納米羥基磷灰石誘導的體外特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)研究

董文韜，陳 侃，李善高，何 歡，江國華，孔祥東,

(1.浙江理工大學，a.生命科學學院;b.材料與紡織學院，杭州 310018；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，杭州 310053)

納米羥基磷灰石誘導的體外特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)研究

董文韜1a，陳 侃1a，李善高2，何 歡1a，江國華1b，孔祥東1a,1b

(1.浙江理工大學，a.生命科學學院;b.材料與紡織學院，杭州 310018；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，杭州 310053)

探討了納米羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)作為腫瘤免疫治療佐劑或抗原載體的可行性。利用水熱法合成棒狀、長徑200～300 nm、短徑30～50 nm的納米HAp，體外降解實驗表明HAp 90 d的降解率可達30%。以人乳腺癌細胞裂解蛋白為腫瘤抗原，利用HAp負載該腫瘤抗原并刺激人外周血單個核細胞來源的樹突細胞，將刺激后的樹突細胞與同源淋巴細胞共培養(yǎng)，分離共培養(yǎng)后的同源淋巴細胞，并檢測其對人非小細胞肺癌細胞A549、人肝癌細胞Huh-7、人乳腺癌細胞MCF-7、人乳腺正常細胞(Hs578Bst)的生長抑制效果。結(jié)果表明：所制備的納米HAp無納米毒性且生物相容性良好；HAp可顯著增強人樹突細胞對腫瘤抗原的吞噬作用，同時誘導同源淋巴細胞產(chǎn)生顯著的抗原特異性免疫反應(yīng)，殺傷率可達40%以上。

納米羥基磷灰石；樹突狀細胞；腫瘤裂解蛋白；腫瘤免疫治療

0 引 言

腫瘤免疫治療有望成為繼手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療后腫瘤治療領(lǐng)域的一場重大革新。傳統(tǒng)腫瘤治療方式尚存諸多弊端，如手術(shù)治療對于已浸潤、轉(zhuǎn)移的腫瘤和非實體瘤來說作用非常有限，放療、化療會對人體正常組織和免疫系統(tǒng)造成極大損傷且難以徹底清除腫瘤細胞。而腫瘤免疫治療通過提高腫瘤細胞的免疫原性和效應(yīng)免疫細胞的殺傷敏感性，激發(fā)和增強自身機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答[1]，繼而利用患者自身免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，具有毒副作用小、復發(fā)率低、治愈率高等優(yōu)勢，對傳統(tǒng)方法難以治療的淋巴瘤、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌等療效顯著[2-6]。

目前，腫瘤免疫治療中所采用的樹突狀細胞(dendritic cell, DC)疫苗策略包括：首先將患者體內(nèi)的DC進行體外擴增培養(yǎng)，然后在體外利用腫瘤抗原刺激DC，最后將DC回輸?shù)交颊唧w內(nèi)誘導特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[7-8]。DC疫苗在臨床上已經(jīng)取得一定的療效[9-10]，但仍有許多難題需要進一步研究，如DC的獲取、DC的抗原負載方式、DC的活化程度等，其中最關(guān)鍵為抗原負載方式。因此如何找到有效的抗原載體以增強DC誘導的抗腫瘤免疫反應(yīng)，是DC疫苗研究中的重大難題[11]。

腫瘤細胞通常具有較高的突變率和種屬缺失性，并且缺乏特異性標志物，難以找到腫瘤特異性抗原，從而限制腫瘤特異性抗體在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。腫瘤裂解蛋白(tumor lysate protein, TLP)是由多種腫瘤蛋白構(gòu)成的復合物，屬于腫瘤相關(guān)抗原，易于制備和應(yīng)用，臨床試驗表明基于腫瘤裂解蛋白的免疫治療具有良好效果[12-17]。羥基磷灰石(hydroxyapatite, HAp)是哺乳類動物骨骼和牙齒的主要成分，因其良好的生物相容性而廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物開發(fā)、基因載體中[18-21]。Meng等研究表明，蛋白在與納米粒子連接之后其免疫原性可以大幅提升[22-23]，因此本文構(gòu)建負載腫瘤裂解蛋白的HAp，并檢測其對DC誘導的同源淋巴細胞(lymphocyte, Lym)體外抑癌效果，評估納米羥基磷灰石顆粒在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 HAp顆粒的制備與表征

納米顆粒的制備方法參考文獻[24]和[25]中的制備方法，具體過程如下：利用恒流泵以20滴/min的速率將50 mL 0.03 mol/L Na2HPO4(Sigma公司，美國)溶液逐滴加入到已預熱至70 ℃的50 mL 0.05 mol/L CaCl2(Sigma公司，美國)溶液，磁力攪拌器的攪拌速率為300 r/min，滴加期間始終通過1 mol/L的NaOH(Sigma公司，美國)溶液調(diào)整溶液pH值為10。滴加完成后，保持300 r/min的速率和70 ℃的溫度繼續(xù)攪拌2 h后停止攪拌，保持70 ℃的溫度水浴靜置24 h。上述溶液經(jīng)高速離心機8000 r/min速率離心5 min及無水乙醇反復清洗3～5次，顆粒置于70 ℃烘箱中烘干，在超凈臺中用無菌研缽將顆粒碾至粉末狀后放入無菌離心管中進行保存。利用場發(fā)射掃描電鏡(field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM)、X射線粉末衍射儀(X-ray diffraction，XRD)、紅外吸收光譜儀(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)、熱重分析儀(thermogravimetry，TGA)對制備的顆粒進行表征分析。

1.2 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞株MCF-7、人乳腺正常細胞株Hs578Bst、人非小細胞肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株Huh-7均購自中科院上海細胞庫，均利用含10%胎牛血清(Gibco公司，美國)和1%青-鏈霉素雙抗溶液(碧云天公司，南京)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)進行培養(yǎng)。

DC細胞來源于健康人志愿者外周血單個核細胞。利用Ficoll密度梯度離心法從健康人外周血中分理出單個核細胞，具體方法為，先用磷酸緩沖液(Gibco公司，美國)等量稀釋健康人外周血，再將稀釋過的外周血緩慢加入到等量的人淋巴細胞分離液(TBD公司，天津)中，2000 r/min離心20 min后吸取離心管中的白膜層，即為單個核細胞，將所得單個核細胞過夜培養(yǎng)，然后小心吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基(內(nèi)含未貼壁的與DC同源的淋巴細胞)至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，未吸出的貼壁細胞即為單核細胞，加入含10 ng/μL rhGM-CSF(Pepro Tech公司，美國)和10 ng/μL IL-4(Pepro Tech公司，美國)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基對其繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d(每3 d半量換液1次)，即可誘導培養(yǎng)出未成熟的DC，在誘導DC成熟時，需補加20 ng/mL的rhTNF-α(Pepro Tech公司，美國)。

1.3 HAp顆粒體外降解與生物相容性檢測

利用pH值為7.4和5.6的PBS緩沖溶液分別模擬正常體液環(huán)境和溶酶體內(nèi)環(huán)境；各取10 mL兩種PBS溶液溶解50 mg HAp顆粒，置于37 ℃水浴恒溫搖床中，震蕩速率為120 r/min，使HAp顆粒降解90 d。期間每10 d將上述溶液8000 r/min離心5 min，利用鈣離子檢測試劑盒(DICA-500，Bioassay systems)檢測上清溶液鈣離子的濃度，根據(jù)鈣離子與HAp之間的關(guān)系計算出已降解HAp顆粒的質(zhì)量，再利用新鮮的兩種上述PBS溶液重懸HAp顆粒，震蕩混勻后繼續(xù)置于搖床中繼續(xù)進行實驗。

利用MTT法分別檢測HAp濃度為0.1、1、5、10、50、100、200、500 μg/mL對生長到對數(shù)期MCF-7、Hs578Bst、Huh-7、A549細胞的相對活力影響，細胞接種密度為3×103個/孔。

1.4 HAp顆粒連接腫瘤抗原

利用RIPA細胞裂解液(碧云天公司，南京)裂解生長到對數(shù)生長期的MCF-7細胞(每107個細胞加入1 mL含10 μL 100 mmol/L的PMSF的RIPA裂解液)，提取腫瘤細胞裂解蛋白作為腫瘤抗原，利用BCA試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)測定蛋白濃度。將20 μg和40 μg HAp顆粒分別負載5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL及20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL兩種濃度梯度的TLP溶液。具體方法為在避光4 ℃的環(huán)境下利用顛倒混合器溫和混勻12 h，然后4 ℃ 5000 r/min離心5 min沉淀HAp顆粒，再次利用BCA試劑盒檢測上清溶液中蛋白的濃度，最后通過擬合Langmuir曲線的方法測定其最大吸附量。計算方式為：以Ce為橫坐標，Ce/Qe為縱坐標擬合直線，通過公式Ce/Qe=Ce/Qm+1/(Qm×b)計算出Qm，其中Ce為平衡時溶液中蛋白濃度，mg/L；Qe為平衡時蛋白的吸附量，mg/g；Qm為最大吸附量，mg/g；b為常數(shù)。

1.5 DC細胞對腫瘤抗原的吞噬

取部分腫瘤裂解蛋白利用FITC試劑盒(Sigma公司，美國)進行標記，TLP與FITC的質(zhì)量比為1 mg∶150 μg，用避光冰浴透析48 h(每6 h換一次PBS透析液)的方法除去未連接的FITC，用HAp顆粒負載標記后的腫瘤抗原，分別將負載后的腫瘤抗原與游離的腫瘤抗原加入到未成熟的DC中共培養(yǎng)6 h，然后分別用Hoechst 33258(碧云天公司，南京)、Phalloidin(Life公司，美國)對DC的細胞核與微絲骨架進行染色，熒光顯微鏡觀察DC細胞對腫瘤抗原的吞噬情況。

1.6 DC細胞誘導的同源淋巴細胞對MCF-7的體外殺傷效果

分別利用HAp顆粒(HAp)、游離的TLP(TLP)和負載TLP的HAp(HAp-TLP)以及雙倍質(zhì)量的HAp(HAp2)、TLP(TLP2)和負載TLP的HAp(HAp2-TLP2)刺激未成熟的DC(2×104個)2 d(刺激的同時補加20 ng/mL的rhTNF-α)，再將刺激后的DC與同源淋巴細胞共培養(yǎng)3 d(淋巴細胞與DC的數(shù)量比為10∶1)，將共培養(yǎng)后的同源淋巴細胞作為效應(yīng)細胞(efect cells, E)，MCF-7細胞作為靶細胞(target cells, T)，利用MTT法檢測了E∶T=10∶1和E∶T=20∶1條件下利用不同刺激物刺激的DC誘導的同源淋巴細胞對MCF-7的殺傷效果。

1.7 DC細胞誘導的同源淋巴細胞殺傷特異性檢測

利用HAp顆粒(HAp)、游離TLP(TLP)、負載TLP后HAp顆粒(HAp-TLP)刺激DC(2×104個)2 d(刺激的同時補加20 ng/mL的rhTNF-α)，再將DC與同源淋巴細胞共培養(yǎng)三天(淋巴細胞與DC的數(shù)量比為10∶1)，收獲刺激后同源淋巴細胞，MTT檢測淋巴細胞對靶細胞MCF-7、Huh-7、A549、Hs578Bst(E∶T=20∶1)四種細胞的體外殺傷效應(yīng)。

1.8 淋巴細胞自身對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)

利用HAp顆粒(HAp)、游離的TLP(TLP)、負載TLP后的HAp顆粒(HAp-TLP)直接刺激淋巴細胞3 d，用MTT法檢測刺激后的淋巴細胞直接對靶細胞MCF-7、Huh-7、A549、Hs578Bst(E∶T=20∶1)的體外殺傷效應(yīng)。

1.9 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，組間比較采用t檢驗。以p<0.05為具有顯著性差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HAp顆粒表征

圖1(a)為所制得HAp樣品的FE-SEM結(jié)果圖，從圖中可以看出，顆粒形貌為細棒狀，長徑為200～400 nm，短徑為30～50 nm，形貌均一。

圖1(b)為所制備HAp樣品的XRD檢測結(jié)果，顆粒結(jié)晶性良好，具有明顯的211、112、300、002等衍射峰，與標準HAp卡片CPDS#9-432比對的結(jié)果表明本研究中所制備顆粒的主要成分為HAp。

圖1(d)為制得顆粒的TGA分析結(jié)果，從0 ℃到800 ℃加熱過程中，顆粒在溫度達到500 ℃時失重為5.32%，溫度升高對樣品重量的影響不明顯；0～300 ℃失重應(yīng)為顆粒內(nèi)水分的喪失，300～500 ℃失重速率明顯減緩，且失重比率非常小，其原因可能是顆粒內(nèi)部少量有機物雜質(zhì)的分解，而500 ℃后失重不再增加，表明所制備HAp具有較高的純度。

2.2 HAp顆粒體外降解與生物相容性

降解實驗中每10 d檢測離心后上清中Ca2+濃度，根據(jù)Ca2+含量與HAp的對應(yīng)關(guān)系可計算出已降解的HAp顆粒的重量，從而繪制出90 d內(nèi)HAp顆粒累積降解率曲線。結(jié)果如圖2所示，HAp顆粒在體外有著較好的可降解性，90 d時，在pH值為5.6與7.4的緩沖液中的HAp的降解率分別達到了49.6%與31.8%，這表明所制備的HAp顆粒降解速率適中，可避免快速降解帶來的細胞內(nèi)環(huán)境驟變引起的細胞應(yīng)激，也能避免長期滯留體內(nèi)安全性問題與毒副作用，具有較好生物安全性。并且HAp具有不同pH值降解響應(yīng)性，在酸性環(huán)境中降解速率較快。而惡性腫瘤組織中的pH值呈弱酸[26-27]，可加速HAp分解，從而更快的釋放HAp所搭載的基因、蛋白或藥物。

圖3中(a)、(b)、(c)和(d)為HAp顆粒濃度在0.1～500 μg/mL范圍內(nèi)，分別與MCF-7、A549、Hs578Bst、Huh-7四種細胞共培3 d的細胞相對存活率檢測結(jié)果。從圖3中結(jié)果表明，在所選濃度范圍內(nèi)，HAp與這四種細胞有著良好的生物相容性，各組中細胞存活率普遍都在90%以上，且隨著HAp濃度和培養(yǎng)時間的變化，細胞存活狀況相對穩(wěn)定，說明所制備的HAp顆粒樣品具有較好的細胞生物相容性，可以用于后續(xù)細胞實驗。

圖1 HAp顆粒表征結(jié)果

圖2 HAp顆粒體外累積降解曲線

圖3 HAp顆粒細胞生物相容性檢測結(jié)果

2.3 誘導培養(yǎng)外周血單個核細胞來源的DC細胞

圖4(a)—(f)分別為誘導培養(yǎng)1～9 d DC細胞的明場照片，培養(yǎng)1 d后DC細胞為規(guī)則圓形的貼壁單核細胞形態(tài)，與誘導培養(yǎng)前并無太大差別；培養(yǎng)3 d后，細胞開始聚集生長，細胞略微變大且細胞表面有少量細絲狀突起產(chǎn)生；培養(yǎng)5 d后，細胞聚集生長情況進一步增強，表面絲狀突起明顯增多；培養(yǎng)7 d后，細胞聚集生長狀態(tài)較之前有所下降，但部分細胞表面絲狀結(jié)構(gòu)明顯變粗伸長，有些細胞已經(jīng)初步有了DC細胞的基本形態(tài)；繼續(xù)培養(yǎng)1 d，在第8 d時可以看到，部分細胞已明顯長出偽足，已經(jīng)有了成型的DC細胞形態(tài)，但數(shù)量并不多；培養(yǎng)到第9 d時，細胞形態(tài)較之前有顯著的變化，絕大部分單核細胞已被成功誘導培養(yǎng)為DC細胞，且數(shù)量較第8 d有明顯增加。上述結(jié)果表明本實驗成功將單核細胞誘導培養(yǎng)為DC細胞。

圖4 誘導培養(yǎng)不同天數(shù)的DC細胞的形態(tài)

2.4 HAp對腫瘤裂解蛋白的負載

圖5(a)為20 μg HAp吸附TLP的Langmuir方程擬合直線，在實驗中，各組初始TLP溶液經(jīng)20 μg HAp顆粒負載后，終濃度Ce為2.9、5.6、10.9、14.8、19.4、24.6、29.9、34.8 μg/mL，由得到的直線方程計算得出Qm=1/0.1716，約為5.8。圖5(b)為40 μg HAp吸附TLP的Langmuir方程擬合直線，各組初始TLP溶液經(jīng)40 μg HAp顆粒負載后，Ce為12.1、17.4、22.3、34.5、48.4、56.7、65.1、75.9 μg/mL，計算可得Qm=1/0.0714，約為14.0。上述結(jié)果結(jié)果表明，HAp質(zhì)量與所吸附蛋白的量基本呈線性關(guān)系，但納米材料具有比表面積大、表面活性高等一些特殊性質(zhì)，因此在顆粒質(zhì)量加倍后，所吸附蛋白量要多于單倍質(zhì)量顆粒吸附蛋白量的兩倍。

圖5 HAp顆粒吸附TLP的Langmuir方程擬合直線

2.5 DC細胞吞噬腫瘤抗原

圖6為分別利用TLP與HAp-TLP刺激誘導培養(yǎng)7 d后的DC細胞，熒光顯微鏡觀察DC細胞對腫瘤抗原的吞噬結(jié)果。藍色熒光為Hoechst標記的DC細胞核，紅色熒光為Phalloidin標記的DC細胞骨架，綠色熒光為FITC標記的TLP。從圖中可以看出，此時的細胞處于聚集生長狀態(tài)，部分細胞已有偽足伸出，初步具有DC細胞的形態(tài)，在TLP未與HAp連接時(即游離的TLP)，只有少量抗原被DC吞噬，但在TLP連接HAp之后(即TLP-HAp)，DC細胞所吞噬的腫TLP的量明顯增多，說明所制備的HAp樣品對DC細胞吞噬腫瘤抗原有良好的促進作用。

圖6 DC細胞對腫瘤抗原的吞噬(Hoechst為赫斯特染色，Phalloidin為鬼筆環(huán)肽，F(xiàn)ITC為異硫氰酸熒光素，Merged為三色熒光復合圖，放大倍數(shù)：200×)

2.6 DC細胞誘導的同源淋巴細胞體外殺傷MCF-7

從圖7與圖8結(jié)果顯示，用HAp-TLP刺激DC細胞后，DC誘導的同源淋巴細胞對MCF-7的殺傷效果顯著高于單獨用HAp或者TLP刺激的DC。當且用雙倍量的HAp負載TLP后，其結(jié)果相似。利用HAp顆粒負載TLP后，TLP更容易被DC細胞吞噬，DC將更多的抗原呈遞給效應(yīng)淋巴細胞，從而增強免疫殺傷反應(yīng)。單獨使用HAp或TLP刺激DC所誘導的殺傷并無顯著效果，其原因可能為HAp對DC的免疫原性較弱且TLP在未連接HAp之前DC細胞對TLP的吞噬量非常小，無法誘導產(chǎn)生足夠強烈的針對腫瘤細胞的殺傷反應(yīng)。

為了進一步增強腫瘤細胞殺傷效應(yīng)，實驗中提高同源淋巴細胞的數(shù)量，將E∶T=10∶1提高到E∶T=20∶1。結(jié)果如圖8所示，HAp-TLP和HAp2-TLP2的殺傷效果明顯增強，而在E∶T=10∶1的實驗中，效應(yīng)淋巴細胞的殺傷效果基本飽和，提高淋巴細胞的數(shù)量后有更多的淋巴細胞被激活產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。隨著實驗天數(shù)的增加，抗腫瘤細胞免疫反應(yīng)并沒有隨之增強，而是保持在一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)。

(a) DC誘導的同源淋巴細胞對MCF-7殺傷效果檢測(E∶T=10∶1)

DCDC+HApDC+TLPDC+HAp-TLPDC+HAp2DC+TLP2DC+HAp2-TLP2DC---*--*DC+HAp--*--*DC+TLP-*---DC+HAp-TLP-*--DC+HAp2--*DC+TLP2--DC+HAp2-TLP2-

(b) 24 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=10∶1)

(c) 48 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=10∶1)

DCDC+HApDC+TLPDC+HAp-TLPDC+HAp2DC+TLP2DC+HAp2-TLP2DC-------DC+HAp--*--*DC+TLP-*--*DC+HAp-TLP--*-DC+HAp2--*DC+TLP2-*DC+HAp2-TLP2-

(d) 72 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=10∶1)

圖7 DC誘導的同源淋巴細胞對MCF-7殺傷效果檢測(E∶T=10∶1)

(a) DC誘導的同源淋巴細胞對MCF-7殺傷效果檢測(E∶T=20∶1)

DCDC+HApDC+TLPDC+HAp-TLPDC+HAp2DC+TLP2DC+HAp2-TLP2DC---**--**DC+HAp--*--**DC+TLP-**--**DC+HAp-TLP-**-DC+HAp2--*DC+TLP2-**DC+HAp2-TLP2-

(b) 24 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=20∶1)

(c) 48 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=20∶1)

DCDC+HApDC+TLPDC+HAp-TLPDC+HAp2DC+TLP2DC+HAp2-TLP2DC---*--**DC+HAp--*--**DC+TLP----**DC+HAp-TLP-*-*DC+HAp2--**DC+TLP2-**DC+HAp2-TLP2-

(d) 72 h時殺傷效果差異顯著性分析(E∶T=20∶1)

圖8 DC細胞誘導的同源淋巴細胞對MCF-7殺傷效果檢測(E∶T=20∶1)

2.7 DC細胞誘導的同源淋巴細胞殺傷特異性檢測

圖9為殺傷特異性檢測結(jié)果，從圖中可以看出，經(jīng)DC細胞刺激的淋巴細胞對異源細胞產(chǎn)生殺傷作用，其中圖9(d)對Hs578Bst的殺傷率達35%，這可能是因為正常細胞在脫離組織后會被淋巴細胞當作異物來清除，同時實驗中所用的Hs578Bst與淋巴細胞并不同源，并且普遍來說正常細胞要比腫瘤細胞更加脆弱，這可能是淋巴細胞對其殺傷效果明顯的原因。DC組、DC+HAp組、DC+TLP組對四種細胞的殺傷效果雖有不同，但組內(nèi)并無明顯差異，而DC+HAp-TLP組只在對MCF-7殺傷時(圖9(c))顯示出顯著的殺傷效果，對其他種類細胞并無顯著殺傷效果差異，說明DC+HAp-TLP誘導的淋巴細胞體外殺傷作用對MCF-7細胞具有一定特異性，其原因是使用的TLP是從同株MCF-7中裂解得到的，因此會產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。

圖9 DC細胞誘導的同源淋巴細胞殺傷特異性檢測

2.8 淋巴細胞自身體外抑癌效果檢測

為了排除實驗過程中淋巴細胞自身對這4種細胞的殺傷效應(yīng)，檢測未經(jīng)DC刺激的淋巴細胞直接對A549、Huh-7、MCF-7和Hs578Bst的體外殺傷效果。結(jié)果表明，在圖9中發(fā)現(xiàn)的各實驗組對這4種細胞的殺傷效果主要是由淋巴細胞引起的，并且在經(jīng)過DC刺激后這種殺傷效果會有一定增強；雖然針對不同的細胞殺傷效果有所差異，但是對同一種細胞，經(jīng)HAp、TLP和HAp-TLP刺激后的淋巴細胞的殺傷效果并沒有顯著差異，且隨著作用時間的增長并沒有顯示出與時間的關(guān)聯(lián)性。同時結(jié)合圖9(c)與圖10(c)，利用HAp-TLP刺激后的DC誘導的淋巴細胞的殺傷效果顯著高于未經(jīng)DC誘導的淋巴細胞(約高20%)，表明HAp-TLP促進DC吞噬TLP之后會誘導淋巴細胞產(chǎn)生更強的針對TLP來源細胞的殺傷效果。

圖10 淋巴細胞自身對多種細胞體外殺傷效果

3 結(jié) 論

利用水熱法成功制備長徑200～300 nm、短徑30～50 nm的長棒狀納米羥基磷灰石，該納米羥基磷灰石具有良好的可降解性和細胞生物相容性，對腫瘤裂解蛋白具有良好的負載能力。納米羥基磷灰石可顯著促進DC細胞對腫瘤抗原的吞噬，并顯著增強DC誘導的同源淋巴細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷作用，殺傷率可達40%以上。該研究證明納米羥基磷灰石顆粒在腫瘤免疫治療領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，可用于新型免疫佐劑、新型抗原載體、增強樹突細胞疫苗等開發(fā)領(lǐng)域。

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(責任編輯： 唐志榮)

Study on In Vitro Specificity Anticancer Immune Response Induced by Nanometer Hydroxyapatite

DONG Wentao1a, CHEN Kan1a, LI Shangao2, HE Huan1a, JIANG Guohua1b, KONG Xiangdong1

(1a.College of Life Sciences; 1b.College of Materials and Textile, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310053, China)

This study explores the feasibility of using hydroxyapatite (HAp) nanoparticles as adjuvant or antigen carrier in cancer immunotherapy. Rod-shaped HAp nanoparticles 200～300 nm in length and 30～50 nm in width were synthesized with hydrothermal method. Degradation experiment in vitro indicates that the degradation rate of Hap can reach 30% in 90 days. With human breast cancer cell ce-cropins as tumor antigen, Hap was made use to carry the tumor antigen and stimulate dendritic cells from peripheral blood mononuclear cells, the stimulated dendritic cells were co-cultured with homologous lymphocytes, the co-cultured homologous lymphocytes were separated, and the growth inhibition effect of the co-cultured homologous lymphocytes on A549, Huh-7, MCF-7 and Hs578Bst was tested. The results show that the prepared HAp nanoparticles have no nanotoxicity and are of high biocompatibility; HAp can significantly enhance the phagocytosis of dendritic cells on tumor antigens, and induce homologous lymphocytes to generate significant antigen-specific antitumor immunity, which a killing rate up to above 40%.

nano-hydroxyapatite; dendritic cell; tumor lysate protein; tumor immunotherapy

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.09.020

2016-10-28 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-08-07

國家自然科學基金項目(51672250，51272236)；浙江理工大學521人才培養(yǎng)計劃資助項目(1610032521302)

董文韜(1990-)，男，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事生物材料用于腫瘤治療交叉科學方面的研究。

孔祥東，kongxiangdong@gmail.com

Q279

A

1673- 3851 (2017) 05- 0727- 10