基于QuEChERS凈化的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析食品中的6種生物胺

蔣林蓉，徐志偉，黃杰英，曾敏

(海南出入境檢驗(yàn)檢疫局，?？?570311)

基于QuEChERS凈化的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析食品中的6種生物胺

蔣林蓉，徐志偉，黃杰英，曾敏

(海南出入境檢驗(yàn)檢疫局，?？?570311)

建立了新鮮水產(chǎn)品(魚、蝦、蟹、魷魚)和動物源性腌制食品(腌制魚、蝦醬、魷魚干、沙丁魚罐頭)中6種生物胺組胺、尸胺、腐胺、酪胺、2-苯乙胺、色胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測方法。分別對提取方法、不同食品的分類預(yù)處理方法、液相色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。質(zhì)譜分析采用電噴霧正離子電離、多反應(yīng)監(jiān)測模式、外標(biāo)法定量。該方法對于新鮮水產(chǎn)品中生物胺的定量限、線性范圍和方法回收率分別為：0.10 mg/kg，10～200 ng/mL和74.18%～90.15%，對于動物源性腌制食品中生物胺的回收率為80.05%～95.58%。

生物胺；分類預(yù)處理；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；QuEChERS；檢測

生物胺是廣泛存在于生物體及多種食品中的一類低分子量含氮有機(jī)化合物，是激素、生物堿、核酸和蛋白質(zhì)合成的前體物質(zhì)，同時在人和動物的生物神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及代謝過程的活性細(xì)胞中發(fā)揮著重要的生理作用[1]。但是生物胺在動物和人體內(nèi)積聚達(dá)到高水平時或在其攝入量很高時會變得具有毒性[2]。除了其自身產(chǎn)生的毒性以外，生物胺可與亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌物亞硝胺、亞硝基吡咯烷、亞硝基哌啶等[3]。

食品中生物胺的檢測一直以來都是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，原因有二：一是生物胺本身具有的潛在毒性；二是生物胺可作為食品品質(zhì)的指示劑[4]。動物性食品中富含蛋白質(zhì),在加工和貯藏過程中會產(chǎn)生多肽和氨基酸,這些小分子物質(zhì)容易進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為生物胺。因此動物源性食品，特別是腌制食品中生物胺組分的檢測和控制尤為重要。

生物胺分子中缺少發(fā)色基團(tuán)，本身既無紫外吸收又無熒光及電化學(xué)活性，使得其分離及測定都比較困難。文獻(xiàn)報道的測定生物胺的方法主要有薄層色譜法(TLC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜法(GC)[7]、離子色譜法(IC)[8]、毛細(xì)管電泳法(CE)[9]等。已報道的HPLC法需要柱前或柱后衍生，操作繁瑣且衍生條件苛刻，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，陽性樣品無法確證，不適用于日常批量檢測。QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)方法由Anastassiades等[10]于2003年提出。該方法具有快速、簡單、便宜、高效、可靠和安全等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥和獸藥殘留檢測中樣品的凈化[11]。本研究采取改良的QuEChERS前處理方法，建立了多種動物源性食品的分類預(yù)處理方法和這些食品中6種生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測方法。并對多種食品中6 種生物胺進(jìn)行了定性及定量分析，為不同動物源性食品中生物胺含量的控制提供了更多技術(shù)選擇。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

API-4000QTRAP質(zhì)譜儀 美國AB公司；渦旋振蕩器，渦旋混合器 美國IKA公司；天平(感量為0.1 mg和0.01 g) 德國梅特勒公司；高速冷凍離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速11000 r/min) 德國Hettich公司；氮?dú)鉂饪s儀 美國 Turbovap公司；聚丙烯離心管:50 mL，具塞；移液器:1000，100 μL；液相色譜儀、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)吸附劑(40 μm，100 gm)、十八烷基硅烷(Octadecylsilane，C18)吸附劑(40 μm，100 gm) 美國Agilent公司。

甲醇、甲酸、乙腈(均為色譜純)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：尸胺鹽酸鹽(Cadaverine dihydrochloride，CAS NO.1476-39-7，C5H14N2·2HCl)、組胺鹽酸鹽(Histamine dihydrochloride，CAS NO. 56-92-8，C5H9N3·2HCl)、腐胺鹽酸鹽(Putrescine dihydrochloride，CAS NO. 333-93-7，C4H12N2·2HCl)、酪胺鹽酸鹽(Tyramine hydrochloride，CAS NO. 60-19-5， C8H11NO·HCl)、2-苯乙胺(2-Phenylethylamine，CAS NO. 64-04-0，C8H11N) 均購于Dr公司(純度均>97.5%)；色胺(Tryptamine，CAS NO. 61-54-1，C10H12N2) 購于TRC公司(純度>95.0%)。其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為一級水。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別稱取6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品適量(精確到0.1 mg)于10 mL棕色容量瓶中，用適量水溶解并定容，得1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃避光保存，可使用6個月。

1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱:Waters 親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)，粒度1.7 μm或相當(dāng)者；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相:A乙腈，B 0.1%甲酸水；梯度:t=0 min，95% A，5% B；t=3.0 min 時，50% A，50% B；t=7.0 min 時，50% A，50% B；t=8.0 min 時，95% A，5% B；t=15.0 min 時，95% A，5% B；流速:0.30 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：電噴霧正離子(ESI+)掃描； 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)； 輔助加熱氣：N2。氣簾氣壓力(CUR)：30.00 psi(N2)；碰撞氣壓力(CAD)：5.0 psi(N2)；電噴霧電壓(IS)：5500 V；離子源溫度(TEM)：600 ℃；霧化氣壓力：55.00 psi(N2)；輔助氣壓力：55.00 psi(N2)。

1.3 樣品預(yù)處理、提取與凈化

本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)測的樣品有73種，分別為魚、蝦、蟹、魷魚、腌制魚、蝦醬、魷魚干、沙丁魚罐頭等，根據(jù)樣品的性質(zhì)不同分為新鮮水產(chǎn)品和動物源性腌制食品兩大類，它們相對應(yīng)的預(yù)處理、提取和凈化步驟如下。

1.3.1 提取

新鮮水產(chǎn)品，稱取2 g水產(chǎn)品樣品(精確到0.001 g)，置于離心管中，加入20.00 mL提取液[乙腈+甲醇(9+1)]，渦旋混勻，加入無水硫酸鈉5 g，渦旋混勻，4 ℃下以11000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液供凈化。動物源腌制食品，稱取0.5 g樣品(精確到0.001 g)，置于離心管中，加入50.00 mL乙腈，渦旋混勻，加入無水硫酸鈉5 g，渦旋混勻，4 ℃下以11000 r/min離心5 min，移取20 mL上清液，40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮?dú)獯祾咧列∮?.8 mL，加入甲醇0.2 mL，再用乙腈定容至2 mL。

1.3.2 凈化

移取2 mL上清液于加有100 mg PSA吸附劑和100 mg C18吸附劑的玻璃試管中，渦旋混勻1 min，4 ℃下以4000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇會直接影響分析方法的回收率。孫亞軍等[12]選取1%三氯乙酸(TCA)提取，HPLC-MS/MS測定蝦仁中8種生物胺，該方法沒有樣品的凈化過程，在大批量日常分析時可能會導(dǎo)致質(zhì)譜中污染物殘留而使質(zhì)譜響應(yīng)降低。梁波[13]利用0.01%甲酸水+0.05%氨水甲醇混合溶液提取廣式臘味中的生物胺。

分別選用乙腈、甲醇、水、1%甲酸乙腈、1%甲酸甲醇、乙腈+甲醇和乙腈+甲醇+甲酸進(jìn)行提取。提取后的上清液經(jīng)QuEChERS凈化后通過HPLC-MS/MS檢測。結(jié)果表明：采用純乙腈進(jìn)行提取，提取出的雜質(zhì)最少，但色胺的回收率過低，必須增加乙腈的使用量以確保樣品中生物胺的充分提??；使用含水溶劑或甲醇提取，強(qiáng)氫鍵作用會使提取出的雜質(zhì)增多；使用含甲醇的乙腈提取，提取效率最高，但在實(shí)驗(yàn)基質(zhì)為腌制水產(chǎn)品時，由于基質(zhì)復(fù)雜，提取出的雜質(zhì)尤其是鹽分較多，后繼處理難度較大，鹽分進(jìn)入質(zhì)譜儀會明顯降低其響應(yīng)值；使用1%甲酸乙腈提取，組胺、腐胺、尸胺的基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，影響定量分析的準(zhǔn)確性。

因此，在實(shí)驗(yàn)時對樣品進(jìn)行分類預(yù)處理以達(dá)到較好的提取效果?；|(zhì)為腌制水產(chǎn)品時，選取乙腈提取溶劑，能夠有效去除樣品中的大部分雜質(zhì)；同時，減少稱樣量并增加提取時乙腈的使用量，能得到滿意的回收率，但需要在提取后吹干定容時加入一定比例的乙腈和甲醇以達(dá)到較好QuEChERS凈化效果?；|(zhì)為新鮮水產(chǎn)品時，采用含甲醇的乙腈為提取溶劑，回收率較好，操作步驟簡單，也可減少有機(jī)溶劑的使用量。

進(jìn)一步優(yōu)化新鮮水產(chǎn)品提取時乙腈/甲醇或乙腈/水的比例，分別使用不同比例的乙腈+甲醇(5/95,1/9,1/1,8/2,9/1,95/5,99/1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：隨著提取溶劑中甲醇組分的提高，腐胺和尸胺的回收率明顯增加；但甲醇或水含量過高時，雜質(zhì)含量也上升，樣品的基質(zhì)效應(yīng)不斷增強(qiáng)，影響定量分析的準(zhǔn)確性。在甲醇含量為5%時，腐胺的回收率約為50%，尸胺的回收率約為70%，其余生物胺的回收率均大于80%；在甲醇含量為10%時，各生物胺回收率均可達(dá)到分析要求；在甲醇含量達(dá)到20%時，色胺開始出現(xiàn)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。綜合以上結(jié)果，選擇含10%甲醇的乙腈為提取溶劑，同時也可保證后期的凈化效果達(dá)到分析要求。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法將適量的凈化劑直接作用于提取液中，盡可能多地吸附雜質(zhì)的同時保留目標(biāo)物，和普通的SPE相比少了淋洗、洗脫等步驟，相對普通的SPE方法更為快捷和簡便。PSA吸附劑能夠清除許多極性干擾成分，如脂肪酸、親脂性色素和糖類等，但去除甾醇效果一般；C18吸附劑去除膽固醇、甾醇、色素的效果較好[14]。本研究選擇在提取時采用改良的QuEChERS方法，使用無水硫酸鈉除去水分，同時使用PSA和C18混合吸附劑，有效去除提取液中的干擾雜質(zhì)，具有良好的凈化效果。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧正離子方式下，以組胺、尸胺、腐胺、酪胺、2-苯乙胺、色胺標(biāo)準(zhǔn)溶液泵進(jìn)樣進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，對幾種生物胺進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)，得到分子離子，即母離子；對被測物的分子離子碰撞后，進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到子離子質(zhì)譜圖。此外，還對離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔反吹氣流量等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。6種生物胺的定性離子對、定量離子等具體參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in multiple reaction monitoring (MRM) mode

注：*為定量離子。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果表明：MRM模式中6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間在4.47～7.29 min之間，溶劑峰干擾小，15 min內(nèi)可完成對單個樣品6種生物胺的定性和定量分析，適用于生物胺的日常檢測。

2.4 檢出限和線性范圍

參照標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成10～200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種化合物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。以10倍信噪比(S/N=10)所對應(yīng)濃度作為方法定量限(LOQ)，6種生物胺的方法定量限在0.10 mg/kg，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和檢出限見表2。

表2 6種生物胺的線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Linear experimental results of six biogenic amines

2.5 液相色譜柱和流動相的選擇

生物胺屬于小分子量的極性氨基酸，在反相色譜柱中不易保留。HILIC柱通過采用強(qiáng)極性固定相，并且結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相組成的流動相，能為強(qiáng)極性樣品提供合適的保留時間。選擇HILIC柱進(jìn)行生物胺的色譜分離。結(jié)果表明：優(yōu)化后的梯度洗脫條件(1.2)，可較好地檢測6種生物胺。

在使用HILIC柱進(jìn)行色譜分離時對流動相進(jìn)一步優(yōu)化，用乙腈/0.1%甲酸水(7/3)等度洗脫時，腐胺、尸胺、組胺峰形較好，但酪胺、2-苯乙胺、色胺在色譜柱上基本無保留；用乙腈/水或乙腈/0.1%甲酸水梯度洗脫時，腐胺、尸胺、組胺色譜峰過寬，拖尾嚴(yán)重。采用乙腈/1%甲酸水梯度洗脫時，6種生物胺的峰形、保留時間和響應(yīng)值均較好。因此本研究選擇HILIC柱進(jìn)行分離，使用乙腈/1%甲酸水流動相梯度洗脫，可兼顧幾種生物胺的質(zhì)譜響應(yīng)及色譜保留效果。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

以魚、蝦、蟹、魷魚、腌制魚、魷魚干、蝦醬、沙丁魚罐頭等為代表基質(zhì)進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn)，新鮮水產(chǎn)品類添加水平為0.1 mg/kg，每個濃度設(shè)定6個重復(fù)實(shí)驗(yàn)，6種生物胺的平均回收率在74.18%～90.15%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.22%～8.04%之間。動物源性腌制食品中因有不同程度生物胺本底值的檢出(0.12～1.06 mg/kg)，故將其添加水平設(shè)定為1 mg/kg，并減去本底值后計算回收率。動物源性腌制食品中幾種生物胺的平均回收率在80.05%～95.58%之間。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.01%～7.84%之間。6種生物胺在8種陰性基質(zhì)中的添加回收率及精密度見表3。在生物胺有檢出的腌制水產(chǎn)品中的添加回收率及精密度見表4。魚肉陰性樣品加標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。

表3 不同基質(zhì)中生物胺的加標(biāo)平均回收率與 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6，0.1 mg/kg)Table 3 Adding standard recoveries and relative standard deviations (RSDs) of biogenic amines in different matrix (n=6，0.1 mg/kg) %

表4 腌制水產(chǎn)品中生物胺的加標(biāo)平均回收率與 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6,1 mg/kg)Table 4 Adding standard recoveries and relative standard deviations (RSDs) of biogenic amines in salted aquatic products(n=6,1 mg/kg) %

圖1 魚肉陰性樣品加標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)色譜圖(10 ng/mL)Fig.1 Chromatograms of biogenic amines spiked in a negative fish sample(10 ng/mL)

2.7 實(shí)際樣品中生物胺含量的測定

在以上建立的實(shí)驗(yàn)條件下，對73種海南口岸市場購買的淡水養(yǎng)殖、海水養(yǎng)殖、海捕水產(chǎn)品及動物源性腌制食品進(jìn)行了生物胺含量的測定，并計算了每種基質(zhì)中6種生物胺的總量，測定結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際樣品中生物胺含量的檢測Table 5 The detectien results of biogenic amines in actual samples mg/kg

續(xù) 表

結(jié)果表明:大部分所測食品中均有不同程度的生物胺組分檢出，個別樣品中6種生物胺的總量高達(dá)248 mg/kg，可能是由于抽取樣品新鮮程度不同對樣品中生物胺含量有所影響。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了多種食品(新鮮水產(chǎn)品和動物源性腌制食品)中生物胺的分類預(yù)處理方法和這些食品中6種生物胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測方法，并對73種實(shí)際樣品進(jìn)行了生物胺含量的檢測。采用乙腈+甲醇提取，利用改進(jìn)的QuEChERS方法，使用PSA和C18混合吸附劑凈化除去雜質(zhì)，結(jié)合RPLC-TMS分析，采用外標(biāo)法定量，前處理簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性可靠，適用于食品中生物胺成分的定性和定量測定。

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Determination of Biogenic Amines in Food by Modified QuEChERS Methodand Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

JIANG Lin-rong, XU Zhi-wei, HUANG Jie-ying, ZENG Min

(Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570311, China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method is established for the quantitative determination of biogenic amines in fresh aquatic products (fishes, shrimps, crabs and squids) and animal derived foods (salted fishes, shrimp sauce, dried squids and tinned sardines). The pre-processing methods of different kinds of foods, the extraction methods, the liquid chromatography and mass spectrometric conditions are optimized. Biogenic amines are analyzed by positive electrosprary ionization (ESI+) tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring (MRM) mode. Quantification is achieved using external standard method. The detection limits, linear ranges and recoveries of this method for fresh aquatic products are 0.1 mg/kg, 10～200 ng/mL and 74.18%～90.15% respectively. The recoveries of biogenic amines spiked in animal derived foods are between 80.05%～95.58%.

biogenic amines；classified pre-processing method；LC-MS/MS；QuEChERS；determination

2017-02-16

海南省自然科學(xué)基金項目(313105)

蔣林蓉(1981-)，女，工程師，博士，研究方向:食品中有毒有害物質(zhì)檢測。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.028

1000-9973(2017)08-0127-06