人肝腫瘤細(xì)胞SMMC- 7721、HepG2對去甲斑蝥素- 半乳糖修飾殼聚糖納米粒的攝入及S180荷瘤小鼠在體抗腫瘤活性的影響

徐曉莉 李曉森 王 欽 王 靜

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南通 226001)

人肝腫瘤細(xì)胞SMMC- 7721、HepG2對去甲斑蝥素- 半乳糖修飾殼聚糖納米粒的攝入及S180荷瘤小鼠在體抗腫瘤活性的影響

徐曉莉 李曉森1王 欽 王 靜

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南通 226001)

目的 了解人肝腫瘤細(xì)胞SMMC- 7721、HepG2對去甲斑蝥素(NCTD)- 半乳糖修飾殼聚糖納米粒(NCTD- GC- NPs)的攝入及S180荷瘤小鼠在體抗腫瘤活性。方法 以FITC標(biāo)記NCTD- GC- NPs為實驗組，培養(yǎng)基為空白組，F(xiàn)ITC標(biāo)記去甲斑蝥素殼聚糖納米粒(NCTD- CS- NPs)為對照組，采用流式細(xì)胞儀測定培養(yǎng)1、3、5、9、16、24 h時SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對6 μg/ml納米粒的攝入程度及培養(yǎng)5 h時SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對1、3、6、12、24 μg/ml納米粒的攝入程度。S180荷瘤小鼠被隨機分為8組(n=10)，生理鹽水組，NCTD組，高、中、低劑量NCTD- CS- NPs組(對照組)、高、中、低劑量NCTD- GC- NPs組(實驗組)，腹腔注射10 d后剝離腫瘤，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。結(jié)果 SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對NCTD- CS- NPs、NCTD- GC- NPs的攝入均有時間依賴性，NCTD- GC- NPs的平均熒光強度顯著高于NCTD- CS- NPs(P均<0.05)。SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對不同濃度NCTD- CS- NPs攝入平均熒光強度顯著低于NCTD- GC- NPs(P均<0.05)。SMMC- 7721細(xì)胞可不同程度地攝入熒光標(biāo)記后的NCTD- CS- NPs與NCTD- GC- NPs，但對NCTD- GC- NPs的攝入量更大。各給藥組的S180荷瘤小鼠的瘤重均低于生理鹽水組(P均<0.05)；隨著NCTD濃度上升，對照組、實驗組的抑瘤率也隨之提高；各給藥組的脾指數(shù)與生理鹽水組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；低劑量對照組及實驗組的胸腺指數(shù)高于生理鹽水組(P均<0.05)，而中、高劑量對照組及實驗組的胸腺指數(shù)與生理鹽水組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論 NCTD- GC- NPs可發(fā)揮雙重肝靶向作用，顯著提高藥物的抗腫瘤作用，且無明顯免疫抑制作用。

去甲斑蝥素；半乳糖修飾殼聚糖；肝靶向納米粒；細(xì)胞攝入；在體抗腫瘤活性

原發(fā)性肝癌多發(fā)病于老年人群，化療是其主要的治療手段，在傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性成分并制備成新型靶向抗肝腫瘤制劑已經(jīng)成為近年來的研究熱點。去甲斑蝥素(NCTD)是傳統(tǒng)中藥斑蝥主要藥用成分斑蝥素的衍生物，能調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)肝細(xì)胞，其片劑主要用于治療原發(fā)性肝癌，其明顯的優(yōu)點在于不會導(dǎo)致患者白細(xì)胞降低，反而具有一定的升高白細(xì)胞的作用〔1，2〕。但是在臨床應(yīng)用的過程中，NCTD表現(xiàn)出一定的泌尿道毒性，也可能會發(fā)生頭暈、嘔吐等全身性癥狀，這種毒副作用是由于片劑的靶向性不高造成的。因此，研發(fā)NCTD的新型靶向制劑有利于降低由于藥物選擇性低引起的不良反應(yīng)。殼聚糖是一種取自動物甲殼的可再生材料，目前已廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、造紙業(yè)、化妝品等領(lǐng)域〔3，4〕，特別是在用于生物醫(yī)學(xué)材料方面受到廣大醫(yī)藥研究者的重視，其應(yīng)用前景十分廣闊。由于殼聚糖無毒無害、生物相容性良好、可生物降解，有抑菌、抗酸、促進(jìn)傷口愈合、降血脂、抗腫瘤等用，常作為新型藥物輔料制備各種新制劑。殼聚糖作為一種高分子材料，含有豐富的氨基基團，其化學(xué)性質(zhì)活潑，因而可在氨基的N位發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，得到的殼聚糖N位衍生物可作為新型藥物載體〔5～7〕。納米粒是一種常見的被動靶向制劑，由于其粒徑很小，可被肝臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞直接吞噬，納米粒則能被動地靶向分布在肝組織內(nèi)，更好地發(fā)揮肝臟治療藥物的效果〔8〕。此外，肝細(xì)胞中含有去唾液酸糖蛋白受體，它是主動肝靶向制劑的作用靶點。去唾液酸糖蛋白受體能特異性識別β- D- 半乳糖，因此制備半乳糖修飾殼聚糖(GC)可為作為去唾液酸糖蛋白受體的配體〔9〕，而將GC制備成的納米粒將具有雙重肝靶向特性。本研究制備去甲斑蝥素- 半乳糖修飾殼聚糖納米粒(NCTD- GC- NPs)，觀察人肝腫瘤細(xì)胞SMMC- 7721、HepG2對NCTD- GC- NPs的攝入情況及S180荷瘤小鼠在體抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 人肝腫瘤細(xì)胞SMMC- 7721、HepG2，鼠源性S180腫瘤細(xì)胞(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院提供)。培養(yǎng)基：含10%小牛血清的RPMI- 1640；培養(yǎng)環(huán)境：37℃，5%CO2。清潔級昆明種小鼠80只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，蘇州大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(蘇)2012- 0045。NCTD(山東信宜制藥有限公司，批號20150411)；殼聚糖(江蘇南通興成生物制品廠，脫乙酰度93.1%，分子量8～10 kD)；小牛血清(超級純，西諾生物科技有限公司)；RPMI- 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)(美國Sigma公司)；1∶250胰蛋白酶(上海沃凱化學(xué)試劑有限公司)。GC：自行合成，在30℃溫度下，殼聚糖與乳糖酸、1- (3- 二甲氨基丙基)- 3- 乙基碳二亞胺(EDC)、N- 羥基丁二酰亞胺(HOSu)發(fā)生縮合反應(yīng)獲得GC，乳糖?；〈葹?.92 %。HERAcell型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、FC型酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(美國Thermo公司)；Optima XE型超速冷凍離心機(美國Beckman公司)；CytoFLEX型流式細(xì)胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)；ML11型生物顯微鏡、IX71- F22FL/PH型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 NCTD- GC- NPs的制備方法 將100 mg GC和20 mg NCTD先后溶解于50 ml 0.2 %醋酸水溶液中，在500 r/min磁力攪拌下，保持30℃恒溫水浴，滴入1.5 mg/ml三聚磷酸鈉溶液，當(dāng)溶液產(chǎn)生乳光時停止滴入，過0.45 μm微孔濾膜，-50℃冷凍干燥后即得。在電子顯微鏡下觀察制備的NCTD- GC- NPs，結(jié)果納米粒形態(tài)圓整，分散良好，無粘連，粒徑分布均勻。采用激光衍射法測得納米粒的粒徑為(118.7±8.84)nm；采用HPLC法測得載藥量為(10.38±0.06)%，包封率為(57.92±0.40)%(n=5)。

1.3 FITC標(biāo)記NCTD- GC- NPs的制備方法 將1.0 g GC溶解于0.1 mol/L乙酸溶液，逐滴滴加30 ml FITC- 甲醇溶液，避光攪拌4 h，然后加入0.2 mol/L NaOH溶液將產(chǎn)物沉淀。將沉淀在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，采用甲醇水溶液(V∶V=70∶30)重復(fù)洗滌離心數(shù)次，當(dāng)上清液在485 nm、535 nm波長下無熒光檢出時為止。再用甲醇洗滌離心3次，充分脫水，避光-50℃冷凍干燥，即得FITC標(biāo)記GC。采用1.2方法，避光條件下采用FITC標(biāo)記GC制備得到FITC標(biāo)記NCTD- GC- NPs。

1.4 SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞的攝入 無菌操作分離對數(shù)生長期SMMC- 7721與HepG2細(xì)胞，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔細(xì)胞計數(shù)1×105個。以FITC標(biāo)記NCTD- GC- NPs為實驗組，培養(yǎng)基為空白組，F(xiàn)ITC標(biāo)記NCTD- CS- NPs為對照組。然后將培養(yǎng)板置5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)在37℃恒溫下培養(yǎng)24 h后，采用胰蛋白酶消化，并用PBS洗滌離心3次，采用流式細(xì)胞儀收集1×104個腫瘤細(xì)胞，測定平均熒光強度。分別觀察培養(yǎng)1、3、5、9、16、24 h時細(xì)胞對6 μg/ml納米粒的攝入程度及培養(yǎng)5 h時細(xì)胞對1、3、6、12、24 μg/ml納米粒的攝入程度。

1.5 納米粒在荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性 取對數(shù)生長期的S180腫瘤細(xì)胞，采用RPMI- 1640培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為1×107個/ml，抽取0.2 ml對小鼠進(jìn)行腹腔注射。室溫常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，處死腹水瘤小鼠，取2 ml腹水，采用適量0.9%氯化鈉注射液稀釋，在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，進(jìn)一步稀釋細(xì)胞濃度為1×107個/ml。抽取上述腹水瘤細(xì)胞懸浮液在小鼠右腋皮下部位接種0.2 ml，室溫下常規(guī)飼養(yǎng)。將荷瘤小鼠隨機分為8組(n=10)，生理鹽水組為空白對照，NCTD組(2.0 mg/kg NCTD)為原料藥對照，NCTD- CS- NPs組(對照組)、NCTD- GC- NPs組(實驗組)均有高(4.0 mg/kg NCTD)、中(2.0 mg/kg NCTD)、低(0.5 mg/kg NCTD)劑量。分別腹腔注射給予生理鹽水、NCTD、NCTD- CS- NPs和NCTD- GC- NPs，每日1次，連續(xù)給藥10 d。10 d后處死并剝離完整的腫瘤，稱瘤重，并取出完整的脾臟、胸腺，分別稱重。計算抑瘤率、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)時間的細(xì)胞攝入試驗 采用流式細(xì)胞儀測試SMMC- 7721與HepG2細(xì)胞的熒光強度。在5 h內(nèi)SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對NCTD- CS- NPs的攝入呈線性上升趨勢，在16 h后達(dá)到飽和；而SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對對照組的攝入也有時間依賴性，但平均熒光強度顯著低于實驗組(P均<0.05)。見表1。

2.2 不同濃度納米粒的攝入試驗 SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對低濃度NCTD- GC- NPs的攝入較好，但對高濃度NCTD- GC- NPs的攝入有飽和趨勢；而SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對不同濃度對照組攝入平均熒光強度顯著低于實驗組(P均<0.05)。見表2。

表1 不同培養(yǎng)時間細(xì)胞對6 μg/ml納米粒的攝入情況

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

表2 培養(yǎng)5 h時細(xì)胞對不同濃度納米粒的攝入情況

2.3 S180荷瘤小鼠在體抗腫瘤活性 各給藥組的瘤重均顯著低于生理鹽水組(P均<0.05)。隨著NCTD濃度上升，各組抑瘤率也隨之提高，其中低、中、高劑量對照組抑瘤率分別22.21%、29.47%、53.98%，低、中、高劑量實驗組抑瘤率分別為23.64%、44.33%和60.81%，高劑量對照組及中、高劑量實驗組抑瘤率明顯大于NCTD組(30.15%，均P<0.05)；各給藥組的脾指數(shù)與生理鹽水組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；NCTD組和低劑量對照組及實驗組的胸腺指數(shù)顯著高于生理鹽水組(P均<0.05)；而中、高劑量對照組及實驗組的胸腺指數(shù)與生理鹽水組無顯著差異(P均>0.05)。見表3。

表3 S180荷瘤小鼠的瘤重與免疫指數(shù)

與生理鹽水組比較：1)P<0.05；與NCTD組比較：2)P<0.05

3 討 論

NCTD的分子結(jié)構(gòu)決定其不易進(jìn)行熒光標(biāo)記，且國內(nèi)外均無相關(guān)報道，另外，即使NCTD能夠被熒光標(biāo)記，因為其分子量較小，經(jīng)過熒光標(biāo)記后其化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子量變化太大必會對試驗結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。殼聚糖含有豐富的游離氨基，與FITC反應(yīng)較為容易，且殼聚糖為高分子化合物，經(jīng)熒光標(biāo)記后分子量不會發(fā)生明顯改變，因而對試驗結(jié)果幾乎無影響〔10，11〕。GC作為殼聚糖的衍生物，也含豐富的游離氨基，因此也可進(jìn)行FITC熒光標(biāo)記考察納米粒的肝靶向性。

人肝腫瘤細(xì)胞中含有去唾液酸糖蛋白受體，可作為主動肝靶向制劑的作用靶點，GC分子結(jié)構(gòu)中含半乳糖基團，可被肝腫瘤細(xì)胞中的去唾液酸糖蛋白受體識別，并能與之特異性結(jié)合〔12，13〕。人肝腫瘤SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞均具有去唾液酸糖蛋白受體，且均為實驗室常用的人源性肝腫瘤細(xì)胞模型，所以本研究采用SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞作為體外肝腫瘤模型。

殼聚糖具有一定的抗腫瘤作用，有文獻(xiàn)報道100 mg·kg-1·d-1殼聚糖溶液靜脈注射入荷瘤小鼠體內(nèi)后，殼聚糖能表現(xiàn)出顯著地抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用〔14〕。此外，張澄波等〔15〕將殼聚糖溶液腹腔注射入腹水瘤小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明劑量在30 mg/kg時觀察不到抗腫瘤作用，而劑量在100 mg/kg時腹水生成時間延長，劑量在200 mg/kg時對腹水瘤的抑制作用明顯，其結(jié)論為殼聚糖并不能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，但可增強非特異性免疫功能間接發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。因此，殼聚糖在較高劑量時才會體現(xiàn)出一定的抑制腫瘤生長的作用，且殼聚糖載體只適合于腫瘤的預(yù)防及輔助治療。本研究中納米粒的最高劑量組的殼聚糖或GC的劑量才相當(dāng)于35 mg/kg，此時殼聚糖并不會表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤生長的作用，所以本研究中并未將空白納米粒作為納米?？鼓[瘤活性研究的對照，僅將NCTD原料藥作為對照。

本研究結(jié)果表明，SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞對NCTD- GC- NPs攝入率更高，其原因是GC中含有半乳糖基團，可作為配體與SMMC- 7721、HepG2細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合，從而NCTD- GC- NPs成為肝主動靶向制劑，加之納米粒本身具有的被動靶向性，NCTD- GC- NPs具有雙重肝靶向性。隨著NCTD濃度的升高，兩種納米粒對S180荷瘤小鼠的抑瘤率均明顯增加，這表明NCTD的在體抑瘤率具有濃度依賴性，制備成納米粒后，兩種納米粒均能提高NCTD對S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制程度，NCTD- GC- NPs則能進(jìn)一步提高NCTD對S180實體瘤的抑制程度。這是由于NCTD- GC- NPs在S180荷瘤小鼠體內(nèi)能增強NCTD在肝組織中的分布程度，與肝腫瘤細(xì)胞的親和性更好。兩種納米粒與NCTD均未表現(xiàn)出明顯的脾臟免疫抑制，大部分納米粒組的胸腺指數(shù)與生理鹽水對的無明顯差異，然而兩種低劑量納米粒能提高胸腺指數(shù)，高劑量納米粒的胸腺指數(shù)無明顯差異。這是由于NCTD具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能升高白細(xì)胞水平，而這種作用可能與促進(jìn)胸腺免疫功能有關(guān)〔16〕。

綜上，本研究制備的NCTD- GC- NPs在體外對肝腫瘤SMMC- 7721和HepG2細(xì)胞均有良好的親和性，在S180荷瘤小鼠體內(nèi)發(fā)揮良好的抗肝腫瘤作用，并能有效增強NCTD的抗肝腫瘤作用，作為一種新型雙重肝靶向抗肝腫瘤制劑具有良好的應(yīng)用前景。

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〔2016- 03- 17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

南通市科技計劃項目(MS22016055)

王 欽(1985- )，男，碩士，主管藥師，主要從事藥物基因組學(xué)研究。

徐曉莉(1970- )，女，主管藥師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

R285

A

1005- 9202(2017)15- 3661- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.009

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤婦科