ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)性能評價(jià)

胥明勇，朱華強(qiáng)

(綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽621000)

ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)性能評價(jià)

胥明勇，朱華強(qiáng)

(綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽621000)

目的對ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能評價(jià)，確定該系統(tǒng)是否穩(wěn)定可靠。方法按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical Laboratory and Standards Institute，CLSI)系列文件，對ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)的精密度、正確度及線性指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)；根據(jù)HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品的陽性檢出率判斷該檢測系統(tǒng)的最低檢出限。結(jié)果ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)的批內(nèi)精密度（s批內(nèi)）分別為0.08和0.06；批間精密度（s批間）分別為0.06和0.12；正確度符合要求；線性分析通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；最低檢出限為1.00×102IU/ml。結(jié)論ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)的精密度、正確度、線性、最低檢出限性能評價(jià)均能滿足臨床檢測要求。

精密度；線性；性能評價(jià)；乙型肝炎病毒DNA

HBV-DNA定量檢測是乙肝抗病毒治療重要療效監(jiān)測指標(biāo)[1]，而測定結(jié)果會直接影響患者的治療方案[2]，因此儀器性能指標(biāo)只有符合要求時(shí)，才能將該儀器用于臨床樣本檢測[3]。依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)系列文件的內(nèi)容和方法，結(jié)合所使用HBV-DNA試劑盒產(chǎn)品性能要求，對我科新購的ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量測定HBV-DNA，對該檢測系統(tǒng)進(jìn)行性能評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料臨床標(biāo)本來源于我院住院患者。HBV DNA濃度為低值、高值的樣本各收集10例，標(biāo)本性狀要求無溶血、黃疸、脂血，經(jīng)檢測HBV DNA濃度分別為1.20×104IU/ml、4.20×107IU/ml，分裝在已滅菌的0.5ml EP管內(nèi)，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；HBV DNA濃度范圍為4.00×104～4.00×107IU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。

1.2 主要儀器和試劑ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國）；HBV-DNA熒光定量PCR檢測試劑盒（湖南圣湘）。

1.3 方法參照CLSI的EPl5-A2[4]、EP6-A[5]文件推薦的方法進(jìn)行以下項(xiàng)目的評價(jià)。

1.3.1 精密度評價(jià)對HBV DNA為2個(gè)濃度標(biāo)本，用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀每天分析一批，重復(fù)測定3次，連續(xù)測定5d。每天室內(nèi)質(zhì)控在控后，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)完成后計(jì)算批內(nèi)精密度、批間精密度，與CLIA’88推薦的允許總誤差作比較：⑴批內(nèi)精密度：標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于或等于室間質(zhì)評允許總誤差的1/4；⑵批間精密度：標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于或等于室間質(zhì)評允許總誤差的1/3，判斷其精密度是否可接受(本次實(shí)驗(yàn)采用了衛(wèi)生部臨檢中心制定的HBV-DNA定量室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)為靶值±0.4IU/ ml，數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換）。

1.3.2 正確度評價(jià)按照參考物質(zhì)評價(jià)準(zhǔn)確度方案，使用國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心發(fā)放的2016年全年室間質(zhì)評陽性樣本作為參考物質(zhì)(此次質(zhì)評成績已回報(bào)，并知質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn))，用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對5個(gè)陽性樣本每天分析一批，重復(fù)測定3次，連續(xù)測定5d，計(jì)算2個(gè)不同水平的質(zhì)評樣本均值，按照衛(wèi)生部臨檢中心制定的HBV DNA定量室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)為靶值±0.4IU/ml(數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換)的要求，判斷測定結(jié)果是否在允許的范圍內(nèi)。

1.3.3 線性范圍評價(jià)⑴用陰性血清將濃度5.00× 108IU/ml樣本梯度稀釋成7個(gè)樣本，濃度分別為5.00×108、5.00×107、5.00×106、5.00×105、5.00×104、5.00×103、5.00×102IU/ml。每種濃度的樣本重復(fù)測定4次，檢查重復(fù)測定數(shù)據(jù)有無離群值，以及不精密度是否符合要求。對7個(gè)稀釋系列樣本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析處理，分別對二階（b2）回歸系數(shù)及三階（b2，b3）回歸系數(shù)作t檢驗(yàn)，P＞0.05，表明三個(gè)回歸系數(shù)都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判斷為一級線性，則該檢測系統(tǒng)的線性范圍驗(yàn)證通過。⑵將7個(gè)濃度梯度樣品設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品（按科學(xué)計(jì)數(shù)法設(shè)置理論濃度值），進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性分析，得出線性回歸y=a+bx，通過的標(biāo)準(zhǔn)為：相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，a在43~46內(nèi)，b在-3.2~-3.6內(nèi)。

1.3.4 最低定量檢出限評價(jià)將HBV-DNA濃度為4.00×104IU/m的標(biāo)準(zhǔn)品作為基礎(chǔ)樣本，用陰性血清進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后的樣本濃度分別為4.00× 103、4.00×102、1.00×102、4.00×101IU/ml，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別在ABI7500熒光定量PCR儀上檢測20次，計(jì)算各濃度CV%，以陽性檢出率為100%的最低濃度為判斷標(biāo)準(zhǔn)（陽性標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn)為有明顯S型擴(kuò)增曲線且Ct＜38，內(nèi)標(biāo)檢測為陽性且Ct＜40）。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對多項(xiàng)式回歸分析給出的二階和三階方程的回歸系數(shù)作t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 ABI7500測定HBV DNA精密度結(jié)果

表2 ABI7500測定HBV DNA正確度結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 精密度評價(jià)結(jié)果2個(gè)濃度標(biāo)本的批內(nèi)精密度的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.1(即1/4室間質(zhì)評允許總誤差)，批間精密度的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.13(即1/3室間質(zhì)評允許總誤差)，精密度評價(jià)通過。見表1。

2.2 正確度評價(jià)結(jié)果檢測2016年全年室間質(zhì)評陽性樣本，測定均值的對數(shù)值均在評價(jià)允許范圍內(nèi)，正確度評價(jià)通過。見表2。

2.3 線性范圍評價(jià)結(jié)果

2.3.1 HBV-DNA的二階回歸系數(shù)b2為-0.010，三階回歸系數(shù)b2為0.000，三階回歸系數(shù)b3為-0.001，對回歸系數(shù)作t檢驗(yàn)，P＞0.05，三個(gè)回歸系數(shù)都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判斷為一級線性，則該儀器線性分析驗(yàn)證通過。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性分析得出線性回歸y=-3.204x+43.049，R2=0.999，各項(xiàng)指標(biāo)均通過，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性圖如圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性圖

2.3.3 線性范圍為500-5.00×108IU/ml驗(yàn)證通過。

2.4 最低定量檢出限評價(jià)結(jié)果HBV-DNA濃度大于或等于1.00×102IU/ml的稀釋樣本檢出率為100%，其CV%均小于5%，在試劑廠家所要求的范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.00×101IU/ml的陽性檢出率為42%，判斷該檢測系統(tǒng)最低檢出限為1.00×102IU/ ml。

3 討論

檢測系統(tǒng)的分析性能能夠滿足臨床要求是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和“檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)”的根本保證[6]，也是臨床實(shí)驗(yàn)室全面質(zhì)量控制所需。對于新購進(jìn)的儀器及其檢測系統(tǒng)，在正式用于檢測患者標(biāo)本，發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告前，要求實(shí)驗(yàn)室對系統(tǒng)的各項(xiàng)分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。CNAS-CL36要求在分子診斷領(lǐng)域性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括正確度、精密度、線性、最低檢出限等內(nèi)容，但目前沒有具體的評價(jià)方法，因此，在分子生物實(shí)驗(yàn)室，檢驗(yàn)系統(tǒng)性能的評價(jià)主要參考CLSI的系列標(biāo)準(zhǔn)文件。

目前國內(nèi)普遍使用精密度評價(jià)方案基本是EP5-A2、EP15-A2[7]，EP5-A2適用于制造商對儀器性能的建立、確認(rèn)及核實(shí)，而EP15-A2是專門針對用戶評價(jià)檢測系統(tǒng)而制定的，該方案因?yàn)樵u價(jià)時(shí)間較長，從而才能真實(shí)地反映儀器工作性能狀態(tài)[8]因此精密度評價(jià)參照了EP15-A2文件。2個(gè)濃度水平樣本的標(biāo)準(zhǔn)差均在CLIA’88推薦的允許總誤差內(nèi)，2個(gè)濃度水平樣本的CV值均在試劑廠家所要求的范圍內(nèi)，精密度評價(jià)通過。但通過結(jié)果分析，2個(gè)濃度水平樣本的批內(nèi)精密度基本一致，而批間精密度相差一倍，這種差異可能與實(shí)驗(yàn)方法學(xué)敏感性高有關(guān)。在重復(fù)性良好的情況下才能進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)[9]，因此要求精密度評價(jià)通過了，才能進(jìn)行其它分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。

EP15-A2文件給出了正確度兩種驗(yàn)證方案。其一方案是用新方法與比對方法同時(shí)檢測患者標(biāo)本，其二種是使用參考物質(zhì)，可以是國際或國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、室間質(zhì)評物質(zhì)等。本次評價(jià)試驗(yàn)采用的是國家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心發(fā)放的室間質(zhì)評物作為參考物質(zhì)評價(jià)方案，此次評價(jià)的檢測均值均在允許范圍內(nèi)。此次評價(jià)的陽性樣本只有低、中值2個(gè)濃度樣本，沒有涉及高值濃度樣本，這是在正確度評價(jià)方面的不足。線性評價(jià)采用了EP6-A文件，該評價(jià)方案對于臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員更適用[10]。EP6-A法基于多項(xiàng)式回歸理論，是目前判斷線性的最佳方法[11]。在線性范圍評價(jià)中，加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線線性分析，其反映了樣品的CT值（臨界循環(huán)數(shù)）與樣品濃度的理論值也符合線性關(guān)系，這種線性驗(yàn)證針對具體檢驗(yàn)方法，在實(shí)際工作中是可行的。制造商提供定量線性范圍為500~5.00×109IU/ml，本次實(shí)驗(yàn)暫無最高濃度為5.00×109IU/ml的樣本，待能收集到此濃度的樣本再進(jìn)行線性驗(yàn)證。最低檢出限是選擇一低值樣本稀釋至試劑說明書給出的檢出限接近的濃度[12]，以陽性檢出率為100%的最低HBV-DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度，且CV%均小于5%，才能判斷該檢測系統(tǒng)最低檢出限為1.00×102IU/ml。ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)與方莉等[13]提到的Roche 480檢測系統(tǒng)相比，其最低檢出限有所提高，表明該系統(tǒng)提高了臨床樣本的陽性檢出率。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，ABI7500 HBV-DNA檢測系統(tǒng)的精密度、正確度、線性、最低檢出限符合要求，能夠用于臨床樣本檢測。

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Performance Evaluation of ABI7500 HBV-DNA Detecting System

XU Mingyong，ZHU Huaqiang.Clinical Laboratory，Mianyang Central Hospital，Mianyang Sichuan 621000，China.

Objective To evaluate the performance of ABI7500 HBV-DNA detecting system confirmed its stability and reliability.Methods According to the evaluation protocols of Clinical Laboratory and Standards Institute(CLSI)，the performance of the ABI7500 HBV-DNA detecting system was assessed by the parameters of precision，accuracy and linearity；the minimum detection limit validation experiments were performed by detecting the positive rate of HBV-DNA standard substance.Results The standard deviation within-run precision of this detecting system was 0.08 and 0.06 respectively，and the between-run precision was 0.06 and 0.12，respectively.Its accuracy was within acceptable range，and linear analysis was tested by experiment.The minimum detection limit was 1.00×102IU/ml.ConclusionPerformance of the precision，trueness，linearity and minimum detection limit of ABI7500 HBV-DNA detecting system meets the requirement of clinical detection.

∶Precision；Linearity；Performance evaluation；HBV-DNA

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)04-0489-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.011

2016-11-22；

2017-05-01)

胥明勇，男，1972年生，主管技師，主要從事臨床分子生物學(xué)，Tel：0816-2247036，E-mail：xmy1972@126.com。