右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用

姜衛(wèi)榮，徐艷冰，王金波

(1 山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院，濟南250031；2 山東省立醫(yī)院)

右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用

姜衛(wèi)榮1，徐艷冰2，王金波1

(1 山東省醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院，濟南250031；2 山東省立醫(yī)院)

目的 探討右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用。方法 將32只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、氯胺酮組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組，每組8只?？瞻讓φ战M腹腔注射生理鹽水50 mL/kg，間隔5 min皮下注射生理鹽水50 mL/kg；氯胺酮組腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，間隔5 min皮下注射生理鹽水50 mL/kg；右美托咪定組腹腔注射右美托咪定25 μg/kg，間隔5 min皮下注射生理鹽水50 mL/kg；聯(lián)合用藥組腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，間隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg；各組均每天注射1次，連續(xù)注射3天。各組隨機取4只，檢測首次注射即刻(t0)及末次注射15、30、45、60、75、90 min(t1～t6)呼吸頻率、翻正反射消失時間、翻正反射消失持續(xù)時間以及夾尾反射完全消失時間，Morris水迷宮實驗檢測各組訓練1～5天的逃避潛伏期。各組剩余大鼠末次注射結(jié)束，斷頭處死，TUNEL法檢測海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率，Western blotting法檢測PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達。結(jié)果 與聯(lián)合用藥組比較，氯胺酮組翻正反射消失時間明顯延長，鎮(zhèn)靜維持時間、翻正反射消失持續(xù)時間明顯縮短，兩組比較P均<0.05。t1、t2、t3時，氯胺酮組呼吸頻率均顯著高于空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組同時間(P均<0.05)。空白對照組、右美托咪定組、聯(lián)合用藥組各時間逃避潛伏期比較P均>0.05；訓練第4、5天，氯胺酮組逃避潛伏期較空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組明顯延長(P均<0.05)。氯胺酮組神經(jīng)細胞凋亡率明顯高于空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組(P均<0.05)，而空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組神經(jīng)細胞凋亡率比較P均>0.05。氯胺酮組海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達明顯低于空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組(P均<0.05)，而空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達比較P均>0.05。結(jié)論 右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡具有保護作用，其作用機制可能與激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信號通路有關(guān)。

麻醉；右美托咪定；氯胺酮；細胞凋亡；記憶功能；抗凋亡信號通路；大鼠

氯胺酮是臨床常用的麻醉劑，具有鎮(zhèn)痛效果強、起效快、呼吸抑制作用弱等優(yōu)點，廣泛應用于小手術(shù)或診斷性操作時的淺表麻醉[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮能夠增加腺體分泌并可興奮心臟，導致呼吸負擔和心臟負荷加重，故術(shù)后譫妄、躁動的發(fā)生率較高[2]，而且短時間重復給藥還可對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用，這些不良反應與氯胺酮非特異性拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體有關(guān)[3]。右美托咪定是一種新型α2腎上腺素能受體激動劑，能選擇性地與α2腎上腺素能受體結(jié)合，具有神經(jīng)保護作用，但其作用機制尚不清楚。2009年5月～2014年5月，本研究觀察了右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡及記憶功能的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠32只，雌雄不限，8周齡，體質(zhì)量(237.6±12.1)g，由山東省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。所有大鼠自由攝食、飲水，動物房溫度19～22 ℃、相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替。鹽酸氯胺酮注射液，廣東邦民制藥廠有限公司；鹽酸右美托咪定注射液，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；5%戊巴比妥鈉，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司。TUNEL凋亡試劑盒，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶、DAB顯色試劑盒，北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠PKC單克隆抗體、兔抗鼠PKC抗體、兔抗大鼠ERK1/2多克隆抗體、小鼠抗大鼠ERK1/2單克隆抗體、小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體，美國Sigma公司；RNA提取試劑、SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol試劑、RT-PCR檢測試劑盒，美國Invitrogen公司；蛋白酶K、TdT酶，武漢博士德生物工程有限公司。光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Morris水迷宮，上海欣軟信息科技有限公司；DYY-Ⅲ 2型電泳儀，北京市六一儀器廠；低溫超速離心機，美國Sigma公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、氯胺酮組、右美托咪定組、聯(lián)合用藥組，每組8只。空白對照組腹腔注射生理鹽水50 mL/kg，間隔5 min皮下注射生理鹽水50 mL/kg；氯胺酮組腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，間隔5 min皮下注射生理鹽水50 mL/kg；右美托咪定組腹腔注射生理鹽水50 mL/kg，間隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg；聯(lián)合用藥組腹腔注射氯胺酮70 mg/kg，間隔5 min皮下注射右美托咪定25 μg/kg。每天注射1次，連續(xù)注射3天。各組每次麻醉后，仰臥位置于缺氧培養(yǎng)箱中，持續(xù)低濃度給氧(2 L/min)。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 相關(guān)生命體征 每組隨機取4只，檢測以下指標：①呼吸頻率：首次注射即刻(t0)及末次注射15、30、45、60、75、90 min(t1～t6)，記錄各時點呼吸頻率。②翻正反射：每次麻醉后，將大鼠仰臥位固定在固定板上，松開固定后，觀察大鼠出現(xiàn)倒下、肌無力、反射消失等時間，若無法自由恢復正常體位，則認定為翻正反射消失。記錄末次給藥至翻正反射消失以及恢復翻正反射的間隔時間，即翻正反射消失時間、翻正反射消失持續(xù)時間。③夾尾反射：用鑷子夾持大鼠尾部中下端，每次夾持1～2 s，每5 min操作1次，記錄反射完全消失至開始恢復的時間。反射完全消失指連續(xù)2次刺激均無反射反應；反射恢復指連續(xù)2次刺激均出現(xiàn)反射反應。以夾尾反射消失至重新出現(xiàn)的時間間隔為鎮(zhèn)靜維持時間。

1.3.2 逃避潛伏期 檢測完相關(guān)生命體征后進行Morris水迷宮實驗。將Morris水迷宮水池分為4個象限，任選一象限在水下放置平臺。測試時間設為120 s。測試開始，操作者任選一象限將大鼠面向池壁輕輕放入水中，記錄大鼠找到水下平臺的時間；找到平臺后，在平臺上休息1 min，按順序由下一象限放入水中進行下一次試驗。如大鼠120 s內(nèi)未找到平臺，則引導其至平臺，并在平臺上停留10 s。每天訓練4次，訓練間隔至少15 min，連續(xù)訓練5天。最后一次訓練結(jié)束次日，撤除平臺，將大鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中，其找到目標象限的時間即為逃避潛伏期。

1.3.3 海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率 采用TUNEL法。取各組剩余大鼠，末次注射24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉3 mL/kg麻醉，完全麻醉后仰臥位固定于動物實驗臺，手術(shù)剪將胸腔剪開，完全暴露心臟，心臟放血同時生理鹽水灌注沖洗，待流出液體變?yōu)闊o色后，灌注4%多聚甲醛。待大鼠完全死亡，將頭部剪開，取出大腦，完整剝離海馬組織，4%多聚甲醛固定24 h。取部分海馬組織，常規(guī)乙醇梯度洗脫、二甲苯透明，選取雙側(cè)海馬區(qū)平面連續(xù)切片。將切片置于載玻片上，10%中性甲醛固定10 min，PBS沖洗3次；依次加入100 μL蛋白酶K溶液靜置20 min，100 μL Equilibration Buffer平衡10 min，100 μL TdT酶反應60 min，顯微鏡下觀察。凋亡細胞判斷：凋亡細胞核呈棕色染色，細胞明顯縮小。隨機選取5個400倍視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率。海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率=每視野凋亡細胞總數(shù)/每視野細胞總數(shù)。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達 采用Western blotting法。液氮中取出部分海馬組織，研磨成粉末，加入蛋白裂解液(0.1%十二烷基硫酸鈉，1% NP-40，100 μg/L苯甲基磺酰氟，0.5%去氧膽酸鈉，1 mmol/L原釩酸鈉，2 μg/mL抑肽酶)，冰浴中充分裂解。收集裂解液，4 ℃、13 000×g離心20 min，BCA法蛋白定量后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?50 μg蛋白裂解液，加入等量2×SDS上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，4% SDS，20%甘油，0.2%溴酚藍)，SDS-PAGE分離蛋白，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，然后加入TBST室溫孵育60 min，再分別加入PKC(1∶100)、PKC(1∶50)、ERK1/2(1∶200)、ERK1/2(1∶100)、Bcl-2一抗(1∶100)，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶200)，室溫孵育60 min；然后加入ECL化學發(fā)光，顯影、定影。在iChemi XR imaging system中觀察。采用Hema凝膠成像分析系統(tǒng)分析各目的蛋白電泳條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，采用半定量分析法計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)生命體征比較 各組不同時點呼吸頻率變化見表1?？瞻讓φ战M、右美托咪定組翻正反射均未消失，各組維持鎮(zhèn)靜時間、翻正反射消失時間、翻正反射消失持續(xù)時間見表2。各組夾尾反射均未完全消失。

表1 各組不同時點呼吸頻率比較±s)

注：與同組t0時比較，*P<0.05；與空白對照組同時點比較，#P<0.05；與氯胺酮組同時點比較，▲P<0.05。

表2 各組鎮(zhèn)靜維持時間、翻正反射消失時間、翻正反射消失持續(xù)時間比較

注：“-”表示未檢測到。與氯胺酮組比較，*P<0.05。

2.2 各組逃避潛伏期比較 見表3。

2.3 各組海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率比較 空白對照組海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率為(18.38±2.87)%，氯胺酮組為(45.47±7.81)%，右美托咪定組為(17.58±4.70)%，聯(lián)合用藥組為(20.18±4.09)%。氯胺酮組海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率明顯高于空白對照組、右美托咪定組、聯(lián)合用藥組(P均<0.05)，空白對照組、右美托咪定組、聯(lián)合用藥組海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率比較P均>0.05。

2.4 各組海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達比較 見表4。

3 討論

表3 各組不同時點逃避潛伏期比較±s)

注：與同組第1天比較，*P<0.05；與同組第2天比較，#P<0.05；與同組第3天比較，△P<0.05；與同組第4天比較，▲P<0.05；與空白對照組同時點比較，▽P<0.05；與氯胺酮組同時點比較，▼P<0.05。

表4 各組海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白相對表達量比較±s)

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與氯胺酮組比較，*P<0.05。

氯胺酮屬于苯環(huán)已哌啶類麻醉藥，為中樞性NMDA受體抑制劑，可在產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用物同時快速誘導分離麻醉，具有鎮(zhèn)痛作用強、呼吸抑制作用弱等優(yōu)點，廣泛用于各種淺表手術(shù)的麻醉[4]。但氯胺酮屬于非特異性拮抗NMDA受體，能夠?qū)е略陝?、肌肉強直等不良反應，限制了其臨床應用。α2受體激動劑具有肌肉松弛作用，能夠?qū)孤劝吠碌募∪鈴娭盵5]。有報道稱，α2受體激動劑聯(lián)合氯胺酮可在降低氯胺酮不良反應的基礎上，減少各自藥物的用量[6，7]。

右美托咪定是一種新型α2腎上腺素能受體激動劑，能選擇性地與α2腎上腺素能受體結(jié)合，其與α2腎上腺素能受體的親和力為可樂定的8～10倍。近年研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定不僅可輔助用于鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜，還具有穩(wěn)定血流動力學、抑制氯胺酮引起的心血管興奮作用。右美托咪定輔助氯胺酮麻醉不僅能抑制氯胺酮引起的腺體分泌，降低其對呼吸作用的影響，還可減輕氯胺酮引起的擬交感神經(jīng)作用，二者聯(lián)合麻醉已成為一種趨勢[8～11]。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮組鎮(zhèn)靜維持時間顯著短于聯(lián)合用藥組，且聯(lián)合用藥組麻醉起效時間明顯縮短，麻醉維持時間明顯延長，說明右美托咪定聯(lián)合氯胺酮麻醉能夠明顯延長鎮(zhèn)靜時間。本研究還發(fā)現(xiàn)，右美托咪定組鎮(zhèn)靜維持時間明顯低于氯胺酮組和聯(lián)合用藥組，提示右美托咪定單藥應用鎮(zhèn)靜效果較差；而聯(lián)合用藥組鎮(zhèn)靜維持時間明顯高于氯胺酮組，提示右美托咪定可增強氯胺酮的麻醉效果。本研究右美托咪定組、聯(lián)合用藥組各時點呼吸頻率與基礎值比較差異均無統(tǒng)計學意義；氯胺酮組t1、t2、t3時呼吸頻率明顯高于基礎值和右美托咪定組、聯(lián)合用藥組。說明右美托咪定可抑制氯胺酮麻醉時引起的心血管興奮性，且兩藥聯(lián)用呼吸抑制作用輕微，安全性較高。

NMDA受體在中樞神經(jīng)細胞的發(fā)育、增殖、損傷修復中具有重要作用[12]。氯胺酮作為非特異性NMDA受體拮抗劑，可誘導神經(jīng)細胞凋亡而出現(xiàn)神經(jīng)毒性作用。然而Sakamoto等[13]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)阻斷NMDA受體可能會使NMDA受體敏感性升高，當氯胺酮的拮抗作用去除后，神經(jīng)細胞對谷氨酸等神經(jīng)毒性物質(zhì)的敏感性增強，神經(jīng)細胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，繼而誘導神經(jīng)細胞凋亡。有報道稱，大鼠氯胺酮麻醉后，其記憶功能可出現(xiàn)不同程度損傷，這可能與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)[14]。喬霖等[15]給予7日齡大鼠腹腔注射25 μg/kg右美托咪定，神經(jīng)細胞并未見明顯凋亡，后期也未發(fā)現(xiàn)大鼠學習記憶功能減退。提示右美托咪定可能本身無神經(jīng)細胞毒性作用。最近國外一項研究發(fā)現(xiàn)，α2受體激動劑能夠通過抑制谷氨酸鹽產(chǎn)生、抑制鈣離子內(nèi)流和降低NMDA受體敏感性發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。本研究氯胺酮組神經(jīng)細胞凋亡率明顯高于右美托咪定組和聯(lián)合用藥組，說明右美托咪定能夠減輕氯胺酮對中樞神經(jīng)細胞凋亡的影響。Savla等[17]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠?qū)⒓毎麅?nèi)谷氨酸鹽主動運輸至細胞外，逆轉(zhuǎn)谷氨酸鹽的神經(jīng)細胞毒性作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，訓練第4、5天，氯胺酮組逃避潛伏期明顯長于右美托咪定組和聯(lián)合用藥組，與陳欣等[18]報道一致。說明右美托咪定復合氯胺酮麻醉能夠改善大鼠的記憶功能。

PKC屬于Ca2+依賴性蛋白激酶，與哺乳動物神經(jīng)細胞的增殖、凋亡密切相關(guān)。既往研究證實，氧化應激、谷氨酸鹽等均能夠誘導PKC活化，并啟動相應的信號通路，發(fā)揮神經(jīng)細胞的保護作用[19，20]。ERK1/2是PKC重要的下游信號分子，活化的PKC能夠促進ERK1/2發(fā)生磷酸化，進而激活轉(zhuǎn)錄因子，最終抑制凋亡因子表達而發(fā)揮抗凋亡作用。Bcl-2是存在于線粒體外膜上重要的抗凋亡因子。有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能夠破壞Bcl-2/Bax二聚體的平衡，促進Bcl-2表達，從而避免神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡[21]。動物實驗證實，氯胺酮連續(xù)腹腔注射能夠抑制海馬區(qū)PKC-ERK1/2-Bcl-2信號通路，導致海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡[22]。另外，PKC-ERK1/2-Bcl-2信號通路受抑制還可誘導NMDA受體表達增加，使神經(jīng)細胞更容易受到谷氨酸鹽的損傷[23]。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮組海馬PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達明顯低于空白對照組、右美托咪定組和聯(lián)合用藥組，空白對照組、右美托咪定組、聯(lián)合用藥組海馬區(qū)PKC、ERK1/2、Bcl-2蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義。提示右美托咪定可能通過激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信號通路發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。

綜上所述，右美托咪定輔助氯胺酮麻醉對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡具有保護作用，還可改善大鼠的記憶能力，其作用機制可能與激活PKC-ERK1/2-Bcl-2信號通路有關(guān)。

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Dexmedetomidine and ketamine combined with anesthesia play an neuroprotective role in hippocampus of rats

JIANGWeirong1,XUYanbing,WANGJingbo

(1TheAffiliatedHospitalofShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250031,China)

Objective To explore the protective effect of ketamine and dexmedetomidine combined with anesthesia on nerve cells in hippocampus of rats. Methods A total of 32 SD rats were randomly divided into the negative control group (NC group), ketamine (K) group, dexmedetomidine (D) group, and K+D group with 8 rats in each group. In the NC group, 50 mL/kg normal saline was injected intraperitoneally, and normal saline was injected subcutaneously after 5 min. In the ketamine group, 70 mg/kg ketamine was injected intraperitoneally, and normal saline was injected subcutaneously after 5 min. In the dexmedetomidine group, 50 mL/kg normal saline was injected intraperitoneally, and 25 μg/kg dexmedetomidine was injected subcutaneously after 5 min. In the K+D group, 70 mg/kg ketamine was injected intraperitoneally, and 25 μg/kg dexmedetomidine was injected subcutaneously after 5 min. The breathing rates, righting reflex time was recorded, the memory function of rats was measured by Morris water maze test at the moment of injection (t0), at the injection of 15, 30, 45, 60, 75, and 90 min (t1-t6). The rats were sacrificed after the administration, neuronal apoptosis in CA region was measured by TUNEL assay, and the expression of PKC, ERK1/2, and Bcl-2 protein was measured by Western blotting. Results Compared with the K+D group, the righting reflex disappeared time of the ketamine group was significantly prolonged, the sedation duration and righting reflex disappeared time was significantly shorter, the difference between the two groups was statistically significant (allP<0.05). The breathing rates of the ketamine group were significantly higher than those of the NC group, dexmedetomidine group, and K+D group at t1, t2, t3(allP<0.05). There was no significant difference between NC group, dexmedetomidine group and K+D group in the escape latency of each period (allP>0.05). On the 4th and 5th days of training, the escape latency of the ketamine group was significantly longer than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). The neuronal apoptosis ratio of the ketamine group was significantly higher than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). The expression of p-PKC, p-ERK1/2, and Bcl-2 protein of the ketamine group was significantly lower than that of NC group, dexmedetomidine group and K+D group (allP<0.05). Conclusion Dexmedetomidine and ketamine combined with anesthesia have the protective effect on nerve cells in hippocampus of rats by the activation of PKC-ERK1/2-Bcl-2 signaling pathway.

anesthesia; dexmedetomidine; ketamine; apoptosis; memory function; anti-apoptosis signal pathway; rats

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(2016WSB01061)。

姜衛(wèi)榮(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為臨床麻醉。E-mail: jiangweirong72@163.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.006

R614

A

1002- 266X(2017)28- 0020- 05

2017- 03-10)