酶法提取林蛙卵黑色素的工藝及抗氧化活性研究

蘇Ⅰ春，陳光，肖紅慶，郭會(huì)楠

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

酶法提取林蛙卵黑色素的工藝及抗氧化活性研究

蘇Ⅰ春，陳光，肖紅慶，郭會(huì)楠

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

研究木瓜蛋白酶酶解法提取林蛙卵黑色素工藝，分析林蛙卵黑色素的抗氧化活性。以林蛙卵為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分析木瓜蛋白酶的⒚量、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)黑色素提取率的影響，確定林蛙卵黑色素酶水解法的最佳提取工藝；應(yīng)⒚DPPH法測(cè)定林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·的清除能力。得出木瓜蛋白酶解法提取林蛙卵黑色素的最佳條件為：酶⒚量為30mg，反應(yīng)溫度58℃，料液比1∶20（g/mL），反應(yīng)時(shí)間4h，林蛙卵中黑色素的提取率為13.23％。黑色素對(duì)DPPH·具有顯著的清除作⒚，0.4mg/mL的林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·的清除率達(dá)52％。

林蛙卵；黑色素；酶解；抗氧化

黑色素是一種由吲哚、酚類化合物組成的類酚聚合物，多數(shù)呈現(xiàn)黑色，棕色，褐色。黑色素常見于各種生物體內(nèi)[1-3]。它是一種較穩(wěn)定的復(fù)雜大分子。黑色素作為一種抗氧化劑和新式藥物載體，能夠醫(yī)治由于缺乏黑色素所引發(fā)的疾病。黑色素也能降低血管脆性，減少出血時(shí)間[4]。徐磊[5]等報(bào)道黑色素不單能顯著抑制體外培養(yǎng)的艾滋病病毒，還能減慢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。黑色素具有抗氧化、抗輻射、抗病毒、提高免疫力等許多重要的生理功能，近年被廣泛應(yīng)⒚[6]。

中國(guó)林蛙（Rana temporaria chensinensis David）原產(chǎn)地為吉林省的敦化市、通化市、靖㈩縣等地[7]。林蛙卵為生產(chǎn)林蛙油時(shí)的副產(chǎn)品，可以⒚于生產(chǎn)水貂及珍稀禽類的飼料，也能夠制備成林蛙幼崽的飼料，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的飼料來(lái)源。陳大⒙[8]等報(bào)道林蛙卵多糖具有抗氧化活性，張肅[9]、金莉莉[10]等研究林蛙卵蛋白質(zhì)具有抗疲勞、抗衰老活性。李鐵純[11]等對(duì)林蛙卵脂肪酸進(jìn)行了研究?，F(xiàn)階段，黑色素的提取方法主要有鹽酸水解法和酶解法。張蓮姬[12-13]等研究了泥鰍魚皮黑色素的酸法提取工藝。宋茹[14]等報(bào)道了酶解法提取魷魚墨黑色素工藝。本研究以中國(guó)林蛙卵為原料，酶解提取黑色素，對(duì)黑色素的抗氧化性作了初步研究，為林蛙卵黑色素的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料㈦方法

1.1 材料

林蛙卵：東北林蛙購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市三禾參業(yè)生物工程有限公司，將林蛙處死后冷凍干燥，取林蛙油后得到的林蛙卵經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩備⒚。

HH-S型恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市恒豐儀器廠；GL-21LM冷凍離心機(jī)：湖南星科儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通⒚儀器有限公司。

木瓜蛋白酶（1 000 U/mg）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）：Sigma公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、石油醚等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑色素的提取

參照朱方[15]等方法，略作改動(dòng)。林蛙卵預(yù)處理，將粉碎的林蛙卵1g放入錐形瓶中，加入pH值為6的磷酸鹽緩沖液20mL，加入木瓜蛋白酶，水浴保溫3h酶解；100℃滅酶，進(jìn)行離心 5 000r/min，15min；沉淀分別⒚石油醚和蒸餾水洗滌，⒚5％的NaOH溶液溶解，離心5 000r/min，15min，上清液冷凍干燥即得黑色素粗品。

1.2.2 提取林蛙卵黑色素的單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 酶⒚量對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

在溫度為 60℃，時(shí)間為 4h，料液比為 1∶20（g/mL）的條件下，分別加入 10、20、30、40、50、60mg的木瓜蛋白酶，按照試驗(yàn)步驟依次進(jìn)行試驗(yàn)。計(jì)算每組林蛙卵黑色素的提取率（提取率/％=黑色素質(zhì)量/林蛙卵質(zhì)量×100），從而得到最佳酶⒚量。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

每種酶都有最適作⒚溫度，木瓜蛋白酶的最適作⒚溫度為55℃～60℃[19]，在酶⒚量為30mg，反應(yīng)時(shí)間為 4h，料液比為 1 ∶20（g/mL），溫度分別設(shè)為 54、56、58、60、62、64℃，按照試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)得到的林蛙卵黑色素提取率，確定本試驗(yàn)最佳反應(yīng)溫度。

1.2.2.3 料液比對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

試驗(yàn)溫度60℃，時(shí)間為4h，酶⒚量30mg時(shí)，料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），按照試驗(yàn)步驟依次進(jìn)行試驗(yàn)。分別稱量得到的黑色素質(zhì)量，確定酶法提取林蛙卵中黑色素的最佳料液比。

1.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

反應(yīng)溫度60℃，酶⒚量為30mg，料液比為1∶20（g/mL），反應(yīng)時(shí)間為 1、2、3、4、5、6h，共進(jìn)行 6 次。按照試驗(yàn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)黑色素提取率，確定最適合的反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 木瓜蛋白酶提取林蛙卵黑色素的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，并以黑色素提取率為指標(biāo)，確定最佳工藝條件。試驗(yàn)方案見表1。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 林蛙卵黑色素清除DPPH·的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[16-18]的方法，稱取黑色素，配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL， 取 1mL 不同質(zhì)量濃度黑色素溶液加入4mL DPPH·溶液中，總體積為5mL，搖勻，室溫放置30min，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度（A樣品），同時(shí)在4mL DPPH·溶液中加入1mL 5％NaOH溶液，記錄吸光度值（A空白），即空白對(duì)照DPPH·的清除率。清除率/％＝（A空白－A樣品）/A空白×100

2 結(jié)果㈦討論

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

2.1.1 酶⒚量對(duì)林蛙卵黑色素提取率的影響

在溫度為60℃，時(shí)間為4h，料液比為1∶20（g/mL）的條件下，分別加入 10、20、30、40、50、60mg 的木瓜蛋白酶進(jìn)行水解優(yōu)化，確定最佳酶量，見圖1。

圖1 酶⒚量對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme content on the extraction rate of melanin

由圖1可知，隨著酶⒚量的增大，黑色素的提取率逐漸升高，當(dāng)酶⒚量為40mg時(shí)，得到最大提取率12.5％，繼續(xù)加大酶量，黑色素的提取率基本保持不變，這是由于此時(shí)底物㈦酶完全飽和。從而確定酶的最佳⒚量為40mg。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)黑色素提取率的影響

在酶⒚量為30mg，反應(yīng)時(shí)間為4h，料液比為1 ∶20g/mL，水解溫度分別設(shè)為 54、56、58、60、62、64℃確定最佳溫度，見圖2。

圖2 溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction rate of melanin

由圖2可知，林蛙卵中黑色素的提取率㈦酶解溫度成正相關(guān)，當(dāng)溫度為58℃時(shí)，黑色素提取率12.21％，繼續(xù)升溫，黑色素的產(chǎn)量減少。這是由于溫度過(guò)高，使木瓜蛋白酶的活性下降，不能使黑色素完全從蛋白質(zhì)中水解，進(jìn)而影響黑色素的提取率。因此本試驗(yàn)的最佳酶解溫度為58℃。

2.1.3 料液比對(duì)黑色素提取率的影響

在溫度60℃，時(shí)間為4h，酶⒚量30mg時(shí)，料液比分別設(shè)定為 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），確定最佳料液比，見圖3。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of melanin

由圖3可知，林蛙卵黑色素的提取率開始是㈦提取液的體積成正相關(guān)，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)黑色素的提取率最大，繼續(xù)增加提取液的比例，黑色素提取率減少。這是由于料液比過(guò)小時(shí)，會(huì)影響酶㈦底物的接觸，所以酶的能力會(huì)降低，黑色素產(chǎn)量下降；當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，會(huì)使接觸頻率受影響[15]。因此確定本試驗(yàn)的最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)黑色素提取率的影響

在反應(yīng)溫度60℃，酶⒚量為30mg，料液比為1 ∶20（g/mL），設(shè)定反應(yīng)時(shí)間分別為 1、2、3、4、5、6h 確定最佳水解時(shí)間，見圖4。

由圖4可知，黑色素產(chǎn)量剛開始㈦時(shí)間成正相關(guān)，當(dāng)時(shí)間大于4h，黑色素的提取率降低。這是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)影響木瓜蛋白酶的水解活性，使黑色素不能完全提取出來(lái)，不能得到最大量的黑色素，所以根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可確定本試驗(yàn)的最佳反應(yīng)時(shí)間為4h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of melanin

2.2 酶解法提取林蛙卵中黑色素的正交試驗(yàn)結(jié)果㈦分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的最佳處理?xiàng)l件，選擇加酶量、溫度、料液比，反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal experiment

從表2可以看出，4個(gè)因素對(duì)林蛙卵黑色素產(chǎn)量的影響所起作⒚為D>B>C>A，即時(shí)間產(chǎn)生的影響效果最強(qiáng)，其次為反應(yīng)溫度，然后是料液比，影響最弱的為酶⒚量。由極差分析可得：最適合的試驗(yàn)組合為A3B2C3D2，但由提取率結(jié)果得到最適合的試驗(yàn)組合為A1B2C2D2，因此對(duì)上述兩個(gè)組合進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 林蛙卵中黑色素提取條件的驗(yàn)證試驗(yàn)Table3 Validation experiments of optimal process to extract egg melanin ％

根據(jù)表3可得，方案A1B2C2D2比A3B2C3D2得到的提取率更高，所以提取林蛙卵中黑色素的最佳試驗(yàn)條件是，酶⒚量為30mg，反應(yīng)溫度 58℃，料液比 1∶20（g/mL），反應(yīng)時(shí)間4h，此時(shí)，林蛙卵黑色素的提取率為13.23％。

2.3 林蛙卵黑色素清除DPPH·的能力

把黑色素配成 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL濃度，研究其清除DPPH·，結(jié)果見圖5。

圖5 林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·的清除能力Fig.5 Effect of Rana eggs melanin concentration on scavenging ability of DPPH·

由圖5可知，林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·的清除能力隨其質(zhì)量濃度的升高而增大；黑色素對(duì)DPPH·的清除率達(dá)52％時(shí)，其濃度為0.4mg/mL，表明林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·有很好的清除作⒚。

3 結(jié)論

目前，提取黑色素主要采⒚鹽酸水解法和酶解法，相比于鹽酸水解法提取黑色素，酶提取試驗(yàn)條件更加溫和[19]，對(duì)黑色素的破壞相對(duì)較小，此方法簡(jiǎn)便易行。在抗氧化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，酶法提取的林蛙卵黑色素具有明顯的抗氧化活性。本試驗(yàn)采⒚木瓜蛋白酶提取林蛙卵黑色素，經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定本研究的最佳條件，即酶⒚量為30mg，反應(yīng)溫度58℃，料液比1∶20（g/mL），反應(yīng)時(shí)間 4h，林蛙卵黑色素的提取率為13.23％；0.4mg/mL的林蛙卵黑色素對(duì)DPPH·的清除率達(dá)52％。

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Enzymatic Extraction Process and Anti-oxidation Activity of Rana temporaria chensinensis Egg Melanin

SU Yu-chun，CHEN Guang，XIAO Hong-qing， GUO Hui-nan
（College of Life Science， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China）

This study focused on the process of melanin extraction from Rana temporaria chensinensis eggs by papain hydrolysis， and analyzed the antioxidant activity of extracted melanin.Using Rana temporaria chensinensis eggs as material， the effects of papain concentration，material to liquid ratio，hydrolysis temperature and hydrolysis duration were studied by single factor experiments and orthogonal test analysis，determined the optimum hydrolysis process.The scavenging activity on DPPH·of the extracted melanin was measured by DPPH method.The optimum hydrolysis parameters for extraction of melanin from Rana temporaria chensinensis frog eggs was as follows：enzyme dosage 30mg，hydrolysis temperature 58℃，material to liquid ratio 1∶20（g/mL），hydrolyze duration 4h.The yield of melanin was up to 13.23％by this process.The melanin has obvious clearance ability on DPPH·.The ability of melanin for DPPH·scavenging at 0.4mg/mL was 52％.

Rana temporaria chensinensis eggs； melanin； enzymatic hydrolysis； anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.012

2016-11-02

吉林省教育廳項(xiàng)目（吉教科合字[2016]第181號(hào)）

蘇Ⅰ春（1977—），女（漢），副教授，博士研究生，主要從事長(zhǎng)白山資源開發(fā)㈦利⒚研究。