乳腺癌細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光原位雜交(FISH)法HER-2檢測對比研究

彭芳，王建，張功亮，鐘斌

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西贛州341000)

乳腺癌細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光原位雜交(FISH)法HER-2檢測對比研究

彭芳1，王建1，張功亮1，鐘斌2

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西贛州341000)

目的研究乳腺癌細(xì)針穿刺細(xì)胞蠟塊采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測HER-2蛋白，并用FISH方法檢測該方法的準(zhǔn)確性。方法對40例乳腺癌患者進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測，并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HER-2蛋白表達(dá)情況，并與術(shù)后腫塊切除或者粗針穿刺標(biāo)本FISH方法檢測HER-2基因狀態(tài)的結(jié)果進(jìn)行對比統(tǒng)計(jì)，以此探討乳腺癌免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2蛋白表達(dá)情況的意義。結(jié)果40例細(xì)胞塊HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：3+有3例，2+有2例，1+有4例，陰性31例。FISH檢測結(jié)果：HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)3+的3例，HER-2基因均有擴(kuò)增；HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)2+的2例，其中1例HER-2基因有擴(kuò)增；HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)1+的4例，HER-2基因無擴(kuò)增。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用用乳腺癌穿刺細(xì)胞塊用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2蛋白的表達(dá)情況，并和手術(shù)標(biāo)本做FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)進(jìn)行對比，證實(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性。

乳腺癌；細(xì)胞塊；免疫細(xì)胞化學(xué)；熒光原位雜交；HER-2

乳腺癌病人大約有25%左右有HER-2/neu基因的擴(kuò)增和/或過度表達(dá)[1]。乳腺癌細(xì)胞中HER-2/ neu基因的擴(kuò)增常預(yù)示著患者預(yù)后較差。應(yīng)用單克隆抗體赫賽汀治療HER-2/neu基因有擴(kuò)增乳腺癌患者，即乳腺癌靶向治療[1，2]，有比較肯定的療效。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是檢測乳腺癌患者的HER-2/neu基因狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。

本文探討用乳腺癌細(xì)針穿刺標(biāo)本制作細(xì)胞蠟塊的標(biāo)本，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測HER-2蛋白的可行性，并用FISH方法檢測該方法的準(zhǔn)確性。

我們對40例乳腺癌患者進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢測，并用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HER-2蛋白表達(dá)情況，并與術(shù)后腫塊切除或者粗針穿刺標(biāo)本FISH方法檢測HER-2基因狀態(tài)的結(jié)果進(jìn)行對比統(tǒng)計(jì)，以此探討乳腺癌免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2蛋白表達(dá)情況的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2013年1月至2015年1月，我院有手術(shù)病理學(xué)結(jié)果并在術(shù)前做細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查，并制作細(xì)胞塊的乳腺癌患者40例?；颊呔鶠榕?，年齡26~77歲，平均年齡44歲，左側(cè)病灶28例，右側(cè)病灶12例，腫物最大徑0.6cm~7cm。選擇的所有病例術(shù)前無化療、放療等治療病史。

1.2 制備細(xì)胞塊對乳腺腫塊的患者，穿刺前確定腫物位置、大小、硬度、活動(dòng)度和邊界，消毒，固定腫物，用10ml普通注射器穿刺，刺入腫物后，保持負(fù)壓，通過快速抽提對腫物進(jìn)行反復(fù)切割，同時(shí)借助針管內(nèi)的負(fù)壓將標(biāo)本吸入穿刺針內(nèi)，涂片2張，做瑞氏染色細(xì)胞學(xué)檢查。剩余標(biāo)本直接打在玻片上并聚攏，滴2次95%的酒精覆蓋組織自然風(fēng)干，然后將玻片和其上的組織直接放入10%的中性福爾馬林中固定，然后常規(guī)包埋、制片。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)方法免疫細(xì)胞化學(xué)試劑一抗采用福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)的HER-2。檢測系統(tǒng)也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細(xì)胞塊石蠟切片厚度3μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍(lán)，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 FISH檢測⑴檢測試劑盒：石蠟預(yù)處理Ⅱ試劑盒。其中主要含有的預(yù)處理溶液和蛋白酶緩沖液、PathVysion HER-2探針試劑盒購自Vysis公司。⑵標(biāo)本處理：石蠟切片于56℃烤片過夜。常規(guī)脫蠟，在預(yù)處理溶液中，80℃處理10min，再于蛋白酶溶液中消化15min，梯度乙醇脫水后，自然干燥。⑶FISH：取10μl探針混合液滴于經(jīng)過上述處理的組織標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，橡膠水泥封片。將標(biāo)本放在雜交儀中，73℃變性5min后，37℃雜交過夜。次日取出標(biāo)本，去掉橡膠水泥，在洗脫液(2×SSC/0．3% NP40)中，73℃洗滌2min，再于室溫下在洗脫液中洗滌5s，自然干燥。二脒基苯基吲哚(DAPI)對比染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 結(jié)果判定⑴HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)判斷的標(biāo)準(zhǔn)：定位準(zhǔn)確，定位于細(xì)胞膜，陰性：未觀察到染色或≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱或難以察覺的細(xì)胞膜染色。＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱或難以察覺的細(xì)胞膜染色為（1+）。＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不完整和(或)微弱／中度細(xì)胞膜染色或≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)陽性染色為（2+）。＞10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完整的細(xì)胞膜強(qiáng)染色為（3+）。⑵FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)細(xì)胞核內(nèi)紅色的HER-2基因熒光信號和17號染色體的綠色熒光信號的數(shù)目比值，即Ratio值(Ratio=30個(gè)細(xì)胞核中紅色信號總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠色信號的總數(shù))。Ratio值＜2為，且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞＜4時(shí)為陰性，提示無基因擴(kuò)增；Ratio值≥2或Ratio值＜2且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞＞6，時(shí)為HER-2基因擴(kuò)增；若Ratio值＜2且平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥4且＜6，則視為不確定，需要再計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞核中的信號或由另外一個(gè)分析者重新計(jì)數(shù)，或選取不同組織塊重新檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用Kappa值分析兩種檢測方法的一致性，所有檢驗(yàn)取雙側(cè)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

40例細(xì)胞塊HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：3+有3例，2+有2例，1+有4例，陰性31例。FISH檢測結(jié)果：HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)3+的3例，HER-2基因均有擴(kuò)增；HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)2+的2例，其中1例HER-2基因有擴(kuò)增；HER-2免疫細(xì)胞化學(xué)1+的4例，HER-2基因無擴(kuò)增。見圖1～3。

圖1 細(xì)胞塊HE染色×200

圖2 細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)HER-2×400

圖3 細(xì)胞塊HER-2基因擴(kuò)增（FISH法×1000）

3 討論

HER-2基因，是表皮生長因子受體(EGFR)家族成員之一，它位于染色體17q12-21．32，編碼1255個(gè)具有跨膜酪氨酸激酶活性的蛋白[1-5]，分子量約為185kD。HER-2陽性的乳腺癌患者預(yù)后不良，與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。用石蠟包埋的組織塊或細(xì)胞塊標(biāo)本，檢測基因HER-2基因拷貝數(shù)來評價(jià)它的DNA水平，是目前HER-2基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[6-9]。

我們用細(xì)針穿刺乳腺癌組織制備的細(xì)胞塊標(biāo)本，通常含有微小組織或顆粒，保留了部分組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并且細(xì)胞采集量多，分布適中。該技術(shù)最大特點(diǎn)是可以連續(xù)切片免疫細(xì)胞化學(xué)檢測和FISH檢測等[10-13]。而且利用細(xì)胞塊標(biāo)本進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色效果佳，本實(shí)驗(yàn)和術(shù)后腫塊切除或者粗針穿刺標(biāo)本FISH方法檢測HER-2基因狀態(tài)的結(jié)果進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2（3+）的3例病例FISH檢測HER-2結(jié)果均為陽性，HER-2（2+）2例，其中1例HER-2基因有擴(kuò)增，符合率為80%。而手術(shù)切除標(biāo)本免疫組織化學(xué)檢測HER-2(2+)和（3+）的病例與FISH檢測HER-2基因狀態(tài)陽性符合率為78.2%。可見應(yīng)用細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HER-2蛋白表達(dá)情況有較高的準(zhǔn)確性[10]。但是仍有部分HER-2蛋白檢測結(jié)果2+甚至3+的病例FISH檢測HER-2基因無擴(kuò)增，根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[8-14]可能是由于17號染色體為多體導(dǎo)致HER-2蛋白檢測假陽性的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該注意，穿刺細(xì)胞塊標(biāo)本應(yīng)注意經(jīng)過及時(shí)并且充分的10%福爾馬林固定，因?yàn)闃?biāo)本離體超過1h或者固定時(shí)間不充分會(huì)影響HER-2的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測和FISH檢測結(jié)果。

準(zhǔn)確的HER-2檢測結(jié)果可以較好的指導(dǎo)患者治療，并對預(yù)后進(jìn)行較好的評價(jià)，避免對HER-2陰性的患者不必要的治療造成不必要的傷害。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用用乳腺癌穿刺細(xì)胞塊用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2蛋白的表達(dá)情況，并和手術(shù)標(biāo)本做FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)進(jìn)行對比，證實(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HER-2結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性。

這樣對一些無法進(jìn)行手術(shù)切除或者粗針穿刺的病人來說可以根據(jù)細(xì)針穿刺的結(jié)果進(jìn)行靶向治療，可以免去病人腫塊局部切除或粗針穿刺的痛苦，減少出血和感染的風(fēng)險(xiǎn)，對乳腺癌病人的治療和預(yù)后評估有重要意義[13，14]。

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R446.8，R737.9

A

1674-1129(2017)04-0529-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.026

2016-09-26；

2017-03-13)

鐘斌