超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜法測定豬糞便中6種抗生素殘留的基質效應研究

周悅榕，李丹妮，吳劍平，嚴 鳳，潘 娟，張 婧，顧 欣

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜法測定豬糞便中6種抗生素殘留的基質效應研究

周悅榕，李丹妮，吳劍平，嚴 鳳，潘 娟，張 婧，顧 欣*

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

基質效應普遍存在于液質聯(lián)用分析中。該文通過評價“離子抑制率”指標，系統(tǒng)考察了應用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜法(UPLC-ESI-MS/MS)測定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂菌素6種抗生素殘留的基質效應。樣品經McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取后，采用HLB固相萃取柱凈化，濃縮富集后用0.1%甲酸-甲醇溶液(85∶15，體積比)溶解。經SB C18RRHD色譜柱分離，以甲醇-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，在正離子電噴霧下采用多反應監(jiān)測模式檢測。結果表明，豬糞便基質對6種抗生素的測定存在基質增強效應。采用基質匹配標準曲線校正法并優(yōu)化樣品處理條件可以對基質效應產生的影響進行補償與消除。該研究為提高檢測結果的準確度與精密度提供了借鑒。

基質效應；離子抑制率；超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜(UPLC-ESI-MS/MS)；抗生素；豬糞便

20世紀90年代初，抗生素被廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1-2]，主要用于動物疾病預防與治療，作為飼料添加劑提高飼料利用率及作為動物的促生長劑等[3-5]?？股仡愃幬镞M入動物消化道后，僅少部分經過羥基化、裂解和葡萄糖苷酸化等代謝反應成為無活性的物質，大部分抗生素(約60%～90%)以原形或代謝物形式經畜禽糞、尿和有機肥等排入農田、土壤、大氣、河流湖泊、地下水等環(huán)境媒介中，最終通過食物鏈危及人類健康[1-15]。本實驗室曾建立了一種通過采集活體動物糞便測定獸藥殘留的液相色譜-質譜聯(lián)用檢測技術[16]。該方法具有較好的準確度和精密度，能實時監(jiān)控養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸藥使用情況，同時通過活體樣本采集的方式確保了動物本身的安全。

液相色譜-串聯(lián)質譜技術(LC-MS/MS)通過確定質量的母離子匹配相應特征質量的子離子進行目標物檢測，以其良好的特異性與高靈敏度著稱。基質效應(Matrix effects)是LC-MS/MS分析時存在的一個非常顯著的現象，會對目標化合物的準確定量產生極大影響，從而受到檢測者的高度重視[17-19]。美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)發(fā)布的《生物分析方法確證指南》(2001)[20]、歐洲醫(yī)藥評價署(EMEA)發(fā)布的《生物分析方法的驗證指南原則》(2011)[21]均明確指出，采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術(LC-MSn)對生物樣品中目標化合物進行檢測方法的開發(fā)和方法學驗證時，需要做基質效應考察。

本研究對實驗室原有檢測方法進行改良，利用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜(UPLC-ESI-MS/MS)技術建立了同時測定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂菌素6種抗生素殘留的分析方法，系統(tǒng)地評價了整個定量線性范圍內豬糞便樣品基質對6種抗生素測定的基質效應，并提出了針對性的消除方法，進一步提高了UPLC-ESI-MS/MS法測定豬糞便中6種抗生素殘留結果的準確度和精密度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters XevoTMTQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧(ESI+)離子源(美國Waters公司)；MassLynx v4.1質譜工作站(美國Waters公司)；PL202-L感量為0.01 g、AB135-S感量為0.000 01 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；MS3 B S25旋渦混勻器、KS-260旋渦振蕩器(德國IKA公司)；Sk7210HP 超聲波清洗器(上?？茖Ч?； Millipore A10超純水系統(tǒng)(密理博(上海)貿易有限公司)；3 mL/40 mg Waters Oasis?HLB Extraction Cartridge固相萃取柱(美國Waters公司)； VisiprepTM-DL 型固相萃取裝置(美國Supelco公司)；N-EVAP112 氮吹儀(美國Orangaomation公司)；親水PTFE 0.22 μm針式濾器(上海安譜科學儀器有限公司)。

鹽酸二甲氧芐啶(純度>99%)購自中國食品藥品檢定研究院；恩諾沙星(純度>99.8%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；環(huán)丙沙星(純度>99.9%)購自Sigma公司；金霉素(純度>92%)、泰樂菌素(純度>98%)、磺胺對甲氧嘧啶(純度>99%)均購自Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；甲醇、乙腈、氨水、醋酸、氫氧化鈉、硝酸鎂、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；檸檬酸(分析純，上?；瘜W試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；實驗用水為超純水；高純氮、高純氬(99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

標準儲備液：分別精密稱取6種抗生素藥物標準品0.01 g(精確至0.000 01 g)，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度各為1 mg/mL的標準儲備液，置于4 ℃冷藏保存，有效期6個月。

提取液溶液：McIlvaine-Na2EDTA(pH 4.0)緩沖液的配制：準確稱取27.55 g Na2HPO4、37.22 g Na2EDTA和12.9 g檸檬酸，用1 000 mL二級水定容，配制成含0.1 mol/L Na2EDTA的McIlvaine緩沖液。用1 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH 4.0，現配現用。

淋洗液：5%甲醇水溶液的配制：準確量取5 mL甲醇并加入95 mL二級水，充分混合。

定容液：0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15，體積比，下同)：準確量取15 mL甲醇，加入85 mL 0.1%甲酸水溶液，充分混合。

0.1%甲酸水溶液：準確量取1 mL色譜純甲酸，加入999 mL 一級水，充分混合。

1.2 樣品采集及前處理

1.2.1 樣品的采集 將采集的新鮮糞便樣品，-20 ℃冷凍干燥并儲存。

1.2.2 提 取 稱取豬糞便樣品1 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL Na2EDTA-McIlvaine(pH 4.0)緩沖液，充分振蕩10 min，8 000 r/min離心10 min，取出全部提取液。重復上述操作，合并2次上清液，充分混勻并準確吸取4.0 mL提取液，在4 ℃下10 000 r/min 離心10 min后待用。

1.2.3 凈 化 HLB固相萃取小柱(3 mL/40 mg)先用3 mL甲醇、3 mL水活化。取4 mL離心備用液過柱，依次用 3 mL 5%甲醇溶液淋洗，3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40 ℃水浴下用氮氣吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)溶解殘渣，溶液過0.22 μm濾膜后上機測定。若樣品液中含有的抗生素濃度超出儀器線性范圍，進樣前可用0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15)稀釋至合適濃度。

1.3 儀器條件[16]

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18RRHD(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～2.0 min，20.0%～25.0% A；2.0～3.0 min，25.0%A；3.0～6.0 min，25.0%～80.0%A；6.0～7.0 min，80.0%A；7.0～7.1 min，80.0%～20.0%A；流速：0.3 mL/min。

1.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式(ESI+)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；電離電壓：3.5 kV；錐孔溫度：500 ℃；脫溶劑氣流：800 L/h；反吹氣(氮氣)：50 L/h；定性離子對、定量離子對及對應錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 6種抗生素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

*quantitative ion pair

1.4 基質效應的評價方法

基質匹配標準曲線與混合標準系列溶液標準曲線的配制：分別精密量取6種抗生素標準儲備液，用適量甲醇稀釋成質量濃度為100 mg/L的標準品混合中間液。準確稱取1 g(精確至0.01 g)空白糞便，按“1.2”處理，即得空白糞便基質液。向空白糞便基質液中加入適量的混合標準中間液，配制成質量濃度分別為1、5、20、50、100 μg/L的基質匹配標準系列溶液。同時，用0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)稀釋標準品混合中間液配制成質量濃度范圍相同的混合標準系列溶液。在“1.3”儀器條件下，供液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜儀測定，以質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，以定量離子對相應的色譜峰面積(Y)為縱坐標，分別繪制6種抗生素的基質匹配標準曲線和混合標準系列溶液標準曲線，兩種標準曲線的標準品均現配現用，并獲得基質匹配標準曲線的斜率K2與混合標準系列溶液標準曲線的斜率K1，計算基質匹配標準中監(jiān)控離子響應強度比試劑標準中相應監(jiān)控離子響應強度減少的百分比[22]，以評價糞便樣品對目標化合物的基質效應。

2 結果與討論

2.1 基質效應的評價

液相色譜-串聯(lián)質譜技術因具有高分離性能、高選擇性與靈敏度、高準確度與精密度、高分析速度與檢測通量等優(yōu)勢被廣泛應用于生物樣品中痕量物質的分析與檢測。但采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜法進行目標化合物的痕量分析時，從色譜柱上共洗脫的非揮發(fā)性生物樣品基質組分與目標化合物離子在帶電液滴表面離子化的過程中相互競爭，影響電噴霧接口處目標化合物的離子化效率進而導致基質效應，并表現為“離子增強”或“離子抑制”作用，從而對定量分析方法的準確度和精密度產生影響[23-28]。其中，電噴霧離子源(Electrospray ionization ,ESI)受基質效應的干擾尤為顯著。

引起基質效應的物質來源主要為生物樣品中的內源性成分(如：離子顆粒物成分、強極性化合物、各種有機物、目標化合物的同類物及其代謝產物等)和樣品前處理過程中引入的外源性成分(如：塑料管中殘留的聚合物、固相萃取柱填料、離子對試劑、有機酸、緩沖溶液、流動相、色譜柱固定相流失物等)[27-28]。本研究的供試樣品“豬糞便”是一種成分復雜的生物樣品基質。從畜禽養(yǎng)殖場采集得到的糞便中水分占3/4，其余為固體成分(固體中30%為死細菌，10%～20%為脂肪，2%～3%為蛋白質，10%～20%為無機鹽，30%為未消化的殘存食物和消化液中的固體成分)[6]。因此，糞便中的這些內源性物質與樣品前處理過程中引入的各類外源性物質所導致的基質效應將導致檢測結果出現偏差。故本實驗采用“離子抑制率[22,29-33](Ion suppression)”評價整個定量線性范圍內樣品基質對6種抗生素測定的影響。

據文獻[22,29-33]報道，離子抑制率計算公式為Ion suppression=(K2-K1)/K1，其中K2為基質匹配標準曲線的斜率，K1為純溶劑標準曲線的斜率。當離子抑制率為0時，表示無基質效應；當離子抑制率大于0時，表示樣品基質對目標化合物的測定存在基質增強作用；當離子抑制率小于0時，表示樣品基質對目標化合物的測定存在基質抑制作用。通過比較6種抗生素在豬糞便基質中的離子抑制率實驗結果(見表2)發(fā)現：豬糞便樣品基質對這6種抗生素的測定存在明顯的基質增強效應，其中對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、金霉素、泰樂菌素測定的基質增強效應較為顯著。

表2 定容液與糞便基質樣品中6種抗生素的標準曲線與離子抑制率

2.2 基質效應的消除

目前，液相色譜-串聯(lián)質譜法中基質效應的消除方法主要有：改善儀器條件(如：優(yōu)化色譜條件和質譜條件，改用不同的離子源等)，選擇合適的樣品前處理方法，選擇性質相近或穩(wěn)定的同位素內標校正，采用空白基質匹配標準校正法、標準加入法等[22-27]。本實驗采用空白基質匹配標準曲線法進行定量，并與標準品稀釋校正曲線法的定量結果進行比較，結果見圖1。結果表明：通過空白糞便基質液進行標準溶液的稀釋，能使標準品與樣品溶液在電噴霧接口處具有一致的離子化條件，采用空白基質匹配標準曲線法進行定量，能起到消除樣品中基質效應的作用，確保定量結果的準確性。

同時，在日常檢測工作中發(fā)現，原有方法中使用親水性C18粉吸附提取液中懸浮糞便基質的做法存在缺陷[16,27-28]。因為吸附劑親水性C18粉將成為一種人為引入的外源性基質成分促進基質效應的產生，并且在大批量的檢測過程中難以準確把握C18粉的用量。C18粉的過量使用不僅會導致金霉素和泰樂菌素的損失，而且會造成固相萃取柱的阻塞。因此，在以確保前處理方法對目標化合物的提取效能為前提，并盡可能避免由前處理步驟引入其他的外源性基質成分而導致額外的基質效應，同時兼顧前處理方法的簡便性與可操作性的條件下，本實驗室對原有方法[16]進行了調整，并進行了方法學驗證，實驗結果表明經本研究改良的實驗方法效果良好。

2.3 樣品前處理方法的比較

本研究將本實驗室原有方法[16]在提取時加入吸附劑改為增加提取液用量，并在完全提取后對少量過柱樣液做高速冷凍離心處理，沉淀提取液中的蛋白質與懸浮雜質。本實驗采用空白糞便樣品加標回收率實驗，比較了本實驗室原有方法的樣品前處理方法與改良后樣品前處理方法對6種抗生素的提取效果。各目標化合物的添加量均為5倍定量下限(LOQ)，制得的空白基質加標樣品按兩組分別以原方法與本研究確定的“1.2”步驟進行樣品預處理，“1.3”步驟進行儀器測定，每個加標水平做6個平行，用基質匹配標準曲線定量，測定結果見表3。結果表明，改良后的樣品前處理方法對6種抗生素的回收率均高于原方法，提取效果更佳。增加提取液用量不僅有利于樣品前處理方法對目標化合物的提取效率，同時能稀釋樣品中的雜質成分，起到降低基質效應的作用。

表3 兩種樣品前處理方法對6種抗生素提取的批內回收率與相對標準偏差(n=6)

*without information

2.4 方法有效性驗證

2.4.1 基質匹配標準曲線 精密量取6種抗生素標準儲備液，用適量甲醇稀釋成質量濃度為100 mg/L的標準品混合中間液。分別精密量取一定體積的該標準品混合中間液，并添加到1 g(精確至0.01 g)空白糞便中，配制成10、30、50、100、200、500 μg/kg的基質加標樣，按照確定的前處理步驟與儀器條件進行樣品前處理與儀器測定。以質量濃度為橫坐標(X)，定量離子對相應的色譜峰面積為縱坐標(Y)，繪制基質匹配標準曲線，結果見表4。結果表明：二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、泰樂菌素在10～500 μg/kg、環(huán)丙沙星和恩諾沙星在30～500 μg/kg、金霉素在50～ 500 μg/kg質量濃度范圍內線性良好。

2.4.2 檢出限與定量下限 文獻[34]采用高效毛細管電泳的方法檢測畜禽糞便中氟喹諾酮類與四環(huán)素類的獸藥殘留，實驗結果表明：該方法對恩諾沙星與金霉素的定量下限均為0.098 mg/kg。本研究取空白糞便樣品做加標回收實驗，按“1.2”確定的實驗步驟操作，取信噪比S/N≥3為檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，結果見表4。結果表明：經本研究改良方法具有較低的檢出限和定量下限，優(yōu)于現有報道，檢測靈敏度高，能滿足對糞便樣品中痕量抗生素物質的檢測需求。

表4 6種抗生素的基質匹配標準曲線方程、相關系數、檢出限及定量下限

2.4.3 準確度與精密度 選擇豬糞便空白樣品作為供試對象，以定量下限(LOQ)的1倍、5倍、10倍 3個加標水平進行空白基質加標回收率實驗，考察方法的準確度與精密度。制得的空白基質加標樣品按照“1.2”與“1.3”條件進行樣品前處理與儀器測定，每個批次內同一加標水平平行6次，重復3批次，用基質匹配標準曲線定量，測定結果見表5。結果表明，在3個加標水平下，豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、泰樂菌素的回收率為66.3%～105.1%，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的回收率為71.0%～102.6%，金霉素的回收率為84.6%～104.9%。批內相對標準偏差(RSD，n=6)為3.8%～17.1%，批間RSD(n=3)為1.7%～15.7%。表明該方法的準確度和精密度滿足檢測要求。

表5 豬糞便中6種抗生素的批內、批間回收率及相對標準偏差

2.4.4 實際樣品檢測 經本研究改良的實驗方法能滿足日常工作對畜禽糞便中6種抗生素殘留的檢測要求，結果見圖2。隨機抽樣上海市某區(qū)養(yǎng)殖場的10個糞便樣品，采用本方法進行測定，每份樣品平行2次，實驗結果取平均值，檢測結果見表6。結果顯示：金霉素、泰樂菌素、恩諾沙星在實際豬糞便樣品中的檢出率分別達到100%、50%、20%。

表6 實際樣品中6種抗生素的檢測結果

*N.D.:not detected ;D.:detected(the result is higher than LOD but lower than LOQ)

3 結 論

本研究通過考察“離子抑制率”，系統(tǒng)地評價了液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜檢測模式下，豬糞便樣品基質對二甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂菌素6種抗生素的基質效應。結果表明，豬糞便基質對6種抗生素的測定存在不同程度的基質增強效應，采用基質匹配標準曲線校正法以及改良的樣品前處理方法能予以有效地消除。本研究為快速檢測并準確定量豬糞便中6種抗生素殘留提供了參考依據。

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50項食品安全國際標準即將出臺

由聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織在1963年創(chuàng)建的“食品法典委員會”在日內瓦舉行第四十屆會議，與會成員考慮通過一系列新的國際食品標準，以保護消費者健康并促進開展公平的食品貿易。

糧農組織與世衛(wèi)組織發(fā)表媒體通報稱，來自120多個國家的600多名代表此次齊聚日內瓦，參加“食品法典委員會”第四十屆會議，將對50項國際食品安全標準以及30多項新的工作建議進行討論，并對現行法典的文本進行更新。

大會當天首先通過了有關“動物性食品中獸藥最大殘留限量”的最新標準，分別對牛肉中的伊維菌素、雞肉等禽類食品中的拉沙洛西鈉以及三文魚中的氟苯脲殘留量進行了明確設定。同時，各國代表同意對《新鮮水果和蔬菜衛(wèi)生操作規(guī)范》進行修訂，強調所有食品的生產、處理和準備過程都涉及各種風險，但可以通過遵循良好的農業(yè)和衛(wèi)生措施來減少，以幫助控制微生物、化學和物理危害，最大限度地減少食源性疾病影響消費者或對公共衛(wèi)生造成負面影響的可能性。

“食品法典委員會”還通過了有關《營養(yǎng)標簽準則》的編輯修改，其中包括維生素D和E的營養(yǎng)參考值修訂，并批準了有關“預防和減少大米砷污染操作規(guī)范”的擬議草案。此外，依據《2014-2019年戰(zhàn)略計劃》，食典委將對一系列新工作提案進行審議，其中包括魚類中甲基汞最高含量、修訂《最大限度減少和控制抗菌素耐藥性操作規(guī)范》、食品中不經意出現的低水平化學物風險分析準則、減少精煉油及相關產品中化學污染物的操作規(guī)范，并修訂《特定植物油標準》，其中將涉及核桃油、杏仁油、榛子油、阿月渾子油、亞麻籽油和鱷梨油等。

自1963年以來，在聯(lián)合國糧農組織和世衛(wèi)組織的推動下，《食品法典》已經成為消費者、食品生產者和加工者、各國食品管理機構和國際食品貿易的全球參照標準。

(信息來源：科技日報)

Study on Matrix Effects in Analysis of Six Antibiotics in Swine Manure by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yue-rong,LI Dan-ni,WU Jian-ping,YAN Feng,PAN Juan,ZHANG Jing,GU Xin*

(Shanghai Animal Disease Control Centre，Shanghai 201103,China)

Matrix effects are universal phenomena in analysis of liquid chromatography-mass spectrometry.By evaluating ‘Ion suppression’,matrix effects of diaveridine,sulfameter,ciprofloxacin,enrofloxacin,chlorotetracycline and tylosin in swine manure detected by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS)were systematically investigated.The sample was extracted with McIlvaine-Na2EDTA buffer solution,purified and concentrated by a HLB Extraction Cartridge.The residue was dissolved by 0.1% formic acid-methanol(85∶15，by volume).The target compounds were separated on an SB C18RRHD chromatographic column with 0.1% formic acid-methanol as mobile phase by gradient elution and detected in multiple reaction monitoring(MRM) mode via positive electrospray ionization(ESI+).The result showed that matrix enhancement effects existed in the detection of six antibiotics in swine manure.Furthermore,matrix-matched calibration curve and modified sample treatment could be used to compensate or eliminate the matrix effects in analysis of six antibiotics in swine manure.The study provided a reference for improving the accuracy and precision of the detection result.

matrix effects;ion suppression;ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS);antibiotics;swine manure

2017-04-11；

2017-05-10

上海市科技興農重點攻關項目 [滬農科攻字(2011)第4-9號]資助

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.011

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)08-1010-08

*通訊作者：顧 欣，碩士，農業(yè)技術推廣研究員，研究方向：獸藥飼料與畜產品質量安全檢測，Tel：021-62689722，E-mail:guxun@sh163.net