非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs耐藥
——小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

張文秋 李永琦 吳荻

近年來，由于分子靶向藥物對攜帶敏感突變基因的癌細(xì)胞存在精準(zhǔn)性和敏感性，分子靶向治療已逐漸在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治療中占據(jù)重要地位，現(xiàn)已成為NSCLC的一線治療方案[1,2]。其中在使用表皮生長因子受體酪氨酸酶激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）治療攜帶EGFR基因敏感突變的患者中，相比傳統(tǒng)的化療方案，不僅改善了患者的無進(jìn)展生存期，而且提高了患者的生活質(zhì)量[3-6]。但是，EGFR-TKI耐藥的產(chǎn)生幾乎是不可避免的，中位無進(jìn)展生存期僅為11個月。2006年，Zakowski等[7]首次發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過EGFR-TKI治療后NSCLC轉(zhuǎn)化為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）繼而出現(xiàn)耐藥的案例。2013年，NSCLC的NCCN指南明確指出EGFR-TKI的耐藥機制之一為NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC，大約占3%-15%的比例[8-10]。相比經(jīng)典SCLC，轉(zhuǎn)化的SCLC主要發(fā)生在攜帶EGFR基因敏感突變的不吸煙的亞洲女性腺癌患者[11-13]。

1 NSCLC與SCLC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞的共同起源

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSCs）是指存在于腫瘤組織中的具有干細(xì)胞性質(zhì)的一小部分細(xì)胞群體，具有自我更新、分化潛能及高致瘤性和耐藥性的特點。

目前主流觀點認(rèn)為NSCLC與SCLC細(xì)胞來源于共同的腫瘤干細(xì)胞，即兩者具有“共同起源”。Tatematsu等[14]報道了攜帶EGFR敏感突變腫瘤細(xì)胞的起源細(xì)胞具有分化為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞的潛能，如分化為SCLC細(xì)胞。臨床前證據(jù)表明，在靶向干擾TP53基因和RB1基因的條件下，肺泡II型細(xì)胞也具有轉(zhuǎn)化為SCLC細(xì)胞的潛能[15]。此外，肺泡II型細(xì)胞還可作為攜帶EGFR基因突變的腺癌細(xì)胞的起源細(xì)胞[16,17]。因其同時具有轉(zhuǎn)化為NSCLC細(xì)胞和SCLC細(xì)胞的潛能，故肺泡II型細(xì)胞可視為腺癌和SCLC的腫瘤干細(xì)胞[18]。EGFR在肺泡II型細(xì)胞中具有重要作用[19,20]，分化良好的肺泡II型細(xì)胞EGFR高表達(dá)[21]。Miettinen等[20,22]認(rèn)為，EGFR基因突變和活躍的EGFR信號共同驅(qū)動肺泡II型細(xì)胞的增殖和分化。當(dāng)EGFR信號被EGFR-TKI抑制時，肺泡II型細(xì)胞可以發(fā)生其他關(guān)鍵基因事件，如RB1基因缺失，促進(jìn)其在獨立于EGFR信號的情況下轉(zhuǎn)化為SCLC，并產(chǎn)生對EGFR-TKI的耐藥；然而，若肺泡II型細(xì)泡發(fā)生其他耐藥突變，如EGFR T790M突變，EGFR信號可以促使肺泡II型細(xì)胞保留腺癌組織學(xué)成分[19]。

2 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉(zhuǎn)化發(fā)生機制的幾種假說

NSCLC發(fā)生EGFR-TKIs耐藥轉(zhuǎn)化為SCLC的發(fā)生機制仍不清楚。目前，針對該機制學(xué)者們共提出了兩種假說，分別為腫瘤異質(zhì)性假說、NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC假說。

2.1 腫瘤異質(zhì)性假說 腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的特征之一。腫瘤異質(zhì)性是由癌細(xì)胞中遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)差異造成的，這些因素共同作用下，導(dǎo)致了帶有不同表型的疾病現(xiàn)象[23]。

由于腫瘤異質(zhì)性，在EGFR-TKI治療前，腫瘤組織中可能同時存在NSCLC和SCLC細(xì)胞兩種成分，但病理組織學(xué)活檢只找到NSCLC成分，在EGFR-TKI對NSCLC起效的過程中，SCLC的成分逐漸顯現(xiàn)出來，并占據(jù)主導(dǎo)地位[24]。

目前針對這種假說尚有爭議。支持者認(rèn)為穿刺活檢標(biāo)本僅取材部分腫瘤組織，基于部分組織的病理診斷具有局限性，不能全面反映整體腫瘤組織的情況，有NSCLC和SCLC細(xì)胞兩種成分同時存在的可能性。Mangum等[25]報道，同時含有NSCLC和SCLC細(xì)胞成分的異質(zhì)性腫瘤在穿刺活檢標(biāo)本及手術(shù)切除標(biāo)本中，分別占1%-3.2%、9%-26%的比例。由于EGFR-TKI治療后二次活檢的病理組織學(xué)和基因檢測結(jié)果絕大多數(shù)是通過穿刺活檢標(biāo)本而非手術(shù)切除標(biāo)本獲得，因此這些病理學(xué)綜合信息受到限制，由此可能造成抽樣誤差[26]。然而，反對者認(rèn)為，這種假說是錯誤的。EGFR-TKI對攜帶EGFR敏感突變的NSCLC治療有效且療效顯著，患者無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）可達(dá)1年甚至數(shù)年。SCLC的生物學(xué)行為特點為進(jìn)展迅速、臨床癥狀明顯，若腫瘤早期就含有SCLC成分，在治療過程中將會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀如刺激性咳嗽、呼吸困難等，并發(fā)生早期轉(zhuǎn)移[9]。

2.2 NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC假說 在腫瘤干細(xì)胞增殖分化的某個階段，腫瘤干細(xì)胞先向NSCLC細(xì)胞定向分化，在NSCLC細(xì)胞增殖發(fā)展的過程中，接受某些外界壓力，如EGFR-TKI，轉(zhuǎn)化為SCLC。有一些學(xué)者支持該觀點。Sequist等[7,8,10,27,28]認(rèn)為，由于轉(zhuǎn)化的SCLC細(xì)胞仍然攜帶原有EGFR基因敏感突變，故可以證明SCLC并非新發(fā)[9]，而是由原有NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。EGFR基因突變既可以存在于NSCLC細(xì)胞，又可以存在于SCLC細(xì)胞，進(jìn)一步提示了含有EGFR基因突變的腫瘤干細(xì)胞的存在，該腫瘤干細(xì)胞可能為EGFR-TKI耐藥的起源[29,30]。

既往研究表明，EGFR-TKI并不是誘導(dǎo)NSCLC向SCLC轉(zhuǎn)化的唯一因素。NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC的發(fā)生可以獨立于針對EGFR的抑制[10]。1986年的一項統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，5%的患者最初病理組織學(xué)診斷為NSCLC，化放療耐藥后再次行活檢，病理組織學(xué)診斷為SCLC[31]。Watanabe等[32]選取手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)診斷，發(fā)現(xiàn)6例最初診斷為腺癌的患者發(fā)生了SCLC轉(zhuǎn)化，其中僅有2例患者接受過EGFRTKI的治療，1例患者未接受任何治療。

除此之外，SCLC轉(zhuǎn)化的發(fā)生還可以獨立于EGFR基因狀態(tài)。Sequist等[8]對接受放化療后的NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)EGFR野生型NSCLC比EGFR突變型NSCLC發(fā)生SCLC轉(zhuǎn)化的可能性小。

根據(jù)以上研究可以推測，EGFR-TKI及EGFR基因狀態(tài)均不是促進(jìn)SCLC轉(zhuǎn)化的獨立因素，但均可以作為促進(jìn)SCLC轉(zhuǎn)化的誘發(fā)因素，即攜帶EGFR敏感基因突變的NSCLC本身具有轉(zhuǎn)化為SCLC的潛質(zhì)，在EGFR-TKI的暴露環(huán)境中，更易轉(zhuǎn)化為SCLC。

2.3 兩種假說之間的聯(lián)系與區(qū)別 上述兩種假說之間具有一定關(guān)聯(lián)。根據(jù)轉(zhuǎn)化時間節(jié)點不同，可將轉(zhuǎn)化的機制分為“同時性假說”和“異時性假說”，即“腫瘤異質(zhì)性假說”和“NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC假說”。前者發(fā)生的轉(zhuǎn)化時間節(jié)點為使用EGFR-TKI治療之前，后者發(fā)生的轉(zhuǎn)化時間節(jié)點為使用EGFR-TKI治療之后（圖1）。

3 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉(zhuǎn)化的分子機制

雖然越來越多的SCLC轉(zhuǎn)化作為EGFR-TKI耐藥機制的案例被報道出來，但其分子機制仍然未知。許多研究已發(fā)現(xiàn)一些與SCLC轉(zhuǎn)化相關(guān)甚至起到重要作用的分子事件。

3.1 RB1基因缺失 RB1基因在細(xì)胞周期G1期起調(diào)控作用，RB1基因的缺失會造成細(xì)胞周期G1期失控，在SCLC轉(zhuǎn)化中起重要作用。經(jīng)典SCLC 100%存在RB1基因缺失。高頻率的RB1基因缺失發(fā)生于SCLC、前列腺癌、膀胱癌[33]。后兩者都經(jīng)歷了小細(xì)胞分化[34,35]。

動物實驗證明RB1基因的缺失選擇性影響神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤，導(dǎo)致原發(fā)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加[36]。分子測序證實，EGFR突變耐藥轉(zhuǎn)化的SCLC細(xì)胞，100%存在RB1基因缺失。SCLC轉(zhuǎn)化前的NSCLC及SCLC轉(zhuǎn)化后仍存在的NSCLC成分均不存在這種基因改變，提示RB1基因缺失在SCLC轉(zhuǎn)化中扮演重要角色[22]。

研究發(fā)現(xiàn)單獨敲除RB1基因并未引起EGFR基因突變細(xì)胞向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化，證明SCLC轉(zhuǎn)化不僅僅依賴于RB1基因的缺失[22]。同時，RB1基因缺失的腺癌細(xì)胞的存在，進(jìn)一步證明了僅有RB1基因的缺失對SCLC轉(zhuǎn)化是不夠的[37]。

3.2 P53基因失活 P53基因為抑癌基因，若P53基因失活，將失去其對細(xì)胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的正常調(diào)控作用，對腫瘤形成起重要作用。

研究證明靶向干涉神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的P53基因和RB1基因會導(dǎo)致SCLC的發(fā)生[38,39]，靶向斷裂肺泡II型細(xì)胞的P53基因和RB1基因也會導(dǎo)致SCLC的發(fā)生[15]，這不僅進(jìn)一步證明了肺泡II型細(xì)胞可作為SCLC的起源細(xì)胞，而且證明了P53基因和RB1基因在SCLC轉(zhuǎn)化中扮演著重要角色。

3.3 PTEN M264I基因突變 PTEN基因為抑癌基因，作用為負(fù)性調(diào)控PI3K-AKT途徑，起到促進(jìn)凋亡和抗增殖的作用[40]。在研究肺腺癌經(jīng)吉非替尼治療后發(fā)生SCLC轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)移至肝臟的案例中，發(fā)生SCLC轉(zhuǎn)化的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)PTEN M264I基因突變，仍為腺癌成分的腫瘤組織中未發(fā)現(xiàn)該基因突變[41]，此突變在腺癌中極少見[42-44]，據(jù)此可以推測其在SCLC轉(zhuǎn)化中具有一定作用。

3.4 PIK3CA基因突變 PI3K/AKT信號通路是重要的抗凋亡通路，而且與新生血管的生成有關(guān)。EGFR與其配體結(jié)合后，引起自身磷酸化和二聚體化，激活PI3K/AKT下游信號通路，并產(chǎn)生一系列磷酸化效應(yīng)，這些效應(yīng)蛋白共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)合成。

Sequist曾報道SCLC轉(zhuǎn)化伴有PIK3CA基因突變的案例，提示PIK3-AKT通路的激活可能參與SCLC的轉(zhuǎn)化。然而，PIK3CA基因的激活突變還出現(xiàn)在大約5%的NSCLC患者中[45]。所以，對SCLC轉(zhuǎn)化的發(fā)生而言，僅有該通路的激活是不夠的。

4 轉(zhuǎn)化的SCLC和經(jīng)典SCLC之間的相似性

轉(zhuǎn)化的SCLC與經(jīng)典SCLC在基因、形態(tài)學(xué)、臨床表現(xiàn)、藥物敏感性等方面具有相似性[22]。

基因上，RNA和微小RNAs表達(dá)的等級聚類分析表明，轉(zhuǎn)化的SCLC與經(jīng)典SCLC相似，免疫組織化學(xué)染色顯示神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物如突觸小泡蛋白、嗜鉻粒蛋白、神經(jīng)元粘附分子陽性表達(dá)[8,10,24,34,46,47]；形態(tài)學(xué)上，兩者均表現(xiàn)為小細(xì)胞；臨床表現(xiàn)上，SCLC進(jìn)展迅速、易早期轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化后的SCLC增殖率快速增加、臨床表現(xiàn)快速惡化，轉(zhuǎn)移較早；藥物敏感性上，兩者均對標(biāo)準(zhǔn)SCLC化療方案敏感[22]。

雖然上述幾個方面體現(xiàn)了轉(zhuǎn)化SCLC與經(jīng)典SCLC之間的相似性，然而，已發(fā)現(xiàn)一組經(jīng)典表達(dá)在NSCLC中的微小RNA及一組經(jīng)典存在于NSCLC的甲基化DNA可表達(dá)及存在于一些轉(zhuǎn)化的SCLC。因此轉(zhuǎn)化的SCLC并不能被歸為經(jīng)典SCLC，也許可被歸為一種新的SCLC亞型[22]。

5 NSCLC EGFR-TKIs耐藥-SCLC轉(zhuǎn)化的治療對策

轉(zhuǎn)化SCLC與經(jīng)典SCLC具有以上多方面的相似性，可以給予“耐藥機制為基礎(chǔ)”的治療。使用標(biāo)準(zhǔn)SCLC化療方案“順鉑/卡鉑+依托泊苷”治療轉(zhuǎn)化SCLC，療效大多顯著[8]，但有效治療過后，由于轉(zhuǎn)化SCLC具有較強侵襲性以及患者體力狀況（performance status, PS）評分等因素，大多數(shù)患者的病情在初期得到緩解后迅速進(jìn)展直至患者死亡。研究數(shù)據(jù)表明，相比經(jīng)典SCLC，轉(zhuǎn)化SCLC的預(yù)后相對較差。而且，SCLC轉(zhuǎn)化在EGFR-TKI難治的轉(zhuǎn)移性腫瘤中占重要部分[41]。

除此之外，由于攜帶EGFR敏感突變的SCLC對EGFRTKI治療有效，因此可推測NSCLC轉(zhuǎn)化的SCLC可能對EGFR-TKI同樣有效[9,48]，但較NSCLC療效差。Sequist等[8]報道稱，轉(zhuǎn)化為SCLC的患者在接受EGFR-TKI與化療治療的過程中，腫瘤對EGRR-TKI可以經(jīng)歷“耐藥-重新敏感-耐藥”的改變，同時伴隨基因和表型改變（圖2）。該案例表明，沒有持續(xù)的EGFR-TKI選擇性壓力，耐藥機制所涉及的基因和表型改變會發(fā)生丟失，這些腫瘤對第二輪EGFRTKI治療敏感有效。在不同藥物治療的選擇性壓力之下，會出現(xiàn)不同克隆的選擇性[22]。同時，該案例還提示了腫瘤對EGFR-TKI耐藥具有潛在的可逆轉(zhuǎn)性，進(jìn)一步強調(diào)了一次活檢不足以指導(dǎo)后續(xù)治療，再次活檢甚至三次活檢具有重要指導(dǎo)意義[8]。

Shoemaker等[49]稱，在臨床前研究中，navitoclax（ABT-263），一種BCL-2、BCL-XL抑制劑，在治療經(jīng)典SCLC中顯示出顯著的療效。盡管近期臨床試驗結(jié)果證明單藥ABT-263僅在少部分患者中取得療效[50]，但聯(lián)合用藥方案仍在探索中[51]。Niederst Sequist等[22]試驗報道稱，攜帶EGFR基因敏感突變NSCLC轉(zhuǎn)化的SCLC細(xì)胞系不僅對ABT-263高度敏感，促使其產(chǎn)生強效凋亡作用，而且敏感度明顯強于T790M基因突變耐藥的NSCLC細(xì)胞系。這些結(jié)果表明含有ABT-263的聯(lián)合方案在轉(zhuǎn)化SCLC的治療中非常具有潛力。

Kenichi[41]稱，在EGFR-TKI耐藥過程中，腫瘤可能同時含有多個EGFR-TKI難治性耐藥機制，如T790M二次突變和SCLC轉(zhuǎn)化共同存在于同一個患者。因此，在EGFRTKI耐藥的后續(xù)治療中，考慮到一個患者體內(nèi)可能有不同耐藥機制以及腫瘤存在內(nèi)在異質(zhì)性是重要的。

6 研究的局限性及遺留問題

圖 1 “共同起源”與兩種假說之間的聯(lián)系與區(qū)別。A：共同起源；B：腫瘤異質(zhì)性假說；C：NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC假說。腫瘤干細(xì)胞（CSC1）在增殖分化的過程中，分化為具有特定分化能力的腫瘤定向干細(xì)胞（CSC2），該腫瘤定向干細(xì)胞既可能同時分化為NSCLC細(xì)胞和SCLC細(xì)胞，形成異質(zhì)性腫瘤，EGFR-TKI可減少或消滅NSCLC細(xì)胞，而SCLC細(xì)胞殘留并逐漸占主導(dǎo)作用，即“腫瘤異質(zhì)性假說”，也可能先分化為NSCLC細(xì)胞，該NSCLC細(xì)胞在EGFRTKI的壓力下轉(zhuǎn)化為SCLC細(xì)胞，即“NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC假說”。Fig 1 The association and difference between the origin of cancer stem cell and two hypothesis. A: The origin of cancer stem cell; B: The hypothesis of the tumor heterogeneity; C: The hypothesis of the transformation from non-small cell lung cancer (NSCLC) to small cell lung cancer (SCLC). During the process of proliferation and differentiation, an original cancer stem cell (CSC1) differentiate into an cancer stem cell (CSC2) with the ability of specific differentiation. This cancer stem cell (CSC2) can not only differentiate into NSCLC and SCLC cell and form the tumor heterogeneity at the same time, and EGFR-TKI can reduce or eliminate NSCLC cells, and SCLC cells residue and gradually play a leading role, which is the hypothesis of the tumor heterogeneity, but also differentiate into NSCLC cell firstly, then transform into SCLC under the pressure of EGFR-TKI, which is the hypothesis of the transformation from NSCLC into SCLC.

圖 2 腫瘤對EGFR-TKI敏感或耐藥及其基因和表型變化。攜帶EGFR L858R敏感突變的NSCLC經(jīng)歷EGFR-TKI治療后轉(zhuǎn)化為SCLC，轉(zhuǎn)化SCLC保留原有EGFR L858R 突變，同時攜帶新發(fā)PIC3CA突變，經(jīng)過7個月的化療，再次活檢，發(fā)現(xiàn)SCLC重新轉(zhuǎn)化為NSCLC，該NSCLC只攜帶原有EGFR L858R敏感突變，新發(fā)PIC3CA突變消失，此時繼續(xù)給予EGFR-TKI，再次因SCLC轉(zhuǎn)化的發(fā)生產(chǎn)生耐藥，此SCLC同樣保留原有EGFR L858R基因突變，同時含有新發(fā)PIC3CA突變。Fig 2 The change of the sensitivity or resistance and gene and phenotype of tumor after the treatment of EGFR-TKI. NSCLC which had sensitive EGFR L858R mutation transformed into SCLC after the treatment of EGFR-TKI, and the transformed SCLC not only retained the original EGFR L858R mutation, but also contained new PIC3CA mutation. After 7 months of chemotherapy, the second biopsy revealed NSCLC, which only contained sensitive EGFR L858R mutation, and no new PIC3CA mutation was found. At this time, EGFR-TKI was given again, then the resistance occured again because of SCLC transformation, which not only retained the original EGFR L858R mutation, but also contained new PIC3CA mutation.

目前，盡管對于SCLC轉(zhuǎn)化作為EGFR-TKI耐藥機制之一的研究已取得較大進(jìn)展，但是仍有一些需要進(jìn)一步研究和探討的問題。

由于SCLC轉(zhuǎn)化的發(fā)生，對SCLC進(jìn)行重新分型是必要的。轉(zhuǎn)化SCLC也許可以被歸為SCLC的一個亞型，即源于腫瘤干細(xì)胞分化或NSCLC轉(zhuǎn)化并且含有EGFR基因敏感突變的一類SCLC，其無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，預(yù)后差，總生存期短。

值得注意的是，發(fā)生SCLC轉(zhuǎn)化的大部分患者為不吸煙女性，這提示性別因素比如激素水平或者激素受體水平的不同是否在揭示SCLC轉(zhuǎn)化的過程中起到線索作用[41]?

盡管EGFR基因敏感突變持續(xù)存在，但轉(zhuǎn)化為SCLC的患者對EGFR-TKI出現(xiàn)耐藥，這可能是由于EGFR在蛋白水平的表達(dá)缺失[8]。未來也許可以根據(jù)檢測EGFR蛋白表達(dá)水平?jīng)Q定是否繼續(xù)使用EGFR-TKI[52]。Chang等[53]還提出SCLC轉(zhuǎn)化可能僅為耐藥的伴隨現(xiàn)象，而非主要原因的猜想。

7 小結(jié)

本文綜述了SCLC轉(zhuǎn)化作為NSCLC對EGFR-TKI的耐藥機制之一的研究進(jìn)展及耐藥后治療的策略，雖然仍然有許多需要進(jìn)一步研究和解決的問題，但已有的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究提供了有利的線索，耐藥機制的深入研究提供了新的治療路線，不僅有助于指導(dǎo)臨床用藥，而且將促進(jìn)更有針對性的靶向藥物的研發(fā)。對以上假說進(jìn)行驗證性研究，進(jìn)而明確其轉(zhuǎn)化的分子機制，收集大量病例資料進(jìn)行全面的前瞻性研究，包括生物學(xué)特性、對目前治療措施的應(yīng)答率、預(yù)后等，是研究者們未來需要解決的問題。