高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定碘硝酚原料及其注射液中碘硝酚的含量

孫婷婷，田 凱，王洪禮，楊 杰，田春蓮，劉明春，牛生吏*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110027)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法測(cè)定碘硝酚原料及其注射液中碘硝酚的含量

孫婷婷1，田 凱2，王洪禮2，楊 杰1，田春蓮1，劉明春1，牛生吏1*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110027)

建立了碘硝酚的高效液相色譜(HPLC)-內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)方法。用甲醇將樣品配制成測(cè)試濃度后過(guò)濾，經(jīng)依利特SinoChrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm )色譜分析柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)-甲醇(30∶70)，流速為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，柱溫為30 ℃，內(nèi)標(biāo)物為硝氯酚，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果表明，碘硝酚的質(zhì)量濃度在20～120 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 6；在3個(gè)不同濃度(64、80、96 mg/L)加標(biāo)水平下，平均回收率為90.4%～98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.18%～0.72%；檢出限(LOD，S/N=3)為0.15 mg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)為1.5 mg/L。該方法的精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性良好，且操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于碘硝酚原料藥及注射液的含量測(cè)定。

碘硝酚；硝氯酚；含量測(cè)定；高效液相色譜法；內(nèi)標(biāo)法

碘硝酚(Disophenol)又名雙碘硝酚，化學(xué)名為2,6-二碘-4-硝基苯酚，為淡黃色粉末或淡黃色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭無(wú)味，其熔點(diǎn)為155～159 ℃。碘硝酚首次合成于20世紀(jì)初，60年代逐漸發(fā)現(xiàn)其可用于驅(qū)殺動(dòng)物體內(nèi)外的寄生蟲(chóng)，70年代初改進(jìn)了合成工藝，并獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可用作獸藥[1-3]。我國(guó)在20世紀(jì)末開(kāi)始研究此類藥物[4-7]，1995年由農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)沈陽(yáng)市獸藥廠生產(chǎn)，1996年成功仿制碘硝酚，并獲國(guó)家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為二類新獸藥，收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部[8]。碘硝酚能驅(qū)殺肝片吸蟲(chóng)、動(dòng)物線蟲(chóng)、羊鼻蠅、牛皮蠅、蜱螨等寄生蟲(chóng)，具有廣譜、長(zhǎng)效、高效等優(yōu)點(diǎn)，目前在國(guó)內(nèi)已被廣泛用作獸用驅(qū)蟲(chóng)藥[6,9-10]。

現(xiàn)在市場(chǎng)上碘硝酚獸藥僅用于牛羊寄生蟲(chóng)病的治療，其在豬等其他家畜的寄生蟲(chóng)病治療上仍有著廣闊應(yīng)用前景，但由于對(duì)碘硝酚體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)等的相關(guān)研究較少，缺乏藥動(dòng)學(xué)參數(shù)等原始數(shù)據(jù)支撐，從而限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。為了擴(kuò)大碘硝酚的應(yīng)用范圍并為新型獸藥研發(fā)提供新的方法，應(yīng)進(jìn)行碘硝酚含量的準(zhǔn)確快速測(cè)定方法研究。目前對(duì)碘硝酚的定性定量分析方法主要有氧瓶燃燒法[11]、分光光度法[12]和高效液相色譜法[13-14]。氧瓶燃燒法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)；分光光度法專屬性不強(qiáng)，不夠準(zhǔn)確，兩者均無(wú)法滿足快速、準(zhǔn)確測(cè)定碘硝酚體外含量以及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的需求；高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏度高以及高自動(dòng)化、色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞且易回收等優(yōu)點(diǎn)；此外，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均能滿足高效液相色譜法的需求，故有較好的通用性，是藥物體內(nèi)外分析的理想方法[15-17]。但采用文獻(xiàn)的色譜條件進(jìn)行碘硝酚檢測(cè)時(shí)，存在色譜峰拖尾、分離度較差、重現(xiàn)性不好等問(wèn)題，且多數(shù)分析方法主要集中在外標(biāo)法。外標(biāo)法相對(duì)簡(jiǎn)便，但在實(shí)際應(yīng)用中準(zhǔn)確性受到進(jìn)樣量重復(fù)性、標(biāo)樣準(zhǔn)確性，以及儀器穩(wěn)定性等因素的影響。而內(nèi)標(biāo)法結(jié)合了峰面積歸一化法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)，在加入內(nèi)標(biāo)物后，該方法可以消除采用外標(biāo)法時(shí)由于進(jìn)樣量重復(fù)性、儀器穩(wěn)定性等變化所導(dǎo)致的誤差，定量方法相對(duì)準(zhǔn)確，尤其適用于分析樣品含量較少的情況。對(duì)于藥物的體內(nèi)分析而言，因樣品含量較少且處理過(guò)程較繁瑣，易引入誤差，而在此過(guò)程中加入內(nèi)標(biāo)物則可以校正誤差。因而，內(nèi)標(biāo)法分析的準(zhǔn)確度和精密度相對(duì)較高，是藥物體內(nèi)分析較為理想的選擇。本文通過(guò)優(yōu)化色譜條件，建立了碘硝酚的高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)方法，該方法靈敏，準(zhǔn)確度、分離度和重現(xiàn)性較好，為碘硝酚的體外含量測(cè)定及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

依利特P230Ⅱ型高效液相色譜儀，UV230Ⅱ紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器；Gene Company Limited DICO17型離心機(jī)(基因有限公司)；XW-80A型旋渦混勻器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；FA224型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；pH計(jì)(Mettler Toledo公司)；DK-8D型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；KQ2200E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水制備儀(沈陽(yáng)超純科技有限公司)。

0.22 μm針式濾器、0.45 μm水系濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.8%)；磷酸二氫鉀(天津市大茂化學(xué)試劑廠，含量≥99.5%)；磷酸二氫鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.0%)；冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.5%)；乙酸鈉(沈陽(yáng)沈一精細(xì)化學(xué)品有限公司，含量≥99.0%)；磷酸(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠，含量≥85%)；碘硝酚標(biāo)準(zhǔn)品(實(shí)驗(yàn)室自制，含量98.7%)；碘硝酚原料藥(沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，批號(hào)15112201、15112101、15111801、15112301)；碘硝酚注射液(沈陽(yáng)偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，批號(hào)16080901、16052401、16022901、15082401)；硝氯酚(實(shí)驗(yàn)室自制，純度99.75%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

供試品溶液：精密稱定碘硝酚原料藥(粉末)10 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，再取800 μL上述溶液加甲醇定容于10 mL容量瓶，即得80 mg/L供試品溶液；精密吸取100 μL碘硝酚注射液，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，再取400 μL上述溶液加甲醇定容于10 mL容量瓶，即得80 mg/L供試品溶液。

內(nèi)標(biāo)液：精密稱定硝氯酚10 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中，得1 mg/mL的硝氯酚內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)；流動(dòng)相為甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(70∶30，磷酸二氫鉀溶液pH 2.6)；進(jìn)樣量為20 μL；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；柱溫為30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)高效液相色譜儀的DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)碘硝酚標(biāo)液在235 nm處有最大吸收響應(yīng)值，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。

2.2 流動(dòng)相的選擇

先后采用甲醇-水[14]、甲醇-5.4%冰醋酸水溶液(pH 2.3)[13]、甲醇-0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 5.0)、甲醇-0.15 mol/L乙酸鈉溶液(pH 4.3)、甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)體系進(jìn)行樣品分析。結(jié)果表明，采用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，無(wú)法使目標(biāo)物獲得可定量分析的色譜峰形，這是由于碘硝酚結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在鄰位兩個(gè)碘原子的作用下酸性較強(qiáng)，并在弱堿及中性環(huán)境中較易解離。因此在該條件下，碘硝酚不成峰形。

采用甲醇-5.4%冰醋酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，碘硝酚的色譜峰出現(xiàn)拖尾；碘硝酚因呈酸性而易解離，可通過(guò)降低流動(dòng)相的pH值，使其更加穩(wěn)定。H+的增加可以有效抑制藥物的電離，減少其與色譜柱中游離硅羥基的作用，防止色譜峰拖尾，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度。但在該酸性體系中，流動(dòng)相經(jīng)混合后形成的有機(jī)溶液中H+濃度的波動(dòng)性較大，使pH值不能穩(wěn)定維持在一定范圍內(nèi)，從而不能有效抑制碘硝酚的電離，故峰形易出現(xiàn)拖尾。

企業(yè)內(nèi)部控制管理是以專業(yè)管理制度為基礎(chǔ)，以風(fēng)險(xiǎn)防范和有效監(jiān)督管理為目的，通過(guò)打造完善的過(guò)程性管控體系、流暢的管控流程來(lái)為企業(yè)經(jīng)營(yíng)發(fā)展保駕護(hù)航的一種規(guī)范性行為。有效的內(nèi)部控制管理對(duì)實(shí)現(xiàn)企業(yè)的統(tǒng)籌性經(jīng)營(yíng)發(fā)展意義重大，在有效的內(nèi)部控制管理約束下能夠引導(dǎo)各部門(mén)員工更好的落實(shí)自己的職責(zé)，確保企業(yè)財(cái)務(wù)管理信息的真實(shí)有效，將企業(yè)發(fā)展運(yùn)營(yíng)過(guò)程中可能遇到的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)控制在合理范圍內(nèi)。

采用甲醇-0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH 5.0)、甲醇-0.15 mol/L乙酸鈉溶液(pH 4.3)為流動(dòng)相時(shí)碘硝酚的色譜峰均出現(xiàn)前延現(xiàn)象，且后者較易出現(xiàn)基線漂移；主要原因是被分析物和鍵合相硅醇基之間的離子干擾。由于一般碘硝酚溶液的pH值為4.0左右，該緩沖鹽體系pH值高于藥物，因此不能保證碘硝酚在溶液中以原型形式存在。

圖1 甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鉀流動(dòng)相條件下碘硝酚和硝氯酚的色譜圖Fig.1 Chromatogram of disophenol and nitroclofene with methanol-0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate mobile phase a.disophenol(碘硝酚),b.nitroclofene(硝氯酚)

而采用甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 2.6)為流動(dòng)相時(shí)碘硝酚與硝氯酚的分離度較好，峰形理想，符合試樣檢測(cè)要求(見(jiàn)圖1)。在反相色譜條件下可離解的化合物可以選擇合適的緩沖液離子強(qiáng)度以及穩(wěn)定的pH值來(lái)保證可離解的官能團(tuán)處于一種游離形式，從而使色譜峰形得到顯著改善。經(jīng)綜合分析色譜條件后，最終采用甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(70∶30，pH 2.6)為流動(dòng)相。

2.3 色譜柱的選擇

先后采用Dikma C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)色譜柱進(jìn)行測(cè)試，以考察方法的適用性，結(jié)果表明兩者的柱效、分離度均良好。綜合考慮色譜柱的洗脫體積、保留時(shí)間等因素，最終選用依利特Sino Chrom C18(5 μm，4.6 mm×200 mm)色譜柱進(jìn)行后續(xù)考察。

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

先后采用苯甲酸和硝氯酚作為內(nèi)標(biāo)物，在“1.2.2”色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，苯甲酸色譜峰出現(xiàn)前延現(xiàn)象，且色譜峰保留時(shí)間較短(為3.8 min)。使用該內(nèi)標(biāo)物測(cè)定碘硝酚在體內(nèi)的血藥濃度變化時(shí)，將不利于其與血漿中較大極性的基質(zhì)進(jìn)行分離，從而造成色譜峰相互干擾影響測(cè)定結(jié)果；而硝氯酚與碘硝酚的物理化學(xué)性質(zhì)以及色譜行為和響應(yīng)特征基本相似，色譜峰峰形較好，且硝氯酚的保留時(shí)間為29.0 min，與碘硝酚色譜峰的保留時(shí)間間隔約為20 min，當(dāng)進(jìn)行血藥濃度測(cè)定時(shí)將有利于與血漿中極性較大的基質(zhì)分離，符合作為內(nèi)標(biāo)物的要求。綜上選用硝氯酚作為內(nèi)標(biāo)物。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限

分別精密吸取適量碘硝酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶并分別加入適量?jī)?nèi)標(biāo)液，用甲醇定容至刻度，制得內(nèi)標(biāo)物濃度為60 mg/L，碘硝酚濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)液。按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以碘硝酚濃度為橫坐標(biāo)(x，mg/L)，碘硝酚與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，碘硝酚質(zhì)量濃度在20～120 mg/L范圍內(nèi)呈線性，其回歸方程為：y=0.011 7x-0.015，r=0.999 6。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算碘硝酚的檢出限為0.15 mg/L，10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算碘硝酚的定量下限為1.5 mg/L。

圖2 溶劑、碘硝酚、硝氯酚以及實(shí)際樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of solvent,disophenol,nitroclofene and a real sampleA.solvent,B.disophenol and nitroclofene,C.a real sample；a.disophenol,b.nitroclofene,c.impurity

2.6 專屬性與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取碘硝酚與硝氯酚的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液以及溶劑各20 μL，按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得碘硝酚的保留時(shí)間為8.3 min，硝氯酚的保留時(shí)間為29.0 min，二者分離度大于1.5，分離效果較好，色譜圖見(jiàn)圖2。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取同一批號(hào)碘硝酚原料藥樣品3份，按“1.2.1”方法制備成80 mg/L的供試品溶液，分別加入約相當(dāng)于供試品溶液中碘硝酚含量80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即分別加入濃度為64、80、96 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并分別加入600 μL內(nèi)標(biāo)液，制得低、中、高3個(gè)濃度的溶液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算碘硝酚低、中、高3種濃度的平均回收率分別為96.0%、98.2%、90.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.72%、0.18%、0.18%。結(jié)果表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表1 實(shí)際樣品的含量測(cè)定結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性與重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取同一批號(hào)碘硝酚原料藥樣品，按“1.2.1”方法制備成供試品溶液，分別在樣品配制后的0、2、4、6、8、12 h按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得碘硝酚的平均含量為95.61%，RSD為0.34%。結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。

準(zhǔn)確稱取同一批號(hào)碘硝酚原料藥樣品5份，按“1.2.1”方法制備成供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)6次，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得碘硝酚的平均含量為95.65%，RSD為0.27%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

分別取不同批次的待測(cè)樣品按“1.2.1”方法制備成供試品溶液(其中分別加入600 μL內(nèi)標(biāo)溶液)，按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，與中華人民共和國(guó)獸藥典2015年版中的兩種檢測(cè)方法(紫外分光光度法、沉淀滴定法)相比[8]，使用本方法測(cè)定的實(shí)際樣品中碘硝酚含量均明顯降低。原因可能為碘硝酚原料藥中的有關(guān)雜質(zhì)，如對(duì)硝基苯酚等與碘硝酚在紫外光譜上有著相似的最大吸收波長(zhǎng)，傳統(tǒng)的紫外分光光度法無(wú)法進(jìn)一步區(qū)分，故含量測(cè)試結(jié)果偏高。而高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)碘硝酚的含量能排除有關(guān)雜質(zhì)的干擾，分析精度相對(duì)較高，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)碘硝酚的含量，方法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果更加準(zhǔn)確，可為碘硝酚質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和優(yōu)化提供參考依據(jù)，同時(shí)為碘硝酚的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)，也將為改變劑型、給藥途徑、應(yīng)用對(duì)象等方面的研究提供思路。

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Determination of Disophenol Content in Bulk Drug and Injection by High Performance Liquid Chromatography with Internal Standard Method

SUN Ting-ting1,TIAN Kai2,WANG Hong-li2,YANG Jie1,TIAN Chun-lian1,LIU Ming-chun1,NIU Sheng-li1*

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;2.Shenyang Vica Animal Husbandry Technology Limited Company,Shenyang 110027,China )

A simple and rapid method was developed for the determination of disophenol in bulk drug and injection via high performance liquid chromatography(HPLC) with the internal standard method.The sample was prepared with methanol to the test concentration,and filtrated with microfiltration membrane.Separation of analytes was achieved under isocratic elution on a C18column.The mobile phase consisted of a mixture of 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate(pH 2.6) and methanol(30∶70),and was delivered at a flow rate of 1 mL/min.The UV detection was set at 235 nm,and the column temperature was maintained at 30 ℃.The internal standard was nitroclofene and the injection volume was 20 μL.Under the optimum experimental conditions,the proposed HPLC-internal standard method provided a good linearity in the range of 20-120 mg/L for disophenol with the correlation coefficients(r) of 0.999 6.The average recoveries of disophenol at three spiked concentration levels of 64,80 and 96 mg/L were in the range of 90.4%-98.2%,with relative standard deviations(RSDs) of 0.18%-0.72%.The limits of quantitation(LOQs,S/N=10) and limits of detection(LODs,S/N=3) were 1.5 mg/L and 0.15 mg/L,respectively.With good precision,stability and repeatability,the established method was simple,accurate,rapid and reliable for the determination of disophenol in bulk drug and injection.

disophenol；nitroclofene；determination；high performance liquid chromatography(HPLC)；internal standard method

2017-02-24；

2017-04-23

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.016

O657.72；O625.312

A

1004-4957(2017)08-1038-05

*通訊作者：牛生吏，博士，講師，研究方向：新型獸藥研發(fā)與創(chuàng)制，Tel：024-88487156，E-mail：niushengli1@163.com