食品中菌落總數(shù)測定不確定度評定的應用

朱勇

榮昌區(qū)疾病預防控制中心，重慶 402460

食品中菌落總數(shù)測定不確定度評定的應用

朱勇

榮昌區(qū)疾病預防控制中心，重慶 402460

目的 分析食品中菌落總數(shù)檢測結果的不確定度的來源，減少實驗誤差，提高檢測結果的準確性。方法 依據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》、GB/T4789.2-2010食品微生物學檢驗《菌落總數(shù)測定》和《2015國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》（菌落總數(shù)標準操作程序）分析影響菌落總數(shù)檢測結果的幾個因素從而探討不確定度的評定方法。結果建立了簡便的食品中菌落總數(shù)測定不確定度評定方法。結論 影響菌落總數(shù)檢測結果的不確定度的因素有9種，稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度、加樣體積的相對標準不確定度、平板上菌落數(shù)的相對標準不確定度3個不確定分量是評定菌落總數(shù)檢測結果不確定度是必須計算的分量，不同實驗室可根據(jù)自身情況對菌落總數(shù)檢測結果不確定度進行評定時引入其他6種因素引起的不確定度。

食品；菌落總數(shù)；不確定度

菌落總數(shù)是微生物檢驗中常見的指標，反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求。測量不確定度是表征合理地賦予被測量的分散性，是目前國際公認的用來評價檢測結果質量的參數(shù)。一切結果都具有不確定度，因此菌落總數(shù)的檢測結果也具有不確定度。近年來，理化檢測結果不確定度的評定較為統(tǒng)一規(guī)范，而微生物檢測結果不確定度的評定尚無成熟規(guī)范的方法，不少文獻提出，對同一樣品重復測量多次，計算菌落總數(shù)測量結果的算術平均值及標準差，從而計算測量結果的不確定度，這是不符合實際工作的。該文以榮昌區(qū)2015年一組食品風險監(jiān)測項目熟肉制品的菌落總數(shù)為例，依據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[1]GB/T4789.2-2010《菌落總數(shù)測定》[2]和《2015國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》（菌落總數(shù)標準操作程序）[3]建立食品中菌落總數(shù)檢測結果的不確定度的評定方法，并探討其各種不確定度分量。

1 資料與方法

1.1 材料

重慶市榮昌區(qū)2015年食品風險監(jiān)測項目熟肉制品菌落總數(shù)檢測結果數(shù)據(jù)一組。

1.2 儀器設備與試劑

TP-202型天平；Therm-IGS180型電熱恒溫生化培養(yǎng)箱；SW-CJ型超凈工作臺；LMQ.C型高溫蒸汽滅菌鍋；YH-4001型拍擊式均質器。平板計數(shù)瓊脂（批號:150211）。

1.3 檢測過程

依據(jù)中華人民共和國國家標準GB/T4789.2-2010《菌落總數(shù)測定》和《2015國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》（菌落總數(shù)標準操作程序）用平板培養(yǎng)和菌落計數(shù)的方法。以無菌操作稱取檢樣25 g放入均質袋內，加入225 mL滅菌生理鹽水，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1:10的均勻稀釋液備用，根據(jù)對樣品污染度的估計，選擇了3個連續(xù)稀釋度（擬為等于或者大于1的整數(shù)），接種平板計數(shù)瓊脂，每個稀釋度接種兩個平皿各1 mL同時取生理鹽水做1份空白對照，將冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂傾注到平皿內，輕輕轉動混勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)各菌落總數(shù)，測量菌落總數(shù)時，選定平板上菌落數(shù)為30～300 CFU或者接近30～300 CFU的稀釋度來計算和報告檢測結果，最后取選定稀釋度的兩個平板上的菌落數(shù)平均值乘以稀釋倍數(shù)10n作為該試樣的單位（體積）菌落數(shù)。

2 建立數(shù)學模型

2.1 菌落總數(shù)測量的計算

假設Y為樣品單位體積的菌落總數(shù)；F為樣品稀釋倍數(shù)(10的若干指數(shù)倍)；N為培養(yǎng)基平板的菌落計算結果；V為平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積（即樣品經(jīng)10倍系列稀釋所得的樣品和生理鹽水的混合液），則該試樣單位（體積）的菌落數(shù)Y可由下式算出：

2.2 不確定度的主要來源與確認

通過該理論公式①，若以相對標準不確定度來表示各種不確定度，則菌落數(shù)Y的相對不確定度Urel(Y)可由下式算出：

式②中：Urel(F)—稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度；Urel(V)—加樣體積引入的相對標準不確定度;Urel(N)—平板上菌落數(shù)引入的相對標準不確定度。

3 試樣中菌落總數(shù)測量的相對標準不確定度分量的計算

由理論公式②可知菌落總數(shù)測量的的數(shù)學評估模型中3個不確定度分量相互獨立，為方便不確定度運算，下面均以相對標準不確定度來表示各相應的不確定度。

3.1 取樣稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(F)

不確定度分量有3個:①稱重時天平引入的相對標準不確定度Urel(M)；②實驗室溫度效應引入的相對不確定度Urel(T)；③量筒及玻璃吸管自身校準引入的相對標準不確定度Urel(C)。相對不確定度分量Urel(M)、Urel(T)和Urel(C)分析如下。

3.1.1 試樣在稱重時天平引入的相對標準不確定度urel(M)試樣稱量，使用天平稱取樣品時，根據(jù)JJG98-2006《非自動天平鑒定規(guī)程》[4]規(guī)定，0.01 g精密度天平稱量最大允守候差為±0.01 g，該實驗中均取樣25.00 g，天平線性MPE為矩形分布，該不確定度需計算兩次，一次為皮重，一次為總重。通過計算得到由天平最大允許誤差引入的相對標準不確定度：

3.1.2 稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(C)本試驗中使用250 mL的量筒，10 mL和1 mL的玻璃吸管，計數(shù)的平皿稀釋度為10-n檢測時溫度為15℃，因此不確定度主要由250 mL的量筒和10 mL、1 mL的玻璃吸管的容量允差和溫度偏離引起的溶液和容器漲縮引起。根據(jù)JJG196-2006《常規(guī)玻璃器鑒定規(guī)程》[5]，250 mL的量入式量筒最大允許誤差為±1.0 mL，10 mL玻璃吸管最大允許誤差為±0.1 mL，1 mL玻璃吸管最大允許誤差為±0.015 mL,允差為矩形分布，由此產(chǎn)生相對標準不確定度為：

實驗室溫度效應引入的相對不確定度Urel(T)

由10 mL的玻璃吸管引入的不確定度：

由1 mL的玻璃吸管引入的不確定度：

按照計數(shù)的平皿稀釋度10n的不同,上述不確定度分量合成Urel(F)不同，得下式:

3.2 加樣體積引入的相對標準不確定度urel(V)

由于每個計數(shù)平板所加的樣品稀釋液體積均為1 mL玻璃吸管,與上述稀釋過程中1 mL的玻璃吸管相同，因此加樣體積的相對標準不確定度Urel(V)=urel(C3)，根據(jù)稀釋倍數(shù)10n不同，即可算出Urel(V)2=0.931%×n。

3.3 平板上菌落數(shù)引入的相對標準不確定度Urel(N)

培養(yǎng)基計數(shù)平板上所查計的菌落總數(shù)均值是2個1mL所加試樣(稀釋勻液)中細菌經(jīng)過分別培養(yǎng)出來的菌落總數(shù)均值。在一系列充分混勻的等量的粒子懸液(1 mL試樣稀釋均勻液)中粒子(細菌)數(shù)的隨機性服從泊松分布(Poisson scatter)，所以菌落總數(shù)(均值)在培養(yǎng)基平板上的隨機誤差的不確定度可用泊松分布來表示，根據(jù)《GB/T4789.2-2010菌落總數(shù)測定》菌落總數(shù)的計算方法的不同，該相對標準不確定度計數(shù)方法也不同，分為下面兩種情況：

當只選定一個稀釋度的平行檢測的兩個計數(shù)平板上的菌落數(shù)的檢測結果為Nm、Nm+1時，菌落總數(shù)的均值

則泊松分布引起的相對標準不確定度

當有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在30～300 CFU之間時，假設實驗室試樣單位體積的培養(yǎng)基平板菌落第一稀釋度（低稀釋度）兩個平行測定計算結果為Nm、Nm+1，第二稀釋度（高稀釋度）兩個平行測定計算結果為Nm+2、Nm+3，計算連續(xù)稀釋度所產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel(N)以第一稀釋度（低稀釋度）計算結果為準，那么相當于第一稀釋度的菌落總數(shù)的均值，

表1 重慶市榮昌區(qū)2015年食品風險監(jiān)測項目熟肉制品菌落總數(shù)檢測結果不確定度評定分析

則泊松分布引起的相對標準不確定度

3.4 菌落數(shù)檢測結果合成相對標準不確定度Urel(Y)和合成標準不確定度UY

因此，按照操作人員對樣品污染狀況的估計，選擇適宜n個適宜稀釋度樣品勻液進行10倍遞增稀釋中n值得不同和菌落總數(shù)的計算方法的不同，試樣中菌落總數(shù)測量的相對標準不確定度分量合成情況也不同

3.5 菌落數(shù)檢測結果擴展標準不確定度U

當p=95%時，包含因子k=2，則擴展不確定度U=2×UY。

4 不確定度的報告

報告菌落總數(shù)檢測結果時，應同時附上擴展標準不確定度U和包含因子K。例樣品1菌落總數(shù)均值N為237 CFU,菌落計數(shù)稀釋度為102,擴展標準不確定度U為80，則菌落總數(shù)檢測結果報告為（2.4±0.8）×104CFU,包含因子K=2。

5 評定不確定度過程的討論

5.1 當樣品為液體時不確定度的評定

當樣品為液體時，按照GB/T4789.2-2010《菌落總數(shù)測定》則用吸管吸取檢樣25 mL，因此在計算不確定度時，應將稱重時天平引入的相對標準不確定度Urel(M)應轉換成25 mL的玻璃吸管引入的相對標準不確定度。

5.2 其他不確定度分量

上述的取樣稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(F)、加樣體積的相對標準不確定度Urel(V)和平板上菌落數(shù)的相對標準不確定度Urel(N)是根據(jù)建立的數(shù)學模型理論公式①得來，在實際測量過程中，影響菌落總數(shù)的檢測結果不確定度除了上述3個因素之外，還包括以下幾種因素引起的不確定度：①檢測人員計數(shù)產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel(P)；②計數(shù)平板上菌落的重疊引入的相對標準不確定度Urel(O)；③培養(yǎng)基的菌落生長率引入的相對標準不確定度Urel(S)；④試樣的不穩(wěn)定引入的相對標準不確定度Urel(E)；⑤數(shù)字修約引入的不確定度Urel(R)；⑥培養(yǎng)條件產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel(H)。則菌落數(shù)Y的完全相對不確定度Urel(Y)計算完全公式應該為：Urel(Y)2=Urel(F)2+Urel(N)2+Urel(V)2+Urel(P)2+Urel(O)2+Urel(S)2+Urel(E)2+Urel(R)2+Urel(H)2。各實驗室可以根據(jù)自身情況對菌落總數(shù)檢測結果不確定度評定的時候引入以下幾種因素引起的不確定度使不確定度評定更加準確。

5.2.1 檢測人員計數(shù)產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel(P)檢測人員在計數(shù)培養(yǎng)基平板上的菌落時，因經(jīng)驗和計數(shù)平板上菌落的復雜培養(yǎng)結果等而出現(xiàn)隨機誤差和識別誤差，該誤差通過對同一個培養(yǎng)基平板的菌落進行多次重復計數(shù)后統(tǒng)計得出，可以采用貝塞爾公示進行計算出相對標準不確定度。該文暫忽略了該不確定度。

5.2.2 計數(shù)平板上菌落的重疊引入的相對標準不確定度Urel(O)計數(shù)平板上菌落的重疊不確定度隨菌落在平板上的覆蓋面積不同而異。如平板上的菌落覆蓋面積為5%、10%、15%、20%、時，對應相對標準不確定度Urel(O)則分別為 0.02、0.04、0.06、0.08[6]。 其值不易判定，所以該文忽略了該不確定度

5.2.3 培養(yǎng)基的菌落生長率引入的相對標準不確定度Urel(S) 該實驗培養(yǎng)基為非選擇培養(yǎng)基，實驗室配制或商品化的成品培養(yǎng)基的質量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養(yǎng)基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響菌落生長率，產(chǎn)生不確定度。因此所有配制好的培養(yǎng)基均應進行質量控制試驗，通過與確認合格培養(yǎng)基進行比對，從而計算出不確定度。該文也暫時忽略了該不確定度

5.2.4 試樣的不穩(wěn)定引入的相對標準不確定度Urel(E)樣品在受理之后測量之前，受試樣特性、細菌本身特性和樣品存儲運輸條件的的影響，細菌會發(fā)生數(shù)量變化，即引入不確定度。通常情況下，此類相對標準不確定度不易計算，可以通過對試樣進行保鮮存儲運輸，減少儲存時間等方式來消除該不確定度。該文暫時忽略了該不確定度

5.2.5 數(shù)字修約引入的標準不確定度Urel(R) 按照國家標準GB/T4789.2-2010《菌落總數(shù)測定》檢測結果采用兩位有效數(shù)字當菌落數(shù)大于或等于100 CFU時，用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約，如Y.X×10nCFU（Y≥1，X≥0，n≥2），其修約間隔為 0.1×10nCFU；菌落數(shù)小于100 CFU時，其修約間隔為1 CFU。其修約間隔引起的不確定度為均勻分布[6]，由此產(chǎn)生的標準不確定度分別為由于數(shù)值均很小，該文忽略了該不確定度。

5.2.6 培養(yǎng)條件產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel(H) 培養(yǎng)條件中，溫濕度等環(huán)境因素也會影響菌落的生長，因此可以通過控制環(huán)境因素來消除該不確定度，由于該不確定度不易計算，該文暫時忽略了該不確定度。

5.2.7 正確建立數(shù)學模型是評定菌落總數(shù)檢測結果不確定的基礎 菌落總數(shù)測量結果是由文中理論公式①換算而來，相應的菌落測量結果的不確定度與樣品稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)基平板的菌落計算結果、平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積3個變量不確定度有關，故湯水平等[6]、劉麗花等[7]、陳建琳等[8]、范媛媛等[9]在評定菌落總數(shù)檢測結果不確定度時建立數(shù)學模型為y=x是不合理的，沒有考慮樣品稀釋倍數(shù)和平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積對檢測結果的影響，因此不確定度也不能正確的評定。

5.2.8 關于多次測量同一樣品而評定不確定度 湯水平等[8]、劉麗花等[9]、陳建琳等[10]、范媛媛等[11]、汪艷玲等[12]提出對同一樣品重復測量10次或者20次，然后計算菌落總數(shù)測量結果的算術平均值及標準差或者對數(shù)平均值及其標準差來計算測量結果的不確定度。在實際檢測工作中微生物檢測樣品通常不穩(wěn)定，存在動態(tài)污染變化等問題，這種多次重復檢測浪費檢測時間，因此對同一樣品進行多次檢測的不確定度評定方法是不符合工作實際的。

5.2.9 關于合并不同樣本的標準差而評定樣品的不確定度 劉麗花等[9]、陳建琳等[10]、范媛媛等[11]提出，把一組不同時間，不同人員測量的樣品菌落總數(shù)結果用貝塞爾公式計算出檢測結果對數(shù)值標準差的合并樣本標準差，進而把該標準偏差當作其中任一樣品菌落數(shù)測量結果的標準不確定度;隨著檢驗結果的不斷增加，可隨時將新樣品的測定測量與以往樣品的測量結果混到一起重新計算合并樣本標準差，更新測量結果的標準不確定度取值范圍。從統(tǒng)計學上講，合并樣本標準差的計算必須是所有被合并計算的樣本測量結果都是在規(guī)定條件(測量重復性條件或測量復現(xiàn)性條件或期間測量精密度條件)下對同一或類似被測對象的重復測量的結果，同時樣品測量的目標含量應該穩(wěn)定和接近。然而不同時間，不同人員在測量不同樣品時，樣品的菌落總數(shù)結果不同，檢測時的溫度，儀器的精密也可能不同，其菌落數(shù)檢測結果的不確定度也就不可能相同，另外如果把每次新樣品的測量結果與以往樣品的測量結果合并計算標準偏差時，就會產(chǎn)生一個新的合并樣品標準差作為新樣本測量結果的標準不確定度，這樣做法顯然是錯誤的，因為一個樣品檢測結果不確定度應該是確定的。

[1]JJF1059.1-2012，測量不確定度評定與表示[S].北京：北京質檢出版社，2010.

[2]GB/T4789.2-2010，食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定[S].北京：北京標準出版社，2010.

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R446.5

A

1672-5654（2017）06（c）-0041-04

2017-03-21）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.18.041

朱勇（1982-），男，重慶人，本科，主管技師，主要從事微生物檢驗工作。