miR-31慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

王琳琳，胡曉霞，劉斐

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021)

·論著·

miR-31慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

王琳琳，胡曉霞，劉斐

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧530021)

目的 構(gòu)建微小核糖核酸31(miR-31)慢病毒載體質(zhì)粒，并觀察其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。方法 以包含miR-31基因的序列為目的片段，設(shè)計(jì)末端含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增目的片段，產(chǎn)物雙酶切后插入線性化慢病毒載體中，構(gòu)建miR-31慢病毒載體質(zhì)粒并鑒定。將miR-31慢病毒載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G共轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，并進(jìn)行慢病毒包裝，檢測(cè)miR-31慢病毒載體質(zhì)粒滴度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、miR-31組、空載體組，空白對(duì)照組不做任何處理，miR-31組予miR-31慢病毒載體質(zhì)粒處理，空載體組予空載體慢病毒質(zhì)粒處理。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組miR-31 mRNA表達(dá)；MTT法和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力，Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力。結(jié)果 成功構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，其病毒滴度為3×107TU/mL。miR-31組miR-31 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、空載體組(P均<0.05)，而空白對(duì)照組與空載體組比較P>0.05。miR-31組細(xì)胞增殖和遷移能力均高于空白對(duì)照組、空載體組(P均<0.05)，而空白對(duì)照組與空載體組比較P均>0.05。結(jié)論 成功構(gòu)建了miR-31慢病毒載體質(zhì)粒，建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的宮頸癌HeLa細(xì)胞。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)。

宮頸癌；微小核糖核酸31；慢病毒包裝；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，約由22個(gè)核苷酸組成，廣泛存在于真核生物中。miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體通過(guò)與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)堿基特異性結(jié)合，使mRNA降解或抑制翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用[1]。miR-31編碼基因定位于染色體9p21.3內(nèi)含子區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織中miR-31高表達(dá)，可能具有癌基因作用，參與宮頸癌的多種惡性生物學(xué)行為[2,3]。但其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全明確。2015年8月～2016年2月，本研究通過(guò)構(gòu)建miR-31慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-31的宮頸癌HeLa細(xì)胞(以下稱HeLa細(xì)胞)，并觀察其增殖和遷移能力變化，旨在進(jìn)一步研究miR-31在宮頸癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G，美國(guó)Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，北京天根生化科技有限公司。HeLa細(xì)胞，由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院李力教授惠贈(zèng)；293T細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、T4 DNA連接酶，北京天根生化科技有限公司；XbaⅠ、BamHⅠ限制內(nèi)切酶，美國(guó)NEB公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS、DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，德國(guó)Roche公司?；驍U(kuò)增儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，日本SANYO株式會(huì)社；電泳儀、電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司；顯微鏡成像系統(tǒng)，日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 miR-31慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 目的基因及引物設(shè)計(jì)合成 從GeneBank獲取miR-31基因序列，在miR-31基因序列的上下游截取相應(yīng)堿基序列作為目的片段(包含目的基因miR-31)。根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)引物，由美國(guó)Invitrogen公司合成。引物序列：miR-31-FP：5′-GCTCTAG-AAAACCTCCTGTGCCTAACTAC-3′(下劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn))，miR-31-RP：5′-CGCGGATCCCCA-TACAGGCCAATGTGGCTA-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增片段大小為417 bp。測(cè)序引物序列由廣州華大基因科技有限公司合成。正向引物CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，反向引物CK：5′-CTCTAGGCACCCGTTCAATTG-3′。以目的片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系共25 μL：引物miR-31-FP和miR-31-RP各取1 μL、模板2 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用XbaⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切兩端分別有XbaⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使目的片段兩端含有黏性末端。載體質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP用XbaⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后變成線性，大小約7 000 bp，目的片段為417 bp。目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致，約400 bp，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2 miR-31慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 取XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物及慢病毒載體質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，分別用2.0%、0.7%瓊脂糖凝膠回收酶切產(chǎn)物，連接目的片段和載體片段。反應(yīng)體系共10 μL：目的片段0.7 μL，載體片段0.8 μL，10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，ddH2O 6.5 μL；反應(yīng)條件：16 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16 h；挑選單克隆菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)16 h；以提取質(zhì)粒作為模板，以miR-31-FP、miR-31-RP作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。提取質(zhì)粒用XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切。擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析鑒定。將提取質(zhì)粒送廣州華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定。

1.3 miR-31表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力影響的觀察

1.3.1 miR-31慢病毒載體質(zhì)粒包裝及其滴度測(cè)定 將HeLa細(xì)胞接種于含10% FBS的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞接種于96孔板，5×103個(gè)/孔。利用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent將包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G與miR-31慢病毒載體質(zhì)粒按質(zhì)量比為1∶3∶1∶5制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。取10 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，4 ℃、4 000×g離心4 min，收集上清，0.45 μm濾過(guò)膜除菌并分裝。以包裝的空載體慢病毒作為對(duì)照。按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，10倍倍比稀釋病毒原液8個(gè)梯度，培養(yǎng)24 h后加入100 μL DMEM +10% FBS+1% P/S。培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，計(jì)算病毒滴度。病毒滴度=(平均GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù))/100×每孔病毒稀釋液體積×稀釋倍數(shù)。結(jié)果顯示，miR-31慢病毒載體質(zhì)粒滴度為3×107TU/mL，空載體慢病毒質(zhì)粒滴度為2×107TU/mL，二者比較P<0.05。說(shuō)明miR-31慢病毒載體質(zhì)粒包裝成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 miR-31慢病毒載體質(zhì)粒感染HeLa細(xì)胞及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、miR-31組、空載體組，空白對(duì)照組不做任何處理，miR-31組給予10 μL重組慢病毒原液+100 μL培養(yǎng)基，空載體組給予10 μL空載體慢病毒原液+100 μL培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下孵育12 h，至被感染細(xì)胞形態(tài)飽滿且未見(jiàn)明顯死亡時(shí)，棄上清，更換培養(yǎng)基。miR-31組病毒感染72 h，感染效率超過(guò)85%時(shí)，流式細(xì)胞儀分選熒光表達(dá)細(xì)胞，即為穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞。

1.3.3 HeLa細(xì)胞miR-31 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，miRcute miRNA提取分離試劑盒提取細(xì)胞RNA，通過(guò)miR-31逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物見(jiàn)1.2。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SuperReal PreMix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，50×Reference Dye 0.4 μL，RNase-free H2O 7.4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s 40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參(上游引物： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3′)，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-31 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力檢測(cè) ①細(xì)胞增殖能力：a.采用MTT法。取空白對(duì)照組、miR-31組、空載體組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞接種于96孔板，3×103個(gè)/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組培養(yǎng)第1、2、3、4、5天時(shí)分別加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，37 ℃恒溫?fù)u床低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。b.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：取空白對(duì)照組、miR-31組、空載體組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞接種于6孔板，1×103個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS浸洗2次，甲醇固定15 min，棄固定液，0.5%結(jié)晶紫染色25 min。顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)，每個(gè)大于50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)為1個(gè)克隆?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。②細(xì)胞遷移能力：采用Transwell小室法。取空白對(duì)照組、miR-31組、空載體組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Transwell chamber在37 ℃條件下溫育，用無(wú)血漿培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，制成密度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；在Transwell下室加入600 μL含10%血漿的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，用濕棉棒小心擦去上室底膜表面細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-31慢病毒載體鑒定 以重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，獲得單一特異條帶，400 bp左右，與設(shè)計(jì)的片段大小基本相符，說(shuō)明目的片段已成功插入載體質(zhì)粒。經(jīng)廣州華大基因科技有限公司測(cè)序，與GeneBank中miR-31的基因序列完全一致，表明miR-31慢病毒載體質(zhì)粒(即pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-miR-31)構(gòu)建成功。

2.2 各組miR-31 mRNA表達(dá)比較 空白對(duì)照組、空載體組、miR-31組miR-31 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.29±0.18、1.07±0.12、3.78±0.28，miR-31組miR-31 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、空載體組(P均<0.05)，而空白對(duì)照組與空載體組比較P>0.05。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較 見(jiàn)表1。miR-31組、空載體組、空白對(duì)照組克隆形成率分別為(41.16±5.79)%、(29.40±3.84)%、(28.60±4.14)%，miR-31組克隆形成率明顯高于空載體組、空白對(duì)照組(P均<0.05)，而空載體組與空白對(duì)照組比較P>0.05。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與空載體組比較，#P<0.01。

2.4 各組細(xì)胞遷移能力比較 miR-31組、空載體組、空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(194.6±14.39)、(132.6±12.81)、(130.2±18.01)個(gè)， miR-31組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于空載體組、空白對(duì)照組(P均<0.05)，而空載體組與空白對(duì)照組比較P>0.05。

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA有上千種，其在不同腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，通過(guò)干擾靶基因調(diào)控與腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路或某些關(guān)鍵因子，影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因作用[4～6]，有可能成為腫瘤診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7]。研究miRNA的方法有多種，主要通過(guò)過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)兩種途經(jīng)。過(guò)表達(dá)主要通過(guò)miRNA類似物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和構(gòu)建表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[8]。攜帶外源性基因的慢病毒載體，經(jīng)病毒包裝成感染顆粒，通過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源性基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。該載體將外源性基因有效地整合到宿主染色體上，從而使外源性基因持久表達(dá)[9]。當(dāng)進(jìn)行持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株來(lái)改變相應(yīng)內(nèi)源性基因的表達(dá)比瞬時(shí)轉(zhuǎn)染更具優(yōu)勢(shì)。本課題組前期將miR-31 mimic(miR-31模擬片段)轉(zhuǎn)入宮頸癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，但miR-31mimic在細(xì)胞內(nèi)存在時(shí)間短，且轉(zhuǎn)染試劑毒性大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠[2]。本研究將攜帶GFP基因和miR-31基因慢病毒載體質(zhì)粒感染HeLa細(xì)胞，使miR-31基因和GFP基因整合進(jìn)入宿主基因組，建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-31在多種惡性腫瘤(如肺癌、皮膚鱗癌、結(jié)腸癌等)組織中過(guò)表達(dá)，發(fā)揮癌基因作用。如在肺癌中可通過(guò)抑制抑癌基因BAP1促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，加速腫瘤生長(zhǎng)[10]；在皮膚鱗癌中通過(guò)直接抑制抑癌基因RhoTB1的表達(dá)，參與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展[11]；在結(jié)腸癌中可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力，并與患者預(yù)后有關(guān)[12]。Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-31 mRNA相對(duì)表達(dá)量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)呈正相關(guān)關(guān)系，下調(diào)miR-31表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。說(shuō)明miR-31可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究采用miR-31模擬片段轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，成功建立穩(wěn)定表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞；miR-31組培養(yǎng)3～5天，其增殖和遷移能力明顯高于空載體組、空白對(duì)照組，而空載體組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miR-31過(guò)表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力。

綜上所述，成功構(gòu)建了miR-31慢病毒表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的HeLa細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)。

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Construction of miR-31 lentiviral vector and its effect on proliferation and migration of cervical cancer HeLa cells

WANGLinlin,HUXiaoxia,LIUFei

(ThePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To construct the miR-31 lentiviral vector and to investigate its effect on proliferation and migration of cervical cancer HeLa cells. Methods PCR was used to amplify the target gene which included gene miR-31. The target gene was designed with appropriate enzyme sites at the end of the primer pairs. We inserted the PCR products into linearization of lentiviral vector after the double digestion. Restriction endonuclease analysis and DNA sequencing had confirmed the sequence of the recombinant plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-miR-31. HeLa cells were co-transfected with the lentiviral vectors pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-miR-31, pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV and pVSV-G, the titer of the lentivirus was detected. HeLa cells in the logarithmic phase were randomly divided into the control group without any treatment, the miR-31 group treated with lentivirus miR-31, and the negative control group given empty lentivirus. The qPCR was used to detect the expression of miR-31 in HeLa cells of each group. The cell proliferation was detected by clone formation assay and MTT assay, and the cell migration ability was detected by Transwell assay. Results The recombinant lentivirus expression plasmid was constructed successfully, with lentivirus titer of 3×107TU/mL. The expression of miR-31 in HeLa cells of the miR-31 group was significantly higher than that of the other two groups (allP<0.05); no significant difference was found between the control group and the negative control group (P>0.05). Compared with the other two groups, the proliferation and migration abilities of HeLa cells were increased in the miR-31 group (allP<0.05); no significant difference was found between the control group and the negative control group (P>0.05). Conclusion The miR-31 lentivirus expression plasmid is constructed successfully, and the proliferation and migration abilities of HeLa cells with stale expression of miR-31 are significantly enhanced.

cervical cancer; microRNA-31; lentivirus packaging; cell proliferation; cell migration

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060219、81660434)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118266)。

王琳琳(1991-)，女，住院醫(yī)師，研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail： henansqwll@126.com

胡曉霞(1964-)，女，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)閶D科腫瘤。E-mail： huxxia@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.001

R737.33

A

1002- 266X(2017)28- 0001- 04

2017- 03-11)