過誘導炎性細胞因子的釋放，進而激活下游的信號分子，如p38 MAPK，繼而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。本研究結果顯示，MRP8/14+SB203580組p38+/+細胞活力較MRP8/14組明顯升高，細胞凋亡率較MRP8/14組明顯降低。說明p38 MAPK在MRP8/14誘導小鼠成纖維細胞凋亡中具有重要作用。進一步研究發(fā)現，MRP8/14干預p38+/+細胞2 h，p38 MAPK磷酸化水平明顯升高，6 h達到高峰，8 h基本恢復正常水平。說明MRP8/14能夠以時間依賴性模式誘導p38 MAPK磷酸化。

綜上所述，p38 MAPK能促進MRP8/14誘導的小鼠成纖維細胞凋亡，這一效應可能是通過TLR4-p38 MAPK信號通路激活實現的。

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Role of p38 MAPK on apoptosis of mouse embryo fibroblasts induced by MRP8/14

WANGJuan,CHENXiaohuan,LILei,LUXiaying,JIANGYong

(DepartmentofPathophysiology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To explore the role of p38 MAPK on the apoptosis of mouse embryo fibroblasts induced by myeloid-related protein 8 (MRP8)/myeloid-related protein 14 (MRP14). Methods MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h; flow cytometry was applied to detect the apoptosis rate of p38+/+and p38-/-cells in the control group and groups in which cells were treated with 50 μg/mL MRP8/14 for 24 h and 48 h; MTT assay was performed to detect the cell viability of p38+/+cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+TAK242(TLR4 inhibitor) group and MRP8/14+RAGE neutralized antibody group for 24 h; MTT and flow cytometry were used to analyze the cell viability and the apoptosis rate of p38+/+cells in the control group, MRP8/14 group, MRP8/14+SB203580 (p38 MAPK inhibitor) group for 24 h; Western blotting was used to detect the phosphorylation changes of p38 MAPK in p38+/+cells treated with MRP8/14 for 0, 1, 2, 4, 6, and 8 h, respectively. Results The cell viability of p38+/+and p38-/-cells in the groups treated with MRP8, MRP14, and MRP8/14 for 24 h and 48 h was lower than that of the control group (P<0.05). At the same time, the cell viability of p38-/-cells was significantly higher than that of p38+/+cells in the MRP8/14 group at 24 and 48 h (P<0.05). The apoptosis rate of p38+/+cells in the MRP8/14 group at 24 and 48 h was higher than that of the control group, especially at 48 h (allP<0.05). However, the apoptosis rate of p38-/-cells did not change after MRP8/14 treatment for 24 and 48 h. The cell viability of p38+/+cells in the MRP8/14 group and MRP8/14+RAGE neutralized antibody group was lower than that in the control group and MRP8/14 +TAK242 group (P<0.05). The cell viability of p38+/+cells in the MRP8/14+SB203580 group was higher than that of the MRP8/14 alone group, and the apoptosis rate of p38+/+cells in the MRP8/14+SB203580 group was lower than that of the MRP8/14 alone group (P<0.05). The phosphorylation level of p38 MAPK in p38+/+cells was significantly higher at 2, 4, and 6 h after MRP8/14 treatment than that at 0, 1, and 8 h (P<0.05). Conclusion MRP8/14 can induce the apoptosis of mouse embryo fibroblasts via the activation of TLR4-p38 MAPK pathway.

embryo fibroblasts; myeloid-related protein 8; myeloid-related protein 14; p38 mitogen-activated protein kinase; apoptosis; mouse

國家自然科學基金資助項目(81501691)。

姜勇(E-mail： yjiang48231@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.008

R329.2

A

1002- 266X(2017)28- 0028- 05

2017- 02-26)