生物膜層干涉技術(shù)在生物分子分析和檢測中應用的研究進展

楊國泰，吳 鑫，李福來，王辰時，何麗華，許恒毅*

(1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330046)

綜 述

生物膜層干涉技術(shù)在生物分子分析和檢測中應用的研究進展

楊國泰1，吳 鑫2，李福來1，王辰時1，何麗華1，許恒毅1*

(1.南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330046)

生物膜層干涉技術(shù)是基于光干涉信號實現(xiàn)對生物分子動力學分析或快速檢測的非標記分析檢測技術(shù)。因具有實時提供分析物信息、分析速度快和樣品耗量少等優(yōu)點，該技術(shù)已被應用于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類及其他生物分子之間相互作用的分析；所需樣品量少、特異性強等優(yōu)點也為該技術(shù)應用于快速檢測奠定了基礎(chǔ)。該文介紹了生物膜層干涉技術(shù)的基本原理，綜述了其在動力學分析和快速檢測領(lǐng)域的相關(guān)應用研究，并對其發(fā)展趨勢和應用前景進行了展望。

生物膜層干涉技術(shù)；動力學分析；快速檢測；綜述

非標記的生物分析方法無需借助人工標簽可直接檢測、分析生物分子，已被廣泛應用于生物分子間相互作用的分析和檢測[1]。非標記的生物分析方法具有如下優(yōu)勢[2-3]：①不需選擇和設計標簽，便于測定；②樣品處理簡單，分析檢測時間短；③避免了化學標簽對研究結(jié)果的影響。常見的非標記生物分析方法如表1所示。

生物膜層干涉(Biolayer interferometry，BLI)技術(shù)是基于光干涉原理的非標記技術(shù)，該技術(shù)除具有非標記生物分析方法的優(yōu)勢外，還具有操作簡單、無損檢測、樣品耗量少、實時提供分析物的直接信息和相互作用情況等優(yōu)點。通過對光干涉信號的實時監(jiān)測，BLI技術(shù)能夠廣泛應用于生物分子相互作用的分析或快速檢測。本文對BLI技術(shù)在動力學分析和快速檢測中的應用進行了綜述，旨在為生物分子研究中BLI技術(shù)的應用提供參考。

表1 非標記的分析檢測技術(shù)

圖1 BLI技術(shù)傳感器(A)及基本檢測過程(B)Fig.1 The sensor(A) and the basic detection process(B) of BLI

1 生物膜層干涉技術(shù)的原理

BLI通過實時監(jiān)測光干涉信號的變化來實現(xiàn)生物分子的相互作用分析或檢測(圖1)。生物分子結(jié)合到光纖材質(zhì)的生物傳感器末端形成一層生物膜，當待分析物結(jié)合在生物傳感器末端時會引起傳感器末端分子量的改變，從而導致生物膜厚度的改變。當自然光通過生物膜時會發(fā)生反射和透射現(xiàn)象，生物膜厚度的變化導致干涉光波發(fā)生相對位移，生物分子結(jié)合前后的干涉光波被光譜儀檢測到，形成干涉光譜，以干涉光譜的相對位移(nm)實時顯示出來[11](圖1B)。Octet?和BLItz?是基于BLI原理發(fā)展起來的商業(yè)化設備[12]。Octet?是多通道檢測設備，整個檢測過程完全自動化，能夠控制檢測模塊的溫度(控制范圍為4～40 ℃)，并且檢測后樣品可回收。BLItz?是單通道檢測設備，檢測過程需手動操作，不能控制檢測溫度，最少可檢測4 μL樣品。

2 生物膜層干涉技術(shù)在生物分子研究中的應用

2.1 生物膜層干涉技術(shù)在生物分子動力學分析中的應用

BLI技術(shù)因能實時檢測生物分子之間的相互作用且只需少量樣品，而被廣泛應用于生物分子的篩選純化、動力學常數(shù)的測定、相互作用的實時檢測等(表2)。

表2 生物膜層干涉技術(shù)在生物分子動力學分析中的應用

aAHQ：anti-murine IgG quantitation；bAMC：anti-mouse IgG Fc capture；cAHC：anti-hIgG Fc capture ；dSA：streptavidin；eSSA：super streptavidin；fAPS：aminopropylsilane

2.1.1 蛋白質(zhì)的動力學分析 目前，BLI技術(shù)對蛋白質(zhì)動力學分析的研究主要集中于蛋白質(zhì)的動力學常數(shù)測定、相互作用實時監(jiān)測以及篩選純化等方面。大量研究顯示，應用BLI技術(shù)對蛋白質(zhì)進行動力學分析具有結(jié)果準確可靠、樣品用量少、檢測速度快、無需標記等優(yōu)點。Wartchow等[25]利用BLI技術(shù)測定了3種與人類疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)(BCL-2、eIF4E和JNK1)與酶蛋白之間的相互作用，并將該方法與表面等離子共振技術(shù)(SPR)以及時間分辨熒光分析法進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLI技術(shù)在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的表征中得出的數(shù)據(jù)與SPR及時間分辨熒光分析法得出的數(shù)據(jù)相符，體現(xiàn)了BLI技術(shù)的準確性。Sanders等[26]基于BLI技術(shù)對小麥及小麥粉中抗體和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-卵白蛋白(DON-OVA)的親和力進行測定，與酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)相比,BLI技術(shù)可實現(xiàn)DON-OVA動力學的自動化檢測，所需檢測時間更短。

BLI技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用分析方面還具有結(jié)果明確、靈敏度高等優(yōu)勢，Li等[17]基于BLI技術(shù)測定了抗藥物抗體的親和力，并與ELISA及電化學發(fā)光免疫法(ECLIA)進行比較，結(jié)果顯示基于BLI技術(shù)的檢測方法在低親和力的抗藥物抗體檢測方面具有更高的靈敏度，并且在含有藥物樣品的測定中發(fā)現(xiàn)BLI技術(shù)更耐循環(huán)藥物的干擾；該檢測結(jié)果表明BLI技術(shù)在免疫原性評估研究中的巨大應用前景。BLI技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用的實時監(jiān)測方面也得到了廣泛應用。Ciesielski等[18]通過BLI技術(shù)對DNA聚合酶γ(Polγ)的兩個亞基Polγα、Polγβ的結(jié)合和解離進行實時監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合快而解離慢，由此反映出Polγ發(fā)生失調(diào)而導致線粒體疾病出現(xiàn)的情況與Polγ兩個亞基結(jié)構(gòu)之間相互作用情況的關(guān)系。此外，BLI技術(shù)也可用于蛋白質(zhì)的篩選純化。Brenac等[14]應用BLI技術(shù)對單克隆抗體進行分離純化，單克隆抗體的整體回收率達到90%，純度接近97%，表明BLI技術(shù)在提高單克隆抗體的純度、縮短單克隆抗體提取時間以及降低單克隆抗體的純化成本等方面具有良好應用價值。Do等[16]通過BLI技術(shù)純化了3種不同樹脂中的人免疫球蛋白G，結(jié)果顯示僅有少量人免疫球蛋白G殘留于原有樣品中，而負載在傳感器上的人免疫球蛋白G的回收率接近100%。

2.1.2 核酸的動力學分析 隨著應用范圍的不斷拓展，BLI技術(shù)在核酸的動力學分析中也被越來越多地應用。在核酸與蛋白質(zhì)的動力學分析中，He等[27]基于BLI技術(shù)測定了鋅指AN1型結(jié)構(gòu)域5(Zfand5)與腫瘤壞死因子的mRNA序列(ARETNF)、鋅指蛋白36(TTP)與ARETNF之間的解離常數(shù)KD，發(fā)現(xiàn)Zfand5和TTP在與ARETNF結(jié)合時，二者之間具有競爭關(guān)系。Normand等[28]應用BLItz?研究了有機偶氮苯染料CSB對ssDNA和蛋白質(zhì)Rad51之間相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)CSB對ssDNA和Rad51的偶聯(lián)具有強的抑制作用，表明BLI技術(shù)在核酸與蛋白質(zhì)相互作用的分析中具有好的應用效果。BLI技術(shù)也能用于核酸之間的動力學分析，Grieshaber等[29]通過BLI技術(shù)研究了衣原體基因組RNA(CTL0322和CTL0097)與參與蛋白質(zhì)HctA生成的RNA IhtA之間的實時相互作用，結(jié)果顯示CTL0322、CTL0097對IhtA具有明顯的作用效果，表明通過BLI技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)核酸之間的動力學分析，且結(jié)果準確。另外，鄭欣等[23]將BLI技術(shù)應用于核酸與小分子物質(zhì)相互作用的分析，測得適配體與石房蛤毒素間的親和常數(shù)Kd值為7.44 μmol/L，且該適配體不與河豚毒素結(jié)合。

2.1.3 其他生物分子的動力學分析 BLI技術(shù)在其他生物分子的動力學分析中也有廣泛應用。Wallner等[20]利用BLI技術(shù)測定了3種不同脂質(zhì)體制劑與固定化的重組人促紅細胞生成素之間的親和力常數(shù)等動力學數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示3種脂質(zhì)體制劑均能與固定蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的配合物，此外，脂質(zhì)體濃度依賴性的結(jié)合模式也得到了證明。Niu等[21]基于BLI技術(shù)測定了λ-卡拉膠和小分子物質(zhì)bFGF之間的親和力常數(shù)Kd、偶聯(lián)常數(shù)Kon和解離常數(shù)Kdis。Naik等[30]用BLI技術(shù)和SPR監(jiān)測炭疽毒素在pH驅(qū)動下發(fā)生孔隙易位的結(jié)構(gòu)和動力學變化，該研究成果可進一步用于利用藥物調(diào)節(jié)或抑制炭疽毒素的研究中。隨著技術(shù)的逐步成熟，BLI技術(shù)將會被越來越多地應用于各種生物分子動力學分析的研究中。

2.2 生物膜層干涉技術(shù)在生物分子快速檢測中的應用

BLI技術(shù)除了可對生物分子進行動力學分析以外，還可對蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其他小分子物質(zhì)進行快速檢測。應用BLI技術(shù)對生物分子進行快速檢測時，其所需樣品量少、特異性強的優(yōu)點能夠得到充分體現(xiàn)。

2.2.1 蛋白質(zhì)的快速檢測 通過BLI技術(shù)快速測定蛋白質(zhì)的方法已見諸報道，為了提高檢測的靈敏度，還發(fā)展出一系列放大信號的策略。Auer等[31]將諾洛病毒樣顆粒固定在Ni-NTA傳感器上，再連接諾洛病毒特異性抗體，通過在諾洛病毒特異性抗體上連接經(jīng)由HRP修飾的二抗、HRP氧化金屬螯合劑DAB形成沉淀實現(xiàn)信號放大，從而實現(xiàn)血清樣品中諾洛病毒特異性抗體的靈敏檢測，該方法能在10～20 min檢測出稀釋倍數(shù)達100 000倍的血清樣品中的諾洛病毒特異性抗體。Mechaly等[32]對劇毒蛋白質(zhì)蓖麻毒素進行了定量檢測研究，先在SA傳感器上固定抗體，然后與抗原連接，再在抗原上連接修飾有堿性磷酸酶的抗體，最后通過在含有堿性磷酸酶底物BCIP/NBT的溶液中沉浸，使其在傳感器表面析出不溶性結(jié)晶，實現(xiàn)放大干涉信號的效果，形成顯著的干涉現(xiàn)象，該方法可在17 min內(nèi)完成檢測，檢測限達10 pg/mL。

2.2.2 核酸的快速檢測 核酸是最基本的生命物質(zhì)之一，它在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起著決定性作用，開發(fā)核酸的檢測方法具有重要意義。Zhang等[33]應用BLI技術(shù)對目標DNA片段進行了檢測，首先在SA傳感器上固定DNA探針，隨后通過堿基互補配對結(jié)合方式將目標DNA捕獲在傳感器的表面，通過測定光干涉信號的變化實現(xiàn)檢測。由于微小核酸片段較小，低濃度時的光干涉信號較弱，檢測限較高(20 nmol/L)。為了提高檢測的靈敏度，作者設計了四面體結(jié)構(gòu)的DNA探針，通過“吊墜”模式進行信號放大，使檢測限提高了100倍。

2.2.3 其他生物分子的快速檢測 BLI技術(shù)還被用于糖類、小分子以及其他生物分子的快速檢測。劉小軍等[34]應用BLI技術(shù)快速檢測牛乳中的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留，結(jié)果顯示無標記狀態(tài)下氨芐青霉素的檢測靈敏度約為50 ng/mL，金標記狀態(tài)下靈敏度約為1.56 ng/mL；另外通過對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素進行BLI和膠體金免疫層析試紙條的檢測發(fā)現(xiàn)，BLI技術(shù)的檢測靈敏度比膠體金免疫層析試紙條的檢測靈敏度高1倍，且具有特異性強、無交叉反應的特點。Zhang等[33]將ATP與DNA四面體結(jié)構(gòu)的探針結(jié)合，再通過ATP與SA傳感器結(jié)合，實現(xiàn)了ATP的定量檢測，檢出限可達2 mmol/L。Paek等[35]將伴刀豆球蛋白A固定在傳感器上，并將傳感器浸入到半透膜隔離的含牛血清蛋白的基質(zhì)中，此時牛血清蛋白與伴刀豆球蛋白A結(jié)合，當傳感器沉浸到含葡萄糖的樣品中時，葡萄糖透過半透膜進入含牛血清蛋白的基質(zhì)中，并與伴刀豆球蛋白A結(jié)合，從而將牛血清蛋白競爭下來，使干涉信號產(chǎn)生變化，實現(xiàn)了葡萄糖的定量檢測。此方法能在15 min內(nèi)對10～500 mg/dL濃度范圍內(nèi)的葡萄糖樣品進行實時監(jiān)測。

3 總結(jié)與展望

BLI技術(shù)由于具有操作簡單、樣品耗量少、檢測速度快、結(jié)果準確等優(yōu)點，已被廣泛應用于生物分子的動力學分析和快速檢測。本文聚焦BLI，綜述了其在蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類及其他生物分子分析檢測中的研究進展。目前，BLI技術(shù)的應用范圍不斷擴展：由于SA傳感器的固化分子具有與細胞表面受體密度相似的獨特優(yōu)勢，BLI技術(shù)在病毒與受體直接分析方面嶄露頭角[36-37]；BLI技術(shù)也逐漸應用于菌體的直接檢測[32]和納米材料的動力學分析[38]等方面。但隨著生物分子分析檢測方法的不斷升級，BLI技術(shù)在提高結(jié)果的準確性、操作的簡便性、方法的經(jīng)濟性等方面面臨巨大挑戰(zhàn)。同時，BLI技術(shù)作為固液反應技術(shù)，仍然存在對實驗條件要求嚴格、應用范圍有局限等不足[11]。因此，BLI技術(shù)在完善檢測方法、拓寬檢測范圍等方面具有廣闊的發(fā)展空間。另外，隨著市場需求的不斷增加，BLI技術(shù)在降低使用成本、改進分析技術(shù)等方面還有待提升。相信經(jīng)過不斷的發(fā)展和完善，BLI技術(shù)必將在生物分子的分析檢測乃至更廣闊的領(lǐng)域發(fā)揮更大的價值。

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中科院生態(tài)環(huán)境研究中心在碳納米管毒理機制方面取得系列進展

中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學與生態(tài)毒理學國家重點實驗室郭良宏研究組在碳納米管細胞外排生物過程和效應方面取得重要進展，相關(guān)研究成果近期發(fā)表于國際著名納米科學期刊Small并作為當期的封底文章(Small,2016,12,5998-6011)。碳納米管具有獨特的理化性質(zhì)，在電子、環(huán)境和納米醫(yī)藥等領(lǐng)域的應用潛力巨大，而隨之帶來的潛在環(huán)境與健康危害也越來越受到關(guān)注。碳納米管與細胞的相互作用始于物理接觸，隨后被細胞攝入、外排或者降解，這些生物過程決定了碳納米管實際的細胞內(nèi)暴露量，因而對碳納米管后續(xù)的毒性/生物效應至關(guān)重要。全面深入了解這個復雜過程中涉及到的分子機制及后續(xù)生物效應，有利于揭示和調(diào)控碳納米管的生物活性，促進碳納米管技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展。

郭良宏研究組近年來一直致力于碳納米管的細胞毒代動力學和熱力學過程及其毒理機制的研究。研究組從分子水平、細胞功能和細胞自噬等角度，對碳納米管的免疫毒性機制進行了系統(tǒng)的研究。其工作中采用基因芯片技術(shù)研究了碳納米管對巨噬細胞全基因組基因表達的影響，通過生物信息學分析，解析出碳納米管在轉(zhuǎn)錄組水平對細胞的線粒體、蛋白酶體等細胞器以及細胞周期/凋亡等多個信號通路的基因表達的調(diào)控作用(Nanotoxicology,2012)。以此為線索，研究組以原代小鼠腹腔巨噬細胞(PMQ)和純化CD4+T淋巴細胞為模型，評價了碳納米管對PMQ吞噬功能、輔助細胞功能以及分泌細胞因子功能的干擾效應，揭示了碳納米管在非毒性劑量水平，對免疫細胞功能的影響(Nanotoxicology,2013)。

研究組近期在碳納米管的細胞內(nèi)吞、外排動力學過程研究中取得一系列新進展。研究定量分析了細胞累積碳納米管隨時間變化的趨勢，發(fā)現(xiàn)每個巨噬細胞最大能累積皮克級的碳納米管，巨胞飲在碳納米管內(nèi)吞過程中起主導作用，并存在明顯的細胞外排現(xiàn)象(Scientific Reports,2017)。碳納米管進入細胞后定位于溶酶體，阻礙了細胞自噬體的消解，細胞自噬流被阻斷，引起自噬體過度累積，導致細胞毒性。另一方面，通過調(diào)控細胞的呼吸爆發(fā)能有效控制其在溶酶體中的降解(Toxicology Letters,2013;International Journal of Molecular Sciences,2016)。研究首次發(fā)現(xiàn)一種特殊的嘌呤受體-P2X7參與介導了碳納米管的外排過程: 碳納米管暴露導致細胞外ATP(eATP)濃度上升，激活了P2X7受體及其后續(xù)的一系列信號傳導，并引起溶酶體堿化后沿著細胞骨架導軌排出細胞，碳納米管隨溶酶體一起排出(Small,2016)。重金屬離子Ni2+能通過抑制P2X7受體活性阻礙碳納米管的正常外排，造成過量的碳納米管在細胞內(nèi)累積，引起碳納米管毒性的顯著上升 (Environmental Science & Technology,2016)。以上工作明確了碳納米管細胞外排機制，不僅有利于深入了解碳納米管的毒性機制及提供可能的控制方法，還提出了一個納米材料與化合物協(xié)同毒性效應的新機制，為研究環(huán)境中碳納米管與其他污染物共存狀態(tài)下的安全性評價提供了新的思路。

以上研究工作得到了國家基金委和中國科學院的資助。

(信息來源：中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心)

Research Progress in Application of Biolayer Interferometry in Analysis and Detection of Biomolecules

YANG Guo-tai1，WU Xin2，LI Fu-lai1，WANG Chen-shi1，HE Li-hua1，XU Heng-yi1*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Jiangxi Institute for Food Control，Nanchang 330046，China)

Biolayer interferometry is an optical system that monitors interactions between biological materials and detects biological materials rapidly for lable-free.Due to its advantages of real-time,rapidness and low sample consumption,biolayer interferometry has been gradually used for detecting interactions between proteins,peptides,nucleic acids,small molecules,and/or lipids.Furthermore,biolayer interferometry could also provide a solid foundation in rapid detection field because of its low sample consumption and strong specificity.In this article,the principle of biolayer interferometry is discussed,and two major application areas including kinetic analysis and rapid detection are investigated and reviewed.The development trend and future application of biolayer interferometry for measuring biological materials are also prospected.

biolayer interferometry;kinetic analysis;rapid detection;review

2017-03-28；

2017-04-27

江西省青年科學家(井岡之星)培養(yǎng)對象項目(2014BCB23004)；江西省食品藥品監(jiān)督管理局科技計劃(2015SP13)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.020

O657.3;G353.11

A

1004-4957(2017)08-1055-06

*通訊作者：許恒毅，博士，副研究員，研究方向:食品生物技術(shù)，Tel:0791-88304447-222-9520，E-mail:kidyxu@163.com