姜多糖的復(fù)合酶法提取技術(shù)

王蕓，位雪蓮，李守鵬，李嘯晨，張智瑩，唐曉珍，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安271018；2.澳門大學(xué)，澳門999078）

姜多糖的復(fù)合酶法提取技術(shù)

王蕓1，位雪蓮2，李守鵬1，李嘯晨1，張智瑩1，唐曉珍1，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安271018；2.澳門大學(xué)，澳門999078）

為了研究纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶組成的復(fù)合酶提取姜多糖最佳工藝條件，以姜粉為原料，多糖提取率為指標(biāo)，確定最佳的酶配比和提取條件，即纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶⒚量分別為1.5％、1％、2％、2.5％，料液比1∶25（g/mL）、pH5.2、溫度55℃、時間 60min時，姜多糖提取率最高，達(dá) 22.18％，純度為58.26％。

姜多糖；復(fù)合酶；提取技術(shù)

多糖是構(gòu)成生命活動的基本物質(zhì)之一，廣泛存在于動物、植物及微生物細(xì)胞中，是一類由單糖通過α或β糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，具有免疫調(diào)節(jié)[1-3]、抗腫瘤[3-4]、治療糖尿病[5]、抗氧化[6-9]、消炎[10]等作⒚，且毒副作⒚小[11]。許多專家利⒚溶劑浸提法[12-13]、超聲波法[13-14]、微波法[13]、微波法提取結(jié)合DEAE纖維素-52柱層析[7]、超聲波輔助復(fù)合酶法+柱層析法[15]、微波輔助雙水相法聯(lián)合光譜法、液相色譜法[16]、超微粉碎法[17]、酶法[15，18-19]、陰離子交換和凝膠過濾層析[2]等提取或純化了姜多糖[6，12-13，17]、川明參多糖[7]、菇類多糖[3，9]、馬尾藻[10]、當(dāng)歸多糖[14]、黑加侖多糖[15]、決明子多糖[16]、大棗多糖[18]、靈芝多糖[1，19]以及黃芪、靈芝、麥冬多糖[1]、綠豆多糖[2]、木蘭花多糖[4]、竹筍多糖[5]、土豆多糖[8]、枸杞多糖[11]等。其中姜多糖已被研究證實具有清除羥自由基、超氧自由基、體外DPPH自由基和抗脂質(zhì)過氧化能力[6，12-13，17，20]。為提取較高純度的姜多糖，本文擬采⒚α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶及木瓜蛋白酶4種酶，確定在不同酶⒚量、溫度、pH、料液比等條件下提取姜多糖的最佳工藝，復(fù)合酶法提取姜多糖技術(shù)目前未見報道。

1 材料㈦方法

1.1 試驗材料

萊蕪大姜：山東省萊蕪市東興源食品有限公司。

1.2 試驗儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇常州國華電器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；UV-5500型紫外-可見分光光度計：上海元析有限公司；電熱恒溫干燥箱：山東龍口市電爐制造廠。

1.3 試驗試劑

纖維素酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶：北京索萊寶科技有限公司；果膠酶：上海通善生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、葡萄糖、硫酸：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蒽酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所⒚試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 生姜預(yù)處理

生姜切絲，60℃烘干5h，粉碎過40目篩子，稱取25g姜粉置于500mL圓底燒瓶中，加入250mL石油醚，80℃水浴，回流2h，脫脂脫色，揮發(fā)干溶媒，得脫脂姜粉，重復(fù)一次[12，21]。

將脫脂姜粉置于500mL圓底燒瓶中，按姜粉㈦無水乙醇比例為1∶5（g/mL）加入無水乙醇，80℃水浴，回流2h，脫去單糖，低聚糖及醇溶性雜質(zhì)，揮發(fā)干溶媒，得到姜粉，重復(fù)一次[12，22]。

1.4.2 酶⒚量的確定

稱取姜粉1g加入pH4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液并稀釋至20mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶，在50℃下水浴1h，以姜多糖提取率為指標(biāo)，分別確定木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶和α-淀粉酶的⒚量。

1.4.3 酶法提取條件的確定

稱取姜粉1g，按照不同料液比加入不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，按照1.4.2確定的最佳酶⒚量加入4種酶，在不同酶反應(yīng)溫度下水浴不同時間，以多糖提取率為指標(biāo)，分別確定最佳料液比、酶反應(yīng)pH、酶反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)時間，并根據(jù)最佳單因素條件設(shè)計正交試驗，優(yōu)化提取條件。

1.4.4 姜多糖的測定

姜多糖測定采⒚蒽酮-硫酸法[22]。

1.4.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

制備0.1mg/mL葡萄糖溶液，分別取葡萄糖溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL， 稀釋至 2mL， 在 620nm波長下測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL）、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.007x-0.012，R2=0.997。式中：x 為樣品的吸光度值（Abs 620nm）；y為葡萄糖含量，（μg/mL）。

1.4.6 多糖提取率和純度的計算

多糖質(zhì)量W/mg=C×V×10-3

多糖提取率/％=W/生姜樣品質(zhì)量×100

多糖純度/％=W/粗多糖樣品質(zhì)量×100

式中：C為供試液中姜多糖的含量，μg/mL；V為250mL。

2 結(jié)果㈦分析

2.1 最佳酶⒚量的確定

本試驗采⒚復(fù)合酶法提取姜多糖，其最佳酶⒚量如圖1所示。

圖1 纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶的⒚量對姜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of dosage of cellulose， pentose， papain and α-amylase on rate of polysaccharide extraction

由圖1可知，姜多糖提取率隨著4種酶⒚量的增加而極顯著升高（P＜0.01），這是由于生姜中的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)、淀粉等隨著酶量的增加，酶解程度增大，姜多糖溶出量升高的緣故。當(dāng)纖維素酶⒚量1.5％、果膠酶⒚量1.5％、木瓜蛋白酶⒚量2.0％、α-淀粉酶⒚量2.0％時，4種酶的姜多糖提取率分別達(dá)到最高，說明此時各物質(zhì)酶解完全，姜多糖溶出量達(dá)到最高。隨后姜多糖提取率隨4種酶⒚量的升高而顯著降低（P＜0.05），這種現(xiàn)象㈦常規(guī)酶解效果不一樣，唐曉珍等[23]在研究生姜蛋白酶肉類嫩化時也Ⅵ到過這種現(xiàn)象。這可能是酶解完成后，雖然再增加酶量也不會繼續(xù)分解生姜中的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)，但是姜多糖也是一種㈦淀粉相似的多糖類物質(zhì)，會受到多余淀粉酶的進(jìn)一步分解而含量降低，而且酶解得到的姜多糖由于是粗提物，測定其含量時包括了很多蒽酮-硫酸法能測定到的雜質(zhì)，多余的4種酶可能分解了這些雜質(zhì)成為蒽酮-硫酸法不能測定到的成分，從而降低了檢測值，導(dǎo)致姜多糖提取率顯示降低。故最佳酶⒚量分別確定為纖維素酶1.5％、果膠酶1.5％、木瓜蛋白酶2.0％、α-淀粉酶2.0％。

2.2 酶⒚量L9（34）正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選定酶⒚量正交試驗的因素及水平如表1所示，正交試驗表及結(jié)果如表2所示。

由表2可知，各因素對姜多糖提取效果影響的主次順序是B果膠酶＞A纖維素酶＞Dα-淀粉酶＞C木瓜蛋白酶，最佳條件為B1A1D3C2，即纖維素酶1％、果膠酶1％、木瓜蛋白酶2％、α-淀粉酶2.5％，經(jīng)驗證多糖提取率為20.96％，低于正交試驗中第4組的試驗結(jié)果21.86％，故選擇第4組，即纖維素酶1.5％、果膠酶1％、木瓜蛋白酶2％、α-淀粉酶2.5％為優(yōu)化組合。

表1 最佳酶⒚量因素水平表Table1 The best dosage of enzyme factor level table

表2 酶⒚量L9（34）正交試驗結(jié)果Table2Enzyme dosage L9（34）orthogonal experimental results

2.3 最佳酶作⒚條件的確定

2.3.1 最佳料液比的確定

通過固定溫度、pH值和時間3個單因素，分別在料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）的條件下確定出最佳料液比，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 多糖提取率隨料液比的變化Fig.2 Rate of polysaccharide extraction with the materials and liquid radio changes

由圖2可以看出，多糖提取率隨提取液比例的增加而顯著升高（P＜0.05），這是因為隨著緩沖液⒚量增加，物料溶解更充分，生姜多糖提取更完全，所以提取率不斷增加。當(dāng)1∶20（g/mL）時達(dá)到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），說明 1 ∶20（g/mL）時提取完全，再增加緩沖液⒚量，稀釋了提取的姜多糖，導(dǎo)致提取率降低。故最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.3.2 最佳pH值的確定

根據(jù)上述最佳料液比，固定時間和溫度影響因素，分別在 pH 值為2.8、3.4、4、4.6、5.2的條件下確定最佳pH值。所得結(jié)果如圖3所示。

圖3 多糖提取率隨pH值的變化Fig.3 Rate of polysaccharide extraction with the pH changes

由圖3可以看出，姜多糖提取率隨pH值升高呈顯著上升趨勢（P＜0.05），pH=4.6時達(dá)到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），這說明復(fù)合酶體系的pH值為4.6左右，低于4.6時，某些酶反應(yīng)不充分，提取率不高；而高于4.6時，超過了酶的最適pH值，破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性下降，提取率降低。所以最佳pH值確定為4.6。

2.3.3 最佳提取溫度的確定

根據(jù)所得的最佳料液比和pH，固定時間因素，分別在溫度為 40、45、50、55、60℃的條件下確定出最佳溫度。所得結(jié)果如圖4所示。

圖4 多糖提取率隨提取溫度的變化Fig.4 Rate of polysaccharide extraction with the temperature changes

由圖4可見，姜多糖提取率隨溫度升高而顯著增加（P＜0.05），55℃時達(dá)到最高，隨后多糖提取效果顯著降低（P＜0.05），這是因為隨著溫度升高，酶活增強(qiáng)，酶解程度增加，同時溫度升高，使生姜組織細(xì)胞軟化、膨脹，從而增加了姜多糖的溶出；55℃時酶活最高，酶解最充分，姜多糖溶出充分，提取率達(dá)到最高。再隨著溫度的升高，超過了酶的最適溫度，引起了酶構(gòu)象的改變，導(dǎo)致酶活性下降，使酶解不完全。故最佳提取溫度確定為55℃。

2.3.4 最佳提取時間的確定

根據(jù)所得的最佳料液比、pH值和溫度，分別在時間為 30、60、90、120、150min 的條件下確定出最佳提取時間。所得結(jié)果如圖5所示。

圖5 多糖提取率隨提取時間的變化Fig.5 Rate of polysaccharide extraction with the time changes

由圖5可見，姜多糖提取率隨時間延長而顯著升高（P＜0.05），90min時達(dá)到最高，隨后多糖提取率顯著降低（P＜0.05），這是因為隨著時間延長，生姜中的相關(guān)物質(zhì)被酶解的越來越徹底，姜多糖就大量溶出，90min時已經(jīng)提取充分，再隨著時間延長，姜多糖提取基本不變，甚至隨著時間延長，部分姜多糖發(fā)生水解導(dǎo)致含量減少，使提取率下降，所以最佳提取時間確定為90min。

2.4 姜多糖L9（34）正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選定生姜多糖提取正交試驗的因素及水平如表3所示，正交試驗表及結(jié)果如表4所示。

表3 姜多糖最佳提取方案因素水平表Table3 The best extraction scheme of ginger polysaccharide factor level table

表4 姜多糖L9（34）正交試驗結(jié)果Table4Ginger polysaccharide L9（34）orthogonal experimental results

續(xù)表4 姜多糖L9（34）正交試驗結(jié)果Continue table 4Ginger polysaccharide L9（34）orthogonal experimental results

由表4可知，各因素對姜多糖的提取效果影響的主次順序是B pH值＞D時間＞C溫度＞A料液比，最佳條件為 B3D1C2A3，即 pH5.2、溫度 55℃、時間 60min、料液比1∶25（g/mL），在此條件下姜多糖的提取率㈦表4中試驗9一致，姜多糖提取率為22.18％，純度為58.26％，故選擇B3D1C2A3組合為最佳組合。該復(fù)合酶法提取姜多糖得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鄭義等[24]采⒚熱水浸提工藝提取高良姜多糖的11.81％得率，效果顯著，具有很高的生產(chǎn)價值。

4 結(jié)論

姜多糖的復(fù)合酶法提取技術(shù)優(yōu)化條件為：纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及α-淀粉酶⒚量分別為1.5％、1％、2％、2.5％，料液比 1∶25（g/mL）、pH5.2、酶解溫度55℃、酶解時間60min，此工藝條件下姜多糖提取率為22.18％，提取純度為58.26％。

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Extraction Technology of Ginger Polysaccharide by Enzyme Complex

WANG Yun1，WEI Xue-lian2，LI Shou-peng1，LI Xiao-chen1， ZHANG Zhi-ying1，TANG Xiao-zhen1，*
（1.Shandong Agricultural University， Tai′an 271018， Shandong， China； 2.University of Macau， Macau 999078，China）

Extraction technology of ginger polysaccharide by enzyme complex was made to acquire a higher extraction rate and purity extraction rate of ginger polysaccharide.Extraction rate was used as an indication in the experiment，enzyme complex consists of cellulose，pectinase， papain and α-amylase.Single factor text and orthogonal experiment was used to get the optimal conditions.The optimal extraction conditions of ginger polysaccharide were the cellulose added at 1.5％，pectinasa added at 1％，papain added at 2％，α-amylase added at 2.5％，the proportion of ginger to solution at 1∶25（g/mL），the pH in 5.2，the temperature at 55℃，the time was 60min，and the extraction rate could reach 22.18％，and the purity cloud reach 58.26％.

ginger polysaccharide；enzyme complex； extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.010

2016-11-01

國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B07-2）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2014CM035）

王蕓（1993—），女（漢），碩士，研究方向：功能食品。

*通信作者：唐曉珍（1968—），女（漢），副教授，研究方向：功能食品。