Cajal間質(zhì)細(xì)胞在急性膽囊炎中的分布

邱 虎， 黃振鵬， 羅 曼， 余保平

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430000

Cajal間質(zhì)細(xì)胞在急性膽囊炎中的分布

邱 虎， 黃振鵬， 羅 曼， 余保平

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430000

目的 研究膽囊各部位Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal, ICCs)在急性膽囊炎中的分布。方法 健康成年豚鼠30只，隨機(jī)分為正常組、膽總管結(jié)扎24 h和48 h組，通過(guò)膽總管結(jié)扎方法構(gòu)建急性膽囊炎模型，收集每組膽囊HE染色、免疫熒光染色觀察膽囊炎癥程度和ICCs分布情況。結(jié)果 正常組膽囊組織未見炎性改變，膽總管結(jié)扎24 h組可見炎癥較輕，膽總管結(jié)扎48 h組可見明顯炎性改變。炎癥逐漸加重時(shí)，ICCs數(shù)量逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；各組膽囊ICCs的數(shù)量從膽囊底部到膽囊頸部逐漸增加，但隨炎癥程度發(fā)展數(shù)量均有減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 發(fā)生急性膽囊炎時(shí)，膽囊各部位ICCs減少，這可能是導(dǎo)致膽囊動(dòng)力學(xué)障礙重要原因之一。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞；膽囊；急性膽囊炎

急性膽囊炎是消化內(nèi)科臨床中常見的疾病，Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal, ICCs)是消化道的起搏細(xì)胞，具有神經(jīng)傳遞的功能，因此ICCs的異常與消化道動(dòng)力性疾病的發(fā)病機(jī)制有著密不可分的關(guān)系[1-2]。膽囊平滑肌中也存在ICCs，且對(duì)膽囊的自發(fā)節(jié)律性電活動(dòng)和自動(dòng)節(jié)律性收縮活動(dòng)具有調(diào)控作用[3]。研究報(bào)道急性膽囊炎引起膽道平滑肌受損，將會(huì)導(dǎo)致膽囊動(dòng)力性收縮障礙，但當(dāng)發(fā)生急性炎癥時(shí)，膽囊中ICCs分布尚不清楚[4]。本研究通過(guò)研究急性膽囊炎時(shí)膽囊中ICCs分布，從而間接證明膽囊ICCs對(duì)膽囊動(dòng)力學(xué)影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只健康成年豚鼠購(gòu)自武漢生物研究所，體質(zhì)量250～350 g，雌雄不限[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2012-0013]。隨機(jī)均分為3組，正常組、膽總管結(jié)扎24 h組(BDL-24 h組)、膽總管結(jié)扎48 h組(BDL-48 h組)，并置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)號(hào)：10190A)。

1.2 急性膽囊炎模型的構(gòu)建 腹腔內(nèi)注射濃度百分比5%水合氯醛溶液麻醉，腹部備皮，劍突下1 cm左右沿腹中線切口，游離膽總管，在十二指腸入口處結(jié)扎膽總管，隨后逐層縫合。豚鼠清醒后，移至籠內(nèi)，可給予進(jìn)食和喂水。分別在12 h、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組收集膽囊組織，4%多聚甲醛固定[5]。

1.3 溶液與試劑 豚鼠抗c-kit抗體為eBiosicence c-kit(CD-117)，購(gòu)自美國(guó)eBiosicence公司，濃縮型正常山羊血清、熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 HE染色 取各組膽囊組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片5 μm厚，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組膽囊病理學(xué)改變。

1.5 免疫熒光檢測(cè)c-kit陽(yáng)性細(xì)胞 切片依次放入二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→無(wú)水乙醇Ⅰ→無(wú)水乙醇Ⅱ→95%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精；采用微波抗原修復(fù)10 min；滴加稀釋好的正常山羊血清，室溫封閉30 min后棄去；滴加稀釋好的一抗(稀釋比例1∶50)，4 ℃濕盒中孵育過(guò)夜；PBST沖洗切片3次，每次3 min；吸水紙擦干切片后滴加稀釋好的熒光二抗(稀釋比例1∶100)，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBST沖洗切片4次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST沖洗切片4次，每次5 min，洗去多余的DAPI；用吸水紙擦干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 經(jīng)HE染色后，光鏡下可見正常組膽囊組織各層結(jié)構(gòu)基本完整，未見充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，BDL-24 h組膽囊組織可見輕微充血、水腫及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；BDL-48 h組膽囊組織可見明顯充血、水腫及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有部分黏膜上皮脫落(見圖1)。

圖1 膽囊組織HE染色(200×) A：正常組；B：BDL-24 h組；C：BDL-48 h組Fig 1 Gallbladder tissue HE staining(200×) A: normal group; B: BDL-24 hours group; C: BDL-48 hours group

2.2 ICCs免疫熒光染色 在豚鼠急性膽囊炎模型中，正常組ICCs多呈紡錘狀或星形，伴有兩個(gè)或多個(gè)突起，表達(dá)于肌層和黏膜層，呈網(wǎng)絡(luò)狀分布。與正常組相比， BDL-24 h組、BDL-48 h組ICCs的形態(tài)發(fā)生變化，ICCs突起消失。數(shù)量上，隨炎癥發(fā)展，膽囊ICCs逐漸減少，正常組、BDL-24 h組、BDL-48 h組的數(shù)量分別為61.6667±2.08167、54.0000±1.73205、38.3333±1.52753，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.690,P=0.000)。對(duì)膽囊底、體和頸三個(gè)不同部位分別研究中，發(fā)現(xiàn)膽囊ICCs的數(shù)量從膽囊底到膽囊頸明顯逐漸增加，但隨炎癥程度發(fā)展，膽囊ICCs的數(shù)量均有減少，正常組膽囊頸、膽囊體、膽囊底Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量分別為70.0000±2.00000、60.6667±3.78594、53.6667±4.04145，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.433,P=0.003)；DBL-24 h組膽囊頸、膽囊體、膽囊底ICCs數(shù)量分別為60.3333±2.51661、55.0000±1.00000、46.6667±3.51188，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.712,P=0.002)；DBL-48 h組膽囊頸、膽囊體、膽囊底ICCs數(shù)量分別為50.3333±1.52753、39.0000±1.00000、25.6667±3.05505，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=108.316,P=0.000)(見圖2～4)。

圖2 急性膽囊炎各組膽囊ICCs的數(shù)量變化Fig 2 The quantity changes of ICCs in acute cholecystitis

圖3 急性膽囊炎膽囊不同部位膽囊ICCs的數(shù)量變化

Fig 3 The quantity changes of ICCs in different parts of acute cholecystitis

3 討論

急性膽囊炎是急診中常見的疾病，其診斷對(duì)臨床醫(yī)師仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。急性膽囊炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前考慮主要由于膽管梗阻、化學(xué)性刺激和細(xì)菌感染等引起，其中膽管梗阻是引起急性膽囊炎最重要的因素，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，10%～15%的成年人會(huì)受膽結(jié)石的影響[6]。當(dāng)膽管發(fā)生梗阻時(shí)，局部的組織和黏膜將會(huì)出現(xiàn)缺血及水腫，且膽汁發(fā)生淤積和濃縮會(huì)引起一系列的炎癥反應(yīng)，使得膽囊黏膜上皮分泌更多的黏液，膽汁排除障礙，造成膽囊腔內(nèi)壓力升高，進(jìn)而加重膽囊壁的缺血和水腫，最終導(dǎo)致膽道平滑肌收縮能力減弱是急性膽囊炎發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要過(guò)程。膽總管結(jié)扎術(shù)可以構(gòu)造出急性膽囊炎動(dòng)物模型，本研究HE染色標(biāo)本中，光鏡下見正常組膽囊組織各層結(jié)構(gòu)基本完整，未見充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著炎癥發(fā)展，膽囊組織可見輕微充血、水腫及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有部分黏膜上皮脫落，與其他學(xué)者研究[7-8]結(jié)果一致。

圖4 急性膽囊炎不同部位Cajal間質(zhì)細(xì)胞分布Fig 4 The distribution of ICCs in different parts of acute cholecystitis

ICCs參與胃腸道自發(fā)的節(jié)律性電活動(dòng)，是胃腸道的起搏細(xì)胞；并且ICCs能夠介導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，與平滑肌細(xì)胞存在許多縫隙連接，是腸神經(jīng)調(diào)控平滑肌的媒介，因此ICCs對(duì)胃腸道的動(dòng)力性功能起著決定性的作用[9]。ICCs主要存在胃腸道的環(huán)形肌層與縱行肌層之間，與肌間神經(jīng)叢相鄰。目前研究也證實(shí)，在膽囊和肝外膽管的平滑肌層也同樣存在大量的ICCs，且其功能與胃腸道肌間ICCs類似，同樣在泌尿生殖系統(tǒng)中也有發(fā)現(xiàn)ICCs，自發(fā)的節(jié)律性電活動(dòng)也發(fā)生在此類組織中，因此認(rèn)為ICCs可能調(diào)控膽管系統(tǒng)的自發(fā)節(jié)律性電活動(dòng)和介導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞[10]。ICCs可被c-kit免疫反應(yīng)蛋白標(biāo)記，在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其在胃腸道中呈網(wǎng)絡(luò)狀分布，形狀呈星形或紡錘形，核大，為圓形及卵圓形，一般有兩個(gè)或多個(gè)突起，彼此相互連接及與平滑肌細(xì)胞縫隙連接形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[11]。但不同物種、不同器官及不同組織均有自己獨(dú)特的特征，可能與各自所處的微環(huán)境相關(guān)，包括神經(jīng)分布、物理因素、化學(xué)因素和與平滑肌細(xì)胞的空間位置關(guān)系等。值得注意的是，根據(jù)ICCs在膽道系統(tǒng)所處的位置，ICCs的外觀形態(tài)和數(shù)量將會(huì)發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICCs主要分布在膽囊平滑肌層，在正常組、BDL-24 h組及BDL-48 h組中，ICCs的密度和數(shù)量從膽囊底部到膽囊頸部是逐漸增加的，尤其是在膽囊頸部。有研究也顯示，ICCs分布在膽囊、膽囊管及肝總管的平滑肌層，隨著平滑肌層的增厚，ICCs的密度和數(shù)量逐漸增加；從膽總管的上部到膽總管的下部，ICCs的數(shù)量是逐漸增加的，尤其是在Oddi括約肌[10]。由此可見，膽囊、膽總管可能與ICCs協(xié)同控制膽汁的儲(chǔ)存與釋放。

大量臨床研究已經(jīng)證實(shí)ICCs具有調(diào)控胃腸道動(dòng)力的功能，且ICCs的數(shù)量減少與胃腸道動(dòng)力障礙密切相關(guān)，因此為胃腸道動(dòng)力相關(guān)性障礙疾病提供了全新的理論解釋。姚濤等[12]研究報(bào)道，在糖尿病胃輕癱患者中，ICCs在胃體及胃竇的分布稀疏，數(shù)量減少，ICCs數(shù)量的減少可能是糖尿病胃輕癱的重要發(fā)病機(jī)制。吳本升等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在慢傳輸型便秘的大鼠模型中，c-kit的陽(yáng)性表達(dá)水平明顯低于正常組，使用促動(dòng)力藥物治療組的c-kit陽(yáng)性表達(dá)水平有所升高，但仍低于正常組，說(shuō)明通過(guò)促進(jìn)ICCs的再生與修復(fù)，增加腸道動(dòng)力，從而實(shí)現(xiàn)通便的作用。Oddi括約肌功能障礙常常導(dǎo)致慢性膽道疼痛和復(fù)發(fā)性胰腺炎，但其致病機(jī)制尚未明確，其收縮功能認(rèn)為是受神經(jīng)、激素及局部因素控制。膽總管下端及壺腹部ICCs數(shù)量及密度的增加也被認(rèn)為是控制Oddi括約肌收縮功能的重要因素，且參與Oddi括約肌功能障礙疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。膽囊的收縮功能與膽總管密不可分，因此有理由認(rèn)為ICCs也參與膽囊的收縮功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在各組中，膽囊ICCs的數(shù)量從膽囊底到膽囊頸明顯逐漸增加，說(shuō)明ICCs可能直接參與膽囊收縮的生理過(guò)程。隨著膽囊炎癥程度的加重，膽囊ICCs的數(shù)量也逐漸減少，說(shuō)明膽囊ICCs是炎癥侵襲時(shí)最先受損細(xì)胞之一，與其他研究[14]發(fā)現(xiàn)相似。

綜上可見，急性膽囊炎的發(fā)病，將會(huì)引起膽囊ICCs的受損，導(dǎo)致膽囊ICCs的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生變化，使得膽囊平滑肌的收縮功能發(fā)生障礙。因此，我們有必要進(jìn)一步研究膽囊ICCs的分布和功能與急性膽囊炎及膽囊收縮功能障礙之間的關(guān)系。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

The distribution of the interstitial cells of Cajal in acute cholecystisis

QIU Hu, HUANG Zhenpeng, LUO Man, YU Baoping

1.Department of Gastroenterology, Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430000, China

Objective To study the distribution of the interstitial cells of Cajal (ICCs) in gallbladder in acute cholecystisis. Methods Thirty adult guinea pigs were randomly divided into 3 groups, including normal group, bile duct ligation for 24 hours group and bile duct ligation for 48 hours group. Guinea pigs within acute cholecystisis model were induced by common bile duct ligation. Gallbladder spicemen were collected from all groups. HE staining and immunofluorescence were used to observe the degree of gallbladder inflammation and the distribution of ICCs. Results Gallbladder spicemen with HE staining in each group, there was no obvious inflammation in normal group. Compared with normal group, bile duct ligation for 24 hours group were in mild inflammation, bile duct ligation for 48 hours group were in significant inflammation. The number of ICCs was decreased when inflammation gradually increased, the difference was statistically significant (P<0.001). The number of ICCs in each groups gallbladder tissue was increased from the bottom of gallbladder to the neck, but with the development of the change of inflammation, the number of ICCs were all reduced,the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion The number of ICCs in all parts of gallbladder in acute cholecystisis are decreased, which maybe one of the most important causes on the disorder of gallbladder dynamics.

Interstitial cells of Cajal; Gallbladder; Acute cholecystisis

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.023

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170351)

邱虎，碩士，研究方向：胃腸道動(dòng)力疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-maill:qiuhu1027@163.com

余保平，博士，教授，研究方向：胃腸道動(dòng)力疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-maill:yubp62@163.com

R575.6

A

1006-5709(2017)07-0805-04

2016-09-09