固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜及土壤中的春雷霉素殘留

戚 燕，賈曼婷，石夢(mèng)琪，李 輝，王珊珊，金 芬，佘永新，金茂俊，邵 華，鄭鷺飛，王 靜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

研究簡(jiǎn)報(bào)

固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜及土壤中的春雷霉素殘留

戚 燕，賈曼婷，石夢(mèng)琪，李 輝，王珊珊*，金 芬，佘永新，金茂俊，邵 華，鄭鷺飛，王 靜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

建立了測(cè)定黃瓜和土壤中春雷霉素殘留的固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE/HPLC-MS/MS)方法。黃瓜和土壤樣品分別經(jīng)1%甲酸的甲醇、0.5%甲酸水提取后，采用MCX固相萃取柱凈化，以Waters Xbridge BEH Amide色譜柱分離，0.2%甲酸水-乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正離子(ESI+)模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。該方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好，在2～250 μg/L濃度范圍內(nèi)，不同基質(zhì)中春雷霉素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.002 mg/kg，定量下限為0.008 mg/kg；在0.008、0.040、0.200、0.400 mg/kg 4個(gè)加標(biāo)水平下，春雷霉素在黃瓜和土壤樣品中的平均回收率為77.5%～97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～10.7%，能夠滿足黃瓜及土壤中春雷霉素殘留的檢測(cè)需求。應(yīng)用該法對(duì)田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，春雷霉素在黃瓜中的殘留量不超過(guò) 0.053 mg/kg，小于我國(guó)規(guī)定的黃瓜中最大殘留限量(0.2 mg/kg)；土壤中春雷霉素的殘留量不超過(guò)0.013 mg/kg。

春雷霉素；黃瓜；土壤；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；固相萃取

春雷霉素(Kasugamycin)，化學(xué)名為(5-氨基-2-甲基-6-(2，3，4，5，6-羥基環(huán)己基氧代)四氫吡喃-3-基)氨基-α-亞氨醋酸(結(jié)構(gòu)式見圖1),可通過(guò)干擾致病菌細(xì)胞內(nèi)部與氨基酸代謝相關(guān)的酯酶系統(tǒng)，影響蛋白質(zhì)的合成，從而抑制菌絲伸長(zhǎng)和細(xì)胞顆?；?，對(duì)蔬菜、瓜果和水稻等作物的多種細(xì)菌和真菌性病害具有較為理想的防治作用[1]。由于其對(duì)人、畜、家禽及水生生物的毒性均較低，符合現(xiàn)代環(huán)保要求，被農(nóng)業(yè)部列為無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)推薦農(nóng)藥[2]，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著人們對(duì)農(nóng)藥殘留引起的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題的日益關(guān)注，我國(guó)、日本、美國(guó)等國(guó)家均針對(duì)不同作物中的春雷霉素制定了最大殘留限量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)(0.04～0.2 mg/kg)，包括蔬菜、水果、谷類等農(nóng)作物[3-5]，其中我國(guó)和日本規(guī)定黃瓜中春雷霉素的臨時(shí)限量值為0.2 mg/kg。

圖1 春雷霉素的結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Structural formula of kasugamycin

春雷霉素的檢測(cè)方法包括高效毛細(xì)管電泳[6-7]、反相高效液相色譜法[8]、離子對(duì)色譜法[6,9-10]、親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]等。其中，高效毛細(xì)管電泳技術(shù)操作較為不便；反相高效液相色譜法由于春雷霉素的極性大，在色譜柱上保留時(shí)間較短，不利于春雷霉素與雜質(zhì)分離，靈敏度和準(zhǔn)確度較低；離子對(duì)色譜法通過(guò)加入十二烷基硫酸鈉等試劑改善了春雷霉素的分離效果，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作條件要求較高，且加入的離子對(duì)試劑可能會(huì)污染色譜柱及儀器；現(xiàn)有的親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然靈敏度較高，但前處理多需同時(shí)使用HLB和SCX兩種固相萃取柱凈化樣品，操作復(fù)雜，不利于大批量樣品的處理。目前雖然水、土壤、農(nóng)藥制劑等樣品中春雷霉素的分析方法[8,12,15]已有報(bào)道，但其在食品中的殘留分析方法相對(duì)較少，在黃瓜樣品中的殘留分析方法尚未見報(bào)道。

本研究以黃瓜及土壤為對(duì)象，采用固相萃取柱凈化樣品，通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、固相萃取吸附劑以及固相萃取條件等因素，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)，建立了SPE/HPLC-MS/MS測(cè)定黃瓜和土壤中春雷霉素殘留的分析方法，并利用該方法研究了春雷霉素在黃瓜和土壤中的殘留狀況。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，能夠滿足現(xiàn)有農(nóng)藥殘留最大限量標(biāo)準(zhǔn)需求，相關(guān)研究可為春雷霉素的科學(xué)使用以及食品中春雷霉素的殘留分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供重要依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 液相色譜儀(美國(guó) Agilent 公司)，API2000 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó) ABSciex公司)，IKA-2 高速勻漿機(jī)(德國(guó) IKA 公司)，高速離心機(jī)(美國(guó) Thermo 公司)，渦流混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司)，萬(wàn)分之一電子天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)。

春雷霉素(Kasugamycin)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%，德國(guó) Dr.E 公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Mreda公司)；6 mL(150 mg) Oasis MCX固相萃取柱(美國(guó)Waters 公司)。

1.2 儀器條件

1.2.1 高效液相色譜條件 Waters Xbridge BEH Amide色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～2 min，20%～50% A，2～7 min，50% A，7～7.1 min，50%～20% A，7.1～12 min，20% A；流速0.2 mL/min；柱溫28 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；噴霧電壓(IS+)：5 500 V；電噴霧離子源溫度(TEM)：450 ℃；霧化氣流量：50 psi；輔助加熱氣：344.7 kPa；氣簾氣：275.8 kPa；碰撞室入口電壓(EP)：10 V；碰撞室出口電壓(CXP)：4 V；定性離子對(duì)：m/z383.3/200.3，383.3/156.1；定量離子對(duì)：m/z383.3/112.1。

1.3 前處理方法

1.3.1 黃瓜及土壤樣品的提取 稱取勻漿后的黃瓜樣品5.0 g，加入10 mL 1%甲酸的甲醇溶液高速勻漿1 min，劇烈晃動(dòng)2 min后，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液。黃瓜殘?jiān)偌尤?10 mL 1%甲酸的甲醇溶液，高速勻漿1 min，劇烈晃動(dòng)2 min后，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液。合并兩次上清液，以1%甲酸的甲醇定容至25 mL。

稱取土壤樣品5.0 g，加入10 mL 0.5%甲酸水溶液高速勻漿1 min，劇烈晃動(dòng)2 min后以8 000 r/min離心5 min，吸取上清液。土壤殘?jiān)偌尤?0 mL 0.5%甲酸水溶液高速勻漿1 min，劇烈晃動(dòng)2 min后以8 000 r/min離心5 min，吸取上清液。合并兩次上清液，以0.5%甲酸水溶液定容至20 mL。

1.3.2 凈 化 分別移取5 mL黃瓜、土壤提取液加至已依次用5 mL甲醇和5 mL水活化的MCX固相萃取柱中，待樣液流盡后依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗固相萃取柱，真空抽至近干，再加入5 mL 2% 氨化甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中，氮?dú)庀麓蹈珊笥? mL甲醇-水(1∶1，體積比)復(fù)溶，渦旋后過(guò) 0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品約0.01 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，得1.0×105μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成約10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別用純?nèi)軇┖涂瞻谆|(zhì)提取液配制春雷霉素質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、125、250 μg/L的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2”條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3 次。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

考察了甲醇以及含不同甲酸含量的甲醇溶液對(duì)黃瓜樣品中春雷霉素提取效果的影響(圖2A)，結(jié)果表明，以1%甲酸的甲醇溶液提取2次可獲得較為滿意的回收率。對(duì)于土壤樣品，實(shí)驗(yàn)最初嘗試以甲酸含量為0～1.5% 的甲醇溶液作為提取液，但提取效果均較差，故考察了水以及不同甲酸含量的水溶液的提取效果(圖2B)。結(jié)果表明：以0.5%甲酸水溶液或1%甲酸水溶液提取2次時(shí)，提取效果均較好，但以1%甲酸水溶液為提取液時(shí)，春雷霉素在固相萃取小柱上的保留能力較差，導(dǎo)致回收率偏低。因此，最終確定以1%甲酸的甲醇溶液和0.5%甲酸水溶液分別作為黃瓜和土壤樣品的提取液，且各提取2次。

QuEChERS方法快速簡(jiǎn)單，但其去除干擾物質(zhì)的能力比SPE柱略差[16]。樣品凈化過(guò)程中首先嘗試采用QuEChERS方法，發(fā)現(xiàn)PSA、GCB 和 C18對(duì)樣品的凈化效果均較差，與溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相比，相同進(jìn)樣條件下同樣濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的響應(yīng)值下降了1/2，故采用固相萃取的方法凈化樣品。實(shí)驗(yàn)考察了HLB、SCX及MCX 3種固相萃取柱對(duì)黃瓜和土壤的凈化效果。結(jié)果顯示，MCX柱的回收率顯著優(yōu)于HLB柱及SCX柱，這是由于MCX柱屬于混合陽(yáng)離子交換柱，具有反相和強(qiáng)陽(yáng)離子交換保留雙重能力，對(duì)弱堿性的春雷霉素具有更好的保留能力。進(jìn)一步考察了2%、5%、10%氨化甲醇溶液以及洗脫體積對(duì)春雷霉素洗脫效果的影響。為避免雜質(zhì)干擾，綜合考慮回收率及處理效率，最終選擇5 mL 5%的氨化甲醇溶液為洗脫液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

圖3 黃瓜(A)及土壤(B)空白樣品中添加0.200 mg/kg春雷霉素后的色譜圖 Fig.3 Chromatograms of blank cucumber(A ) and soil (B) samples spiked with 0.200 mg/kg kasugamycin

春雷霉素是強(qiáng)極性化合物，在C18色譜柱上保留較弱，使用離子對(duì)試劑雖然可以提高其保留能力，但靈敏度較差，因此本實(shí)驗(yàn)考慮采用對(duì)極性化合物保留作用較強(qiáng)的親水相互作用色譜柱。比較了XBridge BEH Amide、XBridge BEH HILIC、Atlantis Hilic Silica(150 mm×2.1 mm，3.5 μm) 3種色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同色譜條件下，春雷霉素在XBridge BEH Amide色譜柱上保留能力較好。進(jìn)一步考察了乙腈-0.2%甲酸水體系中不同流動(dòng)相比例對(duì)春雷霉素色譜峰峰形的影響。結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈比例為80%或70%的流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫時(shí)，色譜峰峰形較差；當(dāng)以“1.2.1”所述條件進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，春雷霉素的色譜峰峰形對(duì)稱尖銳，且與雜質(zhì)的分離較好。故最終采用XBridge BEH Amide色譜柱進(jìn)行梯度洗脫分離。

2.3 工作曲線與檢出限

基質(zhì)效應(yīng)較大會(huì)影響分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，給分析結(jié)果帶來(lái)誤差[17-18]。分別將空白樣品提取液和溶劑配制的濃度為2～250 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同HPLC-MS/MS條件下進(jìn)行分析。春雷霉素的溶劑、黃瓜基質(zhì)和土壤基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=40.1x+76.8(r=0.999 9)、y=60.5x+ 385(r=0.999 5)、y=45.4x+15.1(r=0.999 6)。將春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至3倍信噪比(S/N=3)，以此進(jìn)樣濃度為檢出限(LOD)，以S/N=10對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為定量下限(LOQ)，得到春雷霉素在黃瓜和土壤基質(zhì)中的LOD為0.002 mg/kg，LOQ為0.008 mg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度

采用空白黃瓜和土壤樣品，分別添加4個(gè)水平(0.008、0.040、0.200、0.400 mg/kg)的春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述方法進(jìn)行提取凈化，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定5個(gè)樣品，典型的黃瓜和土壤添加回收譜圖見圖3。黃瓜中春雷霉素的平均回收率為77.5%～97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～4.6%；土壤中春雷霉素的平均回收率為79.1%～86.6%，RSD為7.2%～10.7%(表1)。結(jié)果表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度及精密度，可滿足春雷霉素殘留的分析要求。

表1 春雷霉素在黃瓜和土壤中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表2 黃瓜與土壤中春雷霉素的最終殘留量

*the residues of kasugamycin were lower than LOQs

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，運(yùn)用本方法對(duì)黃瓜和土壤田間實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定。田間試驗(yàn)于2015～2016年在湖北省武漢市、山東省濟(jì)陽(yáng)縣、海南省?？谑腥剡M(jìn)行，供試藥劑為30%春雷霉素·壬菌銅微乳劑，按照低劑量(春雷霉素33 g a.i/ha)、高劑量(春雷霉素49.5 g a.i/ha)各施藥3次、4次，施藥間隔7 d，末次施藥后間隔3、5、7 d采集樣品進(jìn)行田間處理，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，黃瓜和土壤樣品中春雷霉素的最終殘留量隨采收間隔時(shí)間的延長(zhǎng)而呈遞減趨勢(shì)，春雷霉素的殘留量均小于我國(guó)規(guī)定的黃瓜中最大殘留限量(0.2 mg/kg)。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)優(yōu)化樣品提取和凈化方法，建立了固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE/HPLC-MS/MS)測(cè)定黃瓜和土壤中春雷霉素殘留的分析方法。相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，該法簡(jiǎn)化了前處理步驟，采用親水相互作用色譜柱進(jìn)行柱色譜分離，有效降低了樣品基質(zhì)的干擾，提高了分析的靈敏度和準(zhǔn)確度。方法檢出限為0.002 mg/kg，在0.008～0.400 mg/kg添加水平下，春雷霉素在黃瓜和土壤中的平均回收率為77.5%～97.0%，RSD為2.6%～10.7%。該方法線性范圍寬、回收率高、精密度好，靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，能滿足黃瓜中春雷霉素殘留的監(jiān)測(cè)及該藥的殘留登記試驗(yàn)需求。

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Determination of Kasugamycin Residues in Cucumber and Soil by Solid Phase Extraction/High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QI Yan,JIA Man-ting,SHI Meng-qi,LI Hui,WANG Shan-shan*,JIN Fen,SHE Yong-xin,JIN Mao-jun,SHAO Hua,ZHENG Lu-fei,WANG Jing*

(Institute of Quality Stanard and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Ke Laboratory of Agro-products Quality and Safety of Chinese Ministry of Agriculture,Beijing 100081,China)

A sensitive solid phase extraction/high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(SPE/HPLC-MS/MS) method was developed for the determination of kasugamycin residues in cucumber and soil.The cucumber and soil samples were extracted with 1% formic acid methanol solution and 0.5% formic acid water solution,respectively,and cleaned up with MCX solid phase extraction column,then separated on a Waters Xbridge BEH Amide column using acetonitrile-0.2% formic acid as mobile phase by gradient elution.The qualitative and quantitative analyses were performed under positive electrospray ionization(ESI+) in multiple reaction monitoring(MRM) mode,with the matrix-matched calibrations.The calibration curves showed good linearities in the concentration range of 2-250 μg/L with correlation coefficients more than 0.999.The limits of detection(LOD) and the limits of quantitation(LOQs) were 0.002 mg/kg and 0.008 mg/kg,respectively.The average recoveries at four spiked levels(0.008,0.040,0.200,0.400 mg/kg) were in the range of 77.5%-97.0% for cucumber and soil,with relative standard deviations(RSDs) of 2.6%-10.7%.The method is simple,rapid,sensitive,accurate and reproducible,and could meet the requirements for analysis of kasugamycin residues in cucumber and soil samples.The method was applied in the detection of the field samples,and the contents of kasugamycin residues in cucumber and soil were found not more than 0.053 mg/kg and 0.013 mg/kg,respectively,which were below the maximum residue limits(MRL) for kasugamycin in cucumbers defined by China(0.2 mg/kg).

kasugamycin;cucumber;soil;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE)

2017-04-07；

2017-04-25

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程“農(nóng)業(yè)化學(xué)污染物殘留檢測(cè)及行為研究”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.008

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2017)08-0992-06

*通訊作者：王珊珊，博士，助理研究員，研究方向：農(nóng)藥殘留檢測(cè)究，Tel：010-82106569,E-mail：sunnynomadtea@163.com 王 靜，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，Tel：010-82106568，E-mail：w_ jing2001@126.com