ACC脫氨酶菌株的分離篩選及對(duì)丹參毛狀根的影響

尤 紅，普 倩，文 芳，饒君鳳，李 歐,b，胡秀芳,b

(1.浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨江學(xué)院，杭州 310018)

ACC脫氨酶菌株的分離篩選及對(duì)丹參毛狀根的影響

尤 紅1a，普 倩1a，文 芳1a，饒君鳳2，李 歐1a,b，胡秀芳1a,b

(1.浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省植物次生代謝與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨江學(xué)院，杭州 310018)

為研究1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-Aminocylopropane-1-carboxylic acid，ACC)脫氨酶菌株對(duì)丹參次生代謝物合成的影響，使用篩選獲得的ACC脫氨酶活性最強(qiáng)的丹參根際菌株對(duì)丹參毛狀根進(jìn)行誘導(dǎo)，并分析誘導(dǎo)前后毛狀根生物量以及藥用活性物質(zhì)含量的差異。結(jié)果表明：獲得了ACC脫氨酶活性最高的菌株為DS3T3，其酶活力達(dá)到0.3899 U/mg，經(jīng)鑒定該菌株為假單胞菌屬細(xì)菌(Pseudomonassp.)；丹參毛狀根經(jīng)該菌株誘導(dǎo)處理后，其干重與對(duì)照組相比增加16.22%，主要酚酸物質(zhì)總量增加16.07%；對(duì)DS3T3進(jìn)行進(jìn)一步的測定結(jié)果表明，該菌株還具有固氮、產(chǎn)鐵載體及產(chǎn)吲哚-3-乙酸和水楊酸等植物激素的能力。因此，該菌株可作為提高丹參產(chǎn)量以及品質(zhì)的候選菌株。

ACC脫氨酶；生物固氮；鐵載體；植物激素；促生作用；丹參毛狀根；丹酚酸；假單胞菌

0 引 言

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，它作為重要的藥用植物，廣泛用于心腦血管疾病的治療[1]。丹參藥用有效成分主要分水溶性的丹酚酸類物質(zhì)(丹參素、丹酚酸B和迷迭香酸等)和脂溶性的丹參酮類物質(zhì)(丹參酮I、丹參酮IIA、二氫丹參酮和隱丹參酮等)，均有著非常明確的藥理活性[2]。目前，醫(yī)藥化工等行業(yè)對(duì)丹參需求量增加，然而丹參的野生資源銳減，種植丹參量雖多，但其生長周期長，藥用有效成分含量低，產(chǎn)地存在環(huán)境污染，這些因素嚴(yán)重影響種植丹參的品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。因此，需要使用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)來提高丹參的品質(zhì)和產(chǎn)量。

近幾年，丹參毛狀根是研究丹參藥效成分代謝調(diào)控用于提高丹參品質(zhì)的重要體系[4]。誘導(dǎo)是增加毛狀根的生物量及次生代謝物含量常見的有效策略[5]。丹參作為藥用植物，其次生代謝物的合成通常在受到環(huán)境脅迫的情況下發(fā)生，特別是在植物防御病原微生物入侵時(shí)。因此，微生物通常作為誘導(dǎo)子用于促進(jìn)植物次生代謝。植物根際促生微生物為常見的微生物誘導(dǎo)子之一，它依附于植物根表，直接或間接地影響植物的生長和發(fā)育[4]。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocylopropane-1-carboxylic acid，ACC)脫氨酶是許多植物根際促生細(xì)菌共有的特征性酶[6]。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)含有ACC脫氨酶活性的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能夠顯著提高番茄幼苗生長。Shaharoona等[8]發(fā)現(xiàn)含有ACC脫氨酶活性的假單胞菌(Pseudomonas)屬菌株在氮源豐富情況下能夠促進(jìn)玉米生長和產(chǎn)量。Holguin等[9]將含有ACC脫氨酶基因acdS的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)，結(jié)果提升該菌株的促生作用。因此，通過檢測ACC脫氨酶來篩選植物促生長菌的方法被廣泛使用[10]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于具ACC脫氨酶活性菌株對(duì)丹參生物量以及丹酚酸含量積累影響的研究尚未見報(bào)道。本文以ACC為唯一氮源篩選丹參根際ACC脫氨酶菌株并測定ACC脫氨酶活性，以獲得的酶活性最強(qiáng)菌株為材料，測定該菌對(duì)丹參毛狀根生長和次生代謝的影響，并進(jìn)一步測定該菌株的固氮、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)植物激素能力。

1 材料與方法

1.1 材料

a) 丹參樣品：野生丹參樣品采集于丹參主要產(chǎn)地陜西省商洛市。

b) 培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基PAF、篩選培養(yǎng)基DF和加富培養(yǎng)基ADF培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[11]。

1.2 ACC脫氨酶菌株的分離篩選及酶活力測定

1.2.1 ACC脫氨酶菌株的分離和初步篩選

將野生丹參根部緊密結(jié)合的土壤刷下作為根際土壤樣品，將同地區(qū)3個(gè)根際土壤樣品等量混合后，加入100 mL無菌水，振蕩，獲得土壤懸浮液。將土壤懸浮液接入50 mL PAF培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)2 d；取1 mL PAF培養(yǎng)液，接種于50 mL DF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后，取1 mL DF培養(yǎng)液接種于ADF培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d。稀釋ADF培養(yǎng)液，并將其涂布于ADF固體平板上，28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落并純化，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 ACC脫氨酶活力測定

將保藏菌株活化后，參照Bradford法測定細(xì)菌細(xì)胞提取液中總蛋白質(zhì)含量[12]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Saleh等[13]的方法測定ACC脫氨酶活力，比活力的計(jì)算公式為：

測定結(jié)果為重復(fù)三次的平均值。

1.3 ACC脫氨酶菌株對(duì)丹參毛狀根生物量以及次 生代謝的影響

1.3.1 毛狀根制樣

毛狀根由本實(shí)驗(yàn)室保存。無菌條件下，在50 mL的6,7-V培養(yǎng)基中加入0.2 g生長旺盛的丹參毛狀根，25 ℃，110 r/min避光振蕩培養(yǎng)18 d。

1.3.2 ACC脫氨酶菌株誘導(dǎo)子的制備及誘導(dǎo)

將保存在-80 ℃冰箱的菌株活化后，接入50 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；28 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)3 d；4 ℃，12000 r/min，離心10 min，收集上清液。使用0.22 μm無菌過濾器過濾除菌，濾液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)子，放入4 ℃冰箱備用。

在培養(yǎng)18 d后的毛狀根中加入制備好的誘導(dǎo)子1.5 mL，對(duì)照組中加入相同體積的培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)重復(fù)，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.3.3 丹參毛狀根生物量以及次生代謝物含量的測定

收集誘導(dǎo)后的毛狀根，吸水紙吸干，45 ℃干燥至恒重，稱量。用研缽磨碎烘干的毛狀根，過0.45 mm篩網(wǎng)，稱取0.05 g，加入5 mL 70%的甲醇提取液，超聲45 min(間或顛倒混合)，8000 r/min離心10 min，取上清過0.45 μm濾膜備用。

丹酚酸類成分含量的測定采用高效液相法，所測定的物質(zhì)為丹參素、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B和肉桂酸。所使用的高效液相色譜儀為Waters 1525，檢測器為Waters 2996，色譜柱為ZORBAX Extend-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。色譜條件為：流速1 mL/min，柱溫30 ℃，上樣體積20 μL，檢測波長為288 nm；以乙腈和0.026%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，梯度設(shè)定參照張順倉等的方法[14]。

1.4 固氮、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)植物激素能力測試

1.4.1 固氮能力測定

在無氮培養(yǎng)基中接入待測菌株，28 ℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)一周，再轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，重復(fù)5次，觀察菌株的生長狀況。

1.4.2 產(chǎn)鐵載體能力測定

在CAS產(chǎn)鐵載體能力檢測平板上接入待測菌株，28 ℃，220 r/min，培養(yǎng)一周，觀察培養(yǎng)基上有無橙色暈圈出現(xiàn)。

1.4.3 產(chǎn)植物激素能力測定

菌株接入50 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，稀釋至OD600為1.0；4 ℃，12000 r/min，離心5 min，取上清過0.22 μm膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定植物生長素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、細(xì)胞分裂素和赤霉素在內(nèi)的43種植物激素，具體種類和測定方法參照Cao等方法[15]。測定結(jié)果為三次生物重復(fù)值。

1.5 形態(tài)特征測定和16S rRNA基因序列測定及 系統(tǒng)發(fā)育分析

1.5.1 形態(tài)觀察以及生理生化測定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的方法[16]，對(duì)具有ACC脫氨酶的菌株進(jìn)行形態(tài)以及生理生化測定。

1.5.2 16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

以十六烷基三甲基溴化銨法提取細(xì)菌總DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增；所用引物、反應(yīng)體系，反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[17]。目的基因PCR產(chǎn)物送往蘇州金維智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果采用EzTaxon和美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并采用Mega 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果分析

2.1 ACC脫氨酶活性菌株的篩選以及酶活性檢測

從ACC為唯一氮源的ADF培養(yǎng)基上分離到25株丹參根際微生物，ACC脫氨酶活性測定結(jié)果表明，酶活力較高的菌株編號(hào)分別為DS1G1、DS3G1和DS3T3。這3株菌株的酶活力見表1，其中酶活力最高的為DS3T3(0.3899 U/mg)，最低的為DS3G1(0.1424 U/mg)。

表1 ACC脫氨酶菌株的酶活力

2.2 菌株對(duì)丹參毛狀根生物量以及丹酚酸類物質(zhì)積累的影響

選取酶活力最高的菌株DS3T3用于分析其對(duì)丹參毛狀根生物量以及丹酚酸類物質(zhì)積累的影響，結(jié)果如表2所示。菌株DS3T3處理后，丹參毛狀根的干重比對(duì)照組增加16.22%；丹參素、丹酚酸B以及肉桂酸含量增加，增加量分別為8.15%、27.94%和62.77%，而咖啡酸和阿魏酸的含量降低；綜合分析該菌株對(duì)六種酚酸總含量的影響，結(jié)果顯示含量增加16.07%。

表2 菌株DS3T3對(duì)丹參毛狀根生物以及丹酚酸類物質(zhì)積累的影響

2.3 菌株的固氮、產(chǎn)鐵載體和產(chǎn)植物激素能力

為了研究菌株DS3T3對(duì)丹參毛狀根的促生長以及促丹酚酸物質(zhì)合成的機(jī)理，進(jìn)一步測定菌株的固氮、產(chǎn)鐵載體和植物激素能力。菌株DS3T3固氮能力檢測結(jié)果如圖1所示，菌株DS3T3能夠在無氮培養(yǎng)基上生長，說明該菌具有固氮能力。DS3T3產(chǎn)鐵載體能力檢測結(jié)果如圖2所示，從圖中可見，在CAS檢測平板上，菌株DS3T3周圍出現(xiàn)橙色暈圈，表明該菌株有產(chǎn)鐵載體能力。菌株DS3T3產(chǎn)生的植物激素種類和含量如表3所示。由表3可知，菌株DS3T3發(fā)酵液含有多種不同的植物激素，主要為吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)及其衍生物，IAA的含量最高，為559.182 ng/mL，其次為水楊酸、反式-玉米素-α-葡萄糖苷和反式-玉米素-7-葡萄糖苷，含量分別為112.441、35.551 ng/mL和14.830 ng/mL。

圖1 DS3T3固氮能力分析

圖2 DS3T3產(chǎn)鐵載體能力分析

植物激素含量/(ng·mL-1)吲哚-3-乙酸(IAA)559.182±0.782吲哚-3-乙?；?L-丙氨酸(IAA-Ala)1.269±0.009吲哚-3-乙?；?L-天冬氨酸(IAA-Asp)10.915±0.021吲哚-3-乙?；?L-亮氨酸(IAA-Leu)1.051±0.028吲哚-3-乙?；?L-苯丙氨酸(IAA-Phe)0.133±0.024N6-異戊烯基腺嘌呤(iP)2.201±0.014水楊酸(SA)112.441±0.665反式-玉米素-7-葡萄糖苷(Z7G)14.830±0.008反式-玉米素-α-葡萄糖苷(ZOG)35.551±0.068

注：表中未列出的植物激素為菌株DS3T3中未檢測出的。

2.4 形態(tài)特征與菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)及生理生化特征

菌株DS3T3在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，形成淺黃色、表面濕潤有光澤、圓形凸起且邊緣整齊的菌落(圖3)。在顯微鏡下觀察到其菌體為桿狀，有鞭毛，無芽孢，革蘭氏陰性(圖4和圖5)。DS3T3生理生化特征如表4所示，菌株DS3T3的生理生化特征與假單胞桿菌屬(Pseudomonas)相似，它能產(chǎn)生過氧化氫酶和氧化酶，不能產(chǎn)生淀粉酶、酪蛋白酶和纖維素酶，不能利用檸檬酸鹽，不產(chǎn)生H2S等。

圖3 DS3T3菌落形態(tài)

圖4 DS3T3菌體形態(tài)

圖5 DS3T3革蘭氏染色結(jié)果

生理生化特征結(jié)果生理生化特征結(jié)果革蘭染色-V.P試驗(yàn)+運(yùn)動(dòng)能力+M.R試驗(yàn)-產(chǎn)芽孢-纖維素水解-過氧化氫酶反應(yīng)+檸檬酸鹽利用-氧化酶反應(yīng)+明膠液化-固氮作用+吐溫20-產(chǎn)鐵載體+吐溫80-產(chǎn)H2S-酪蛋白水解-淀粉水解-硝酸鹽還原+

2.4.2 16S rRNA基因比對(duì)及菌株鑒定

16S rRNA基因比對(duì)結(jié)果顯示菌株DS3T3與杰氏假單胞菌的模式菌株P(guān).jesseniiCIP 105274T序列相似性最高，為99.93%。圖6顯示菌株DS3T3與其相似度最高的菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明菌株DS3T3與P.jesseniiCIP 105274T在同一分支上。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化特征、16 rRNA基因比對(duì)結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹等等結(jié)果表明：菌株DS3T3屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

圖6 菌株DS3T3 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹注：系統(tǒng)發(fā)育樹采用鄰接法進(jìn)行構(gòu)建；分支上的數(shù)值表示經(jīng)1000次計(jì)算后的Bootstrap值；括號(hào)內(nèi)為GenBank登錄號(hào)；比例尺表示菌株間的遺傳距離。

3 討 論

植物根際微生物是影響植物生長發(fā)育的主要菌株類型之一。目前，許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類菌株中有許多具有ACC脫氨酶活性的菌株，而ACC脫氨酶是促生長菌株的特征酶，本文從丹參根際中篩選具有ACC脫氨酶活性并且能夠促進(jìn)丹參活性成分合成的菌株作為優(yōu)良的微生物資源用于提高丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)ACC脫氨酶活性高于20 nmol -α KA/(mg·h)時(shí)，可促進(jìn)植物生長[18]。從丹參根際中分離DS1G1、DS3G1和DS3T3菌種的酶活力均高于這個(gè)值，而菌株DS3T3的ACC脫氨酶活性最高，達(dá)0.3899 U/mg。通過生理生化以及16S rRNA基因鑒定，得出DS3T3屬于假單胞菌屬，其酶活力明顯高于之前報(bào)道的同菌屬P.brassicacearumZy-2-1(酶活力為0.088 U/mg)[19]和惡臭假單胞菌(P.putida)UW4(0.056 U/mg)[19]以及熒光假單胞菌(P.fluorescens)STAD384(酶活力為0.143～0.208 U/mg)[20]。通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株還具有固氮、產(chǎn)鐵載體和高產(chǎn)植物激素等特征。生物固氮能力可以為植物提供豐富的氮源，產(chǎn)鐵載體能力能夠幫助植物更好的攝取環(huán)境中的鐵源[21]，兩種能力都能為植物提供生長所需的原料，促進(jìn)植物生長。另外，有研究表明，微生物源的植物激素有著調(diào)控植物生長和發(fā)育的能力[22]，而DS3T3所產(chǎn)生的生長素、戊烯腺嘌呤和玉米素等植物激素已被證實(shí)有該能力。例如，綠針假單胞菌(P.chlororaphis)和溫哥華假單胞菌(P.vancouverensis)分泌的IAA能夠分別促進(jìn)青椒和小麥的生長[23-24]；戊烯腺嘌呤和玉米素分別對(duì)覆盆子和越橘有一定的促生長作用[25-26]。在本文中，丹參毛狀根經(jīng)菌株DS3T3誘導(dǎo)后，其干重與對(duì)照組相比增加16.22%，說明該菌株的促生長能力顯著。因此，該菌株有著多種促生長特征，并且實(shí)際效果明顯，在植物促生長方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

菌株DS3T3除具促生長作用外，對(duì)丹酚酸類物質(zhì)合成也有顯著的影響，但其影響因丹酚酸種類而異。綜合分析，六種丹酚酸的總含量與對(duì)照組相比增加16.07%。其中，評(píng)估丹參品質(zhì)的重要指標(biāo)之一丹酚酸B的含量增加了27.94%，增加量非常顯著。而迷迭香酸的含量有小幅降低，可能原因是該物質(zhì)是丹酚酸B重要的前體物質(zhì)[27]，其在DS3T3的作用下更高效率的轉(zhuǎn)化為丹酚酸B。目前，許多生物誘導(dǎo)子都能顯著促進(jìn)丹參酮類物質(zhì)含量的積累，而生物誘導(dǎo)子對(duì)丹酚酸類物質(zhì)含量提高的研究尚未見報(bào)道，所以菌株DS3T3在其中的作用機(jī)制值得關(guān)注。目前研究表明，丹參毛狀根在水楊酸作用下，其丹酚酸B和迷迭香酸的含量明顯增加[28-29]。而在該菌株的發(fā)酵液中測得豐富的植物激素，且水楊酸的含量較高，達(dá)到112.441 ng/mL。所以，推測水楊酸可能是其中起作用的主要物質(zhì)之一，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本文獲得的ACC脫氨酶活性最強(qiáng)的丹參根際菌株DS3T3(Pseudomonassp.)，確定DS3T3酶活力達(dá)0.3899 U/mg，并且有多種其它促生長特征，包括固氮、產(chǎn)鐵載體以及產(chǎn)植物激素的能力；該菌株顯著促進(jìn)丹參毛狀根的生物量；DS3T3還能夠促進(jìn)丹參毛狀根中丹酚酸類物質(zhì)的合成。故該菌株可作為提高丹參產(chǎn)量以及品質(zhì)的候選菌株。

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(責(zé)任編輯： 唐志榮)

Isolation and Screening of Bacteria Strain with ACC Deaminase Activity and Its Effect on Hairy Root ofSalviaMiltiorrhiza

YOU Hong1a, PU Qian1a, WEN Fang1a, RAO Junfeng2, LI Ou1, HU Xiufang1

(1a.College of Life Science; 1b.Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.Linjiang School, Hangzhou Vocational and Technical College, Hangzhou 310018, China)

To study the effect of 1-aminocylopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase from bacteria strain on synthesis of secondary metabolite ofSalviamiltiorrhiza, rhizosphere bacteria strain of the highest activity of ACC deaminase obtained via screening was used to induce hairy roots ofS.miltiorrhiza, and analysis was made on the difference of hairy root biomass and medicinal active substance content before and after induction. The results indicate that the bacteria strain with highest ACC deaminase activity is DS3T3 (of deaminase activity up to 0.3899 U/mg), which turns out to bePseudomonassp. through identification. Through treatment with the bacteria strain (DS3T3), the dry weight of hairy root ofS.miltiorrhizahas increased by 16.22% comparing with the control group, and the total phenolic acids by 16.07%. Further measurement of DS3T3 shows that the bacteria strain also has the abilities of nitrogen fixation, iron production and the production of phytohormones such as indole-3-acetic acid, and salicylic acid. Therefore, the bacteria strain (DS3T3) can be used to improve the yield and quality ofS.miltiorrhiza.

ACC deaminase; biological nitrogen fixation; siderophore; phytohormone; growth-promoting effect;Salviamiltiorrhizahairy root; salvianolic acid;Pseudomonas

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.09.019

2017-03-20 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-08-07

浙江省公益農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2015C32104)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY15C010005)；浙江理工大學(xué)啟動(dòng)基金項(xiàng)目(14042217-Y)

尤紅(1990-)，女，浙江嘉興人，碩士研究生，主要從事藥用植物次生代謝調(diào)控方面的研究。

胡秀芳，E-mail：huxiuf@zstu.edu.cn

Q939.96

A

1673- 3851 (2017) 05- 0720- 07