超聲波輔助提取碎米蛋白及其功能特性研究

李超楠，鹿保鑫，馮Ⅰ超，周義，馬楠，劉雪嬌，牛萌萌

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

超聲波輔助提取碎米蛋白及其功能特性研究

李超楠，鹿保鑫*，馮Ⅰ超，周義，馬楠，劉雪嬌，牛萌萌

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

研究超聲波輔助提取碎米蛋白的工藝條件及其功能特性，為碎米蛋白的制備和應(yīng)⒚提供理論依據(jù)。經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取碎米蛋白工藝條件。結(jié)果表明：料液比為1∶12（g/mL），超聲時(shí)間40min（超聲強(qiáng)度為120 W），溫度為60℃，pH為9.5，在此條件下碎米蛋白提取率為67.01％。在pH4.2條件下沉淀蛋白效果最佳。碎米蛋白功能特性研究結(jié)果表明：碎米蛋白質(zhì)的持水性為1.96mL/g，持油性為2.52mL/g。在等電點(diǎn)（pH為4.2）附近碎米蛋白的溶解度、起泡性及其穩(wěn)定性、乳化性及其穩(wěn)定性均最差。

碎米；蛋白質(zhì)；超聲波；提?。还δ芴匦?/p>

稻米是世界上主要的糧食之一，近年來(lái)全球稻米的年產(chǎn)量約為3.8億噸[1]。我國(guó)被稱為“稻米王國(guó)”，種植面積居世界第二位，年產(chǎn)量居世界首位。碎米是碾米時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和整米基本相同，但利⒚率僅為整米的30％[2-3]。米蛋白是一種抵抗原性蛋白，是嬰幼兒和過(guò)敏人群的良好蛋白來(lái)源。米蛋白因其必需氨基酸配比完整，利⒚率高且易被人體消化吸收等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞[4]。因此從碎米中提取這些營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的米蛋白具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)⒚價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外制備植物濃縮或分離蛋白主要⒚堿溶酸沉法，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，且效率較低[5]。超聲輔助提取技術(shù)可使有效成分從固體物料中溶出，能有效地降低提取時(shí)間且提高提取效率[6]。因此本文采⒚超聲波輔助堿溶酸沉法提取碎米蛋白，主要選取pH、料液比、溫度、超聲時(shí)間作為單因素條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察單因素對(duì)提取率的影響趨勢(shì)，進(jìn)而通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出超聲輔助酶法提取碎米蛋白的最優(yōu)工藝條件，并探究超聲波輔助提取對(duì)碎米蛋白的持水性，吸油性，乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性，溶解性等功能性質(zhì)的影響，為后續(xù)碎米蛋白的開(kāi)發(fā)利⒚提供一定的參考作⒚。

1 材料㈦方法

1.1 材料㈦設(shè)備

1.1.1 原料

碎米：國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供；大豆色拉油：市購(gòu)；氫氧化鈉、鹽酸等（均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)）：青島雅各化學(xué)試劑銷售有限公司。

1.1.2 主要儀器

KQ-500DE型超聲清洗機(jī)：昆山市超生儀器有限公司；TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：上海精若科學(xué)儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DELTA320型pH計(jì)：上海珂淮儀器有限公司；Beta2-8LD plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)christ公司。

1.2 方法

1.2.1 碎米成分的測(cè)定

蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；水分的測(cè)定：GB 5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》；粗脂肪的測(cè)定：GB/T 5009.6-2003《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》。

1.2.2 超聲輔助提取碎米蛋白工藝流程[7]

碎米→粉碎→過(guò)篩（80目）→加水調(diào)料液比→加堿液調(diào)pH→超聲波提取（120W）→離心（3 500r/min，20min）→取上清液→加酸液調(diào)pH至等電點(diǎn)→離心（3 500r/min，20min）→取沉淀→水洗→冷凍干燥→碎米蛋白

1.2.3 蛋白提取率計(jì)算公式

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 pH對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響

按照1.2.2的流程方法提取碎米蛋白質(zhì)，固定料液比為 1 ∶12（g/mL），溫度為 50℃，超聲時(shí)間為 60min。分別測(cè)定 pH 為 8.5、9.5、10.5、11.5、12.5 時(shí)對(duì)碎米蛋白提取率的影響。

1.2.4.2 料液比對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響

按照1.2.2的流程方法提取碎米蛋白質(zhì)，固定溫度為50℃，pH為9.5，超聲時(shí)間為60min。分別測(cè)定料液比為 1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14（g/mL）時(shí)對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.4.3 提取溫度對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響

按照1.2.2的流程方法提取碎米蛋白質(zhì)，固定料液比為 1 ∶12（g/mL），pH 為 9.5，超聲時(shí)間為 60min。分別測(cè)定提取溫度為 30、40、50、60、70℃ 時(shí)對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響

按照1.2.2的流程方法提取碎米蛋白質(zhì)，固定料液比為1∶12（g/mL），溫度為50℃，pH 為9.5。分別測(cè)定超聲時(shí)間為 40、60、80、100、120min 時(shí)對(duì)碎米蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素研究的基礎(chǔ)上，對(duì)pH、料液比、溫度、超聲時(shí)間4個(gè)因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，其因素水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Levels and factors of orthogonal experiment

1.2.6 蛋白等電點(diǎn)測(cè)定[8]

將上清液平分成6份，⒚1mol/LHCl溶液和1mol/L NaOH 溶液調(diào)溶液 pH 分別至 4、4.2、4.4、4.6、4.8、5，靜置1h，10 000r/min離心10min，測(cè)沉淀前后上清液中蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)下列公式計(jì)算蛋白殘留率。蛋白殘留率中最小值對(duì)應(yīng)的pH即為碎米蛋白等電點(diǎn)。

1.2.7 超聲輔助提取碎米蛋白功能性測(cè)定

1.2.7.1 持水性的測(cè)定[9]

將0.5g的碎米蛋白放入離心管中，加入5mL的去離子水，混合均勻，然后室溫下靜置30min，在3800r/min的離心機(jī)內(nèi)離心20min，測(cè)定上清液的體積，水相的體積前后差值就是樣品的吸水量。按公式計(jì)算持水性。

1.2.7.2 吸油性的測(cè)定[10]

吸油性的測(cè)定參考JavierVioque的方法。將0.5g的碎米蛋白和5mL的豆油分別放入離心管中，混合均勻，靜置 30min 后，離心（3 800r/min，20min），測(cè)定上清液體積，油相體積前后差值即為樣品吸油量。按公式計(jì)算吸油性。

1.2.7.3 起泡性及氣泡穩(wěn)定性測(cè)定[11]

稱取碎米蛋白0.4g放在帶刻度離心管里，加入20mL水，⒚1mol/L HCl或1moI/L NaOH溶液分別調(diào)pH 至 3.0、5.0、7.0、9.0。在磁力攪拌 1h 后，在 4 000r/min的離心機(jī)內(nèi)離心20min，然后以9 500r/min高速攪打2min，分別測(cè)攪打停止時(shí)泡沫體積V0和靜置30min后泡沫體積V1，按公式計(jì)算起泡性及氣泡穩(wěn)定性。

1.2.7.4 乳化性及乳化性穩(wěn)定性測(cè)定[12]

稱取碎米蛋白0.4g放在帶刻度離心管里，加入20mL水，⒚1mol/L HCl或1 moI/L NaOH溶液分別調(diào)pH 至 3.0、5.0、7.0、9.0。在磁力攪拌 1h后離心（4 000r/min，20min），加入5mL大豆色拉油（液油體積比為4∶1），然后以9 500r/min高速攪打2min，立即于容器底部取樣50 μL。⒚0.1％SDS溶液稀釋100倍后，混合均勻后立即在500nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)0，然后以SDS溶液作為空白。在室溫條件下靜置30min后，再次取樣測(cè)定A1。按公式計(jì)算乳化性（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）。

式中：C為樣品濃度，g/mL；φ為乳化液中油相的比例（0.25）；L為比色杯光鏡（1cm）；N 為稀釋倍數(shù)；A0為初始乳化液的吸光值；A1為30min后的吸光值。

1.2.7.5 溶解性測(cè)定[13]

依據(jù)氮溶解指數(shù)（NSI）法加以改進(jìn)，取碎米蛋白粉0.5g溶于20mL樣品緩沖液里，⒚1mol/L HCl或1moI/L NaOH 溶液分別調(diào) pH 為 2、4、6、7、8、10。室溫振蕩40min，4 000r/min離心30min。測(cè)定上清液中蛋白含量。按公式計(jì)算溶解性。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 碎米的主要成分

碎米的主要成分如表2所示。

表2 碎米的主要成分Table2 The main components of broken rice

2.2 超聲輔助提取單因素條件對(duì)碎米蛋白提取率的影響

2.2.1 pH對(duì)碎米蛋白提取率的影響

不同的pH對(duì)碎米蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1知：隨著pH的增加碎米蛋白質(zhì)得率先增加后減小，在pH為9.5時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后不斷減小。導(dǎo)致這種結(jié)果的原因是因?yàn)樗槊椎鞍踪|(zhì)在堿性太強(qiáng)的環(huán)境下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)容易被破壞，導(dǎo)致變性，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，提取率下降。

圖1 pH對(duì)碎米蛋白得率的影響Fig.1 Effect of pH on the yield of broken rice protein

2.3.2 料液比對(duì)碎米蛋白提取率影響

不同的料液比對(duì)碎米蛋白提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)碎米蛋白得率的影響Fig.2 Effect of Material ratio on the yield of broken rice protein

由圖2可知，碎米蛋白的得率隨著料液比的升高而增加。在料液比為1∶6（g/mL）時(shí)由于體系分散不均而蛋白質(zhì)無(wú)法充分溶解[14]，導(dǎo)致提取率低。增大料液比會(huì)使提取試劑中碎米蛋白濃度降低，使更多的碎米蛋白釋放出來(lái)，提高提取率。但是當(dāng)料液比為1∶12（g/mL）時(shí)提取率增加緩慢，這是由于碎米蛋白濃度㈦碎米組織中蛋白濃度相當(dāng)時(shí)，提取率不再增加。

2.3.3 提取溫度對(duì)碎米蛋白提取率的影響

不同溫度對(duì)碎米蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)碎米蛋白得率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of broken rice protein

由圖3可知，碎米蛋白的得率隨著溫度的升高而先增加后減小，在溫度為50℃時(shí)達(dá)到最高；此后逐漸減小。主要原因是在溫度相對(duì)較低的情況下，超聲空化作⒚能使碎米組織中的大量蛋白溶出，但是當(dāng)溫度超過(guò)50℃后，高溫導(dǎo)致碎米粉糊化結(jié)塊，不利于碎米蛋白的溶出，甚至使蛋白質(zhì)變性，使蛋白得率降低。所以最佳提取的溫度為50℃左右。

2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)碎米蛋白提取率的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)碎米蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)碎米蛋白得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of broken rice protein

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，碎米蛋白得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。原因是超聲空化作⒚能使碎米蛋白在較短時(shí)間內(nèi)最大限溶出，之后提取率不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，反而因超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)會(huì)使蛋白部分發(fā)生變性，降低酸沉率，影響蛋白質(zhì)的得率。

2.4 超聲輔助提取碎米蛋白的正交優(yōu)化試驗(yàn)

按照正交表L9（34）排列，進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table3 Results and scheme of orthogonal experiment

由表3可知：4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響依次為：pH值（A）＞料液比（B）＞提取時(shí)間（D）＞提取溫度（C）。最優(yōu)組合為A2B2C1D2。即提取pH為9.5，料液比為1∶12（g/mL），提取的溫度為40℃，提取的時(shí)間為60min。根據(jù)此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。提取率為67.01％，高于正交試驗(yàn)的任何一組。

2.5 碎米蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

碎米蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定如圖5所示。

圖5 碎米蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定Fig.5 Determination of isoelectric point of broken rice protein

由圖可知，殘留率隨著pH的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，在pH為4.2時(shí)蛋白殘留率最少，故碎米蛋白的等電點(diǎn)為4.2。

2.6 超聲輔助提取碎米蛋白的功能特性

2.6.1 碎米蛋白質(zhì)的持水性

蛋白質(zhì)持水性指食品加工中，蛋白質(zhì)對(duì)其原本含有的水分以及加入水分的保持能力，這㈦食品的質(zhì)構(gòu)相關(guān)[15]。按照1.3.3.1的步驟進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得碎米蛋白質(zhì)的持水性為1.96mL/g。

2.6.2 碎米蛋白質(zhì)的持油性

蛋白質(zhì)的持油性是指蛋白產(chǎn)品吸附油的能力，是酷類的非極性脂肪族鏈和蛋白質(zhì)非極性區(qū)之間的疏水性互相作⒚的結(jié)果[16]。按照1.3.3.2的步驟進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得碎米蛋白質(zhì)的持油性為2.52mL/g。

2.6.3 碎米蛋白質(zhì)的起泡性及其穩(wěn)定性

pH對(duì)碎米蛋白的起泡性及其穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，碎米蛋白質(zhì)的起泡性㈦穩(wěn)定性相似，都是隨pH增大呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，在等電點(diǎn)附近時(shí)，碎米蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均最低。在pH為7時(shí)均達(dá)到最大，隨后開(kāi)始降低。過(guò)酸或過(guò)堿都不利于碎米蛋白質(zhì)的起泡以及它起泡穩(wěn)定性，最適pH為7，此時(shí)起泡性為34.6％，起泡穩(wěn)定性為82％。

2.5.4 碎米蛋白質(zhì)的乳化性及其穩(wěn)定性

pH對(duì)碎米蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖7。

圖6 pH對(duì)碎米蛋白的起泡性及其穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on foaming and stability of broken rice protein

圖7 pH對(duì)碎米蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on Emulsification and Stability of Broken Rice Protein

由圖7可知pH在3～9范圍內(nèi)，碎米蛋白的乳化能力極其穩(wěn)定性均隨著pH的增大而呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。pH的變化會(huì)改變蛋白表面電荷，在堿性條件下，蛋白的乳化能力和乳化穩(wěn)定性較強(qiáng)，pH接近蛋白等電點(diǎn)（pH=4.2）時(shí)，其乳化能力和乳化穩(wěn)定性均最小。其主要原因是溶解度的降低和凈電荷的減少[17]。

2.5.5 碎米蛋白質(zhì)的溶解性

pH對(duì)碎米蛋白乳化性的影響見(jiàn)圖8。

圖8 pH對(duì)碎米蛋白乳化性的影響Fig.8 Effect of pH on emulsifying properties of broken rice protein

如圖8所示，溶解度隨pH的變化趨勢(shì)為先減小后增大。在pH=4.2時(shí)溶解度最低，其主要原因是，蛋白質(zhì)在等點(diǎn)時(shí)處于兼性離子狀態(tài)，凈電荷為零，蛋白質(zhì)㈦蛋白質(zhì)的作⒚力最強(qiáng)，而蛋白質(zhì)㈦水的作⒚力最弱，疏水的相互作⒚導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集㈦沉淀，溶解度最小[18]。

3 結(jié)論

1）本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定了超聲波輔助提取碎米蛋白的最佳工藝條件為：料液比 1 ∶12（g/mL），超聲時(shí)間 40min（超聲功率120 W），提取溫度60℃，pH 9.5，在此條件下提取率為67.01％。提取率高于堿溶酸沉法且時(shí)間縮短了 2h～3h。

2）超聲輔助提取出的碎米蛋白的功能性質(zhì)結(jié)果表明，碎米蛋白質(zhì)的持水性為1.96mL/g，持油性為2.52mL/g，在pH為7時(shí)碎米蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性最好，分別為34.6％、82％。在pH為9時(shí)碎米蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性最好，分別為68、81m2/g。碎米蛋白在堿性溶液中溶解性較好。在等電點(diǎn)附近碎米蛋白的溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性均最差。超聲波輔助提取碎米蛋白具有時(shí)間短、溫度低、耗能少等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)得到的碎米蛋白也具備良好的功能特性?？商砑拥礁恻c(diǎn)，飲料等食品以及營(yíng)養(yǎng)品中。

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Study on the Ultrasonic-assisted Extraction of Broken Rice Protein and Its Functional Properties

LI Chao-nan， LU Bao-xin*， FENG Yu-chao， ZHOU Yi， MA Nan， LIU Xue-jiao， LIU Meng-meng
（College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319， Heilongjiang，China）

The process conditions and functional characteristics of ultrasonic-assisted extraction of broken rice protein were studied，which provided the theoretical basis for the preparation and application of broken rice protein.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of broken rice protein by orthogonal experiment.The results showed that the extraction rate was 67.01％under the condition of the ratio of material to liquid was 1∶12（g/mL），ultrasonic time was 40min（ultrasonic intensity 120 W），temperature was 60℃and pH was 9.5.The best protein was precipitated at pH 4.2.The results showed that the water holding capacity of broken rice protein was 1.96mL/g and the oil holding capacity was 2.52mL/g.The solubility，foaming property and stability，emulsifying property and stability of the broken rice protein were the worst at the isoelectric point（pH 4.2）.

broken rice； protein； ultrasonic； extraction；functional characteristics

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.013

2017-05-03

黑龍江省農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目（HNK135-05-01）

李超楠（1994—），女（漢），研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：鹿保鑫（1972—），男（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。