松葉牡丹離體快速繁殖及瓶苗微型化培育技術(shù)研究①

黃志明 沈仕泰

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建莆田351100)

松葉牡丹離體快速繁殖及瓶苗微型化培育技術(shù)研究①

黃志明 沈仕泰

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建莆田351100)

應(yīng)用植物離體快繁技術(shù)對松葉牡丹瓶苗微型化培育技術(shù)的研究，結(jié)果表明：松葉牡丹的種子用0.1%的氯化汞滅菌5 min效果最理想，成活率達(dá)到73.3%；最佳的增殖培養(yǎng)基配方：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂9 g·L-1；對松葉牡丹的壯苗情況來看，PP333的最佳質(zhì)量濃度為 0．5 mg·L-1，芽苗在的培養(yǎng)基為MS+NAA 0.25 mg·L-1+ PP3330.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂9 g·L-1， 植株矮壯,莖粗,葉片厚,莖葉紅,根系發(fā)，有利瓶苗的花芽分化.

松葉牡丹,培養(yǎng)基,快繁,矮化,微型化

松葉牡丹(Lampranthustenuifolius;)，又名半支蓮，太陽花，馬齒莧科.一年生肉質(zhì) 草本，花頂生，直徑2.5-5.5 cm，基部有葉狀苞片，花瓣單瓣或重瓣，有白、粉、黃、橙、桃紅、紫紅等顏色或具斑紋的復(fù)色等品種不僅花色豐富、色彩鮮艷，景觀效果極其優(yōu)秀[1].

用離體快速繁殖技術(shù)，周期短, 繁殖快, 節(jié)省空間，顯著縮短新品種由選育到推廣所需的時(shí)間[2].通過離體快速繁殖培養(yǎng), 由一塊很小的, 甚至是極微的植物組織, 在一年之內(nèi)可以產(chǎn)生百萬以上植株, 如此高的繁殖速度是任何傳統(tǒng)的無性繁殖方法所不能達(dá)到的[3].本試驗(yàn)在不改變松葉牡丹遺傳變異的基礎(chǔ)上，對松葉牡丹離體快速繁殖及瓶苗微型化培育技術(shù)進(jìn)行研究.為建立穩(wěn)定的快速繁殖花卉體系，提供良好的試驗(yàn)平臺(tái)， 并為該花卉資源的開發(fā)利用提供技術(shù)支持和理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)松葉牡丹種子由北京市芳萱苑種子有限公司提供.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同滅菌時(shí)間對松葉牡丹外植體萌發(fā)的影響.(1)取松葉牡丹種子，置于自來水中沖洗約二十分鐘.(2)用酒精消毒0.5 min，再分別用1 .2 g·L-1的升汞滅菌3、4、5、6、7 min.(3)滅菌后均用無菌水沖洗5次.(4)在無菌室超凈工作.

將種子接在事先滅菌好的MS培養(yǎng)基，每個(gè)滅菌時(shí)間段的種子接種3瓶，每瓶接10個(gè).15 d后觀察種子的萌發(fā)情況與染菌情況并做分析.

1.2.2 不同濃度的6-BA和IBA配比對松葉牡丹增殖的影響.種子發(fā)芽至3.0 cm左右的時(shí)候，取其頂芽2.0 cm的無菌莖段在MS+6-BA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)+IBA(0.05、0.10、0.15 mg·L-1)增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后記錄其增殖情況.

1.2.3 不同濃度的PP333對松葉牡丹生根、矮化、和壯苗的作用.將增殖后生長較為健壯無菌芽段切下來，分別接種到MS+PP333(0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg·L-1)+ NAA0.25 mg.L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂9 g·L-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d之后，記錄生根率及苗的生長狀況.

1.2.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件.試驗(yàn)均用MS為基本培養(yǎng)基，MS中使用的蔗糖濃度為30 g·L-1，瓊脂濃度為9 g·L-1，光照強(qiáng)度為2 000 lx ,光照周期為13 h·d-1, 培養(yǎng)室溫度為(26±1) ℃.

2 結(jié)果與分析

表1 消毒滅菌時(shí)間對松葉牡丹種子萌發(fā)效果的影響

滅菌時(shí)間/min平均死亡率/%平均污染率/%平均萌發(fā)率/%3328.366.74527.070.05818.773.361538.346.772456.020.0

2.1 不同滅菌時(shí)間對松葉牡丹種子萌發(fā)的影響

設(shè)計(jì)6種不同的消毒時(shí)間，對松葉牡丹種子進(jìn)行滅菌和萌芽效果研究(表1) .結(jié)果表明: 滅菌時(shí)間越短，污染率越高; 隨著滅菌時(shí)間的延長，種子污染率降低，但在5 min以后萌發(fā)率也開始降低.結(jié)果表明種子最佳滅菌時(shí)間為5 min，萌發(fā)率達(dá)到73.3%.

2.2 不同濃度的6-BA和IBA對松葉牡丹瓶苗增殖的影響

將松葉牡丹無菌苗切成帶頂芽的長度在 1．0 cm 左右的莖段， 接種在添加不同質(zhì)量濃度6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)(表2) .

表2 6-BA和IBA對松葉牡丹增殖的影響

注：培養(yǎng)基：MS；蔗糖：30 g·L-1；瓊脂：9 g·L-1.

圖1 萌發(fā)增殖瓶苗

試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明:不同濃度的6-BA和IBA對松葉牡丹芽的增殖系數(shù)影響顯著，由極差R的大小可以得出兩種激素的主次因素：6-BA>IBA.影響松葉牡丹增殖最主要的因素是6-BA，其次IBA.松葉牡丹增殖培養(yǎng)基最佳組合的方案：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂9 g·L-1.(圖1).

2.3 植物生長抑制劑PP333對松葉牡丹壯苗和生根的影響

在繼代增殖3次后，再用MS培養(yǎng)基附加不同濃度的PP333進(jìn)行壯苗培養(yǎng)30 d后觀察植株生長情況并測量株高.各處理組合接種30個(gè)外植體，2 次重復(fù).結(jié)果見表3.

表3 PP333 濃度對松葉牡丹壯苗的影響

注：培養(yǎng)基：MS；NAA：0.25 mg·L-1；蔗糖：30 g·L-1；瓊脂：9 g·L-1.

試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明， 較低濃度的 PP333對植株的生長影響不大，植株細(xì)長，莖桿纖細(xì)， 不利于茶花鳳仙瓶苗壯苗和生根; 較高質(zhì)量濃度的PP333抑制植株生長， 植株矮，生長緩慢.在添加PP3330.5 mg·L-1培養(yǎng)基上生長的植株矮壯，莖粗，葉片厚，莖葉紅，根系發(fā)達(dá),生長速度適中， 這種植株適合于瓶苗的花芽分化,如圖2，圖3.

圖2 含0.3濃度的 PP333培養(yǎng)瓶苗圖 圖3 含0.5濃度的 PP333培養(yǎng)瓶苗圖

3 結(jié)論與討論

松葉牡丹作為優(yōu)良的園林觀賞花卉，而能作為室內(nèi)外盆栽觀花、觀葉植物，市場需求量很大.對松葉牡丹開展離體成花培養(yǎng)技術(shù)研究，對指導(dǎo)松葉牡丹生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義.以松葉牡丹種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)， 通過組織培養(yǎng)的方法快速繁殖，不僅減少了病毒重新感染的機(jī)會(huì)，而且通過外植體接種培養(yǎng)， 進(jìn)一步降低了基礎(chǔ)苗中病毒的含量，使快繁得到的脫毒，種苗更健壯，以提高生長后應(yīng)用價(jià)值[4].

(1)選用飽滿健康的松葉牡丹種子為試驗(yàn)材料是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵.外植體消毒處理時(shí)間不夠、不徹底或接種培養(yǎng)時(shí)操作失誤等都會(huì)使污染機(jī)會(huì)增加，所以要嚴(yán)格無菌操作, 仍需探索減少污染的方法[5].對試驗(yàn)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí)， 既要考慮植物材料的耐受能力， 也要考慮藥劑的消毒效果， 不同材料類別、不同藥劑種類，甚至不同器官都應(yīng)區(qū)別對待[6].試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的種子萌發(fā)消毒方案為1.2g·L-1的升汞滅菌時(shí)間為5 min，萌發(fā)率達(dá)到73.3%.

(2)國內(nèi)外大量研究結(jié)果表明，在植物離體快繁技術(shù)培養(yǎng)中，生長激素主要被用于細(xì)胞的分裂和根的伸長分化，而細(xì)胞分裂素的主要作用則是促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成及離體成花調(diào)控，生長激素與一定量的細(xì)胞分裂素配合常用于不定芽的誘導(dǎo)[7].增殖培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素6-BA有著促進(jìn)細(xì)胞分化和促進(jìn)腋芽生長等作用，生長素IBA則是促進(jìn)細(xì)胞的分裂[8,9]. 植物處于生長發(fā)育的各個(gè)階段都會(huì)受到激素的調(diào)節(jié)與控制,正確的比例是芽分化生長增殖的關(guān)鍵[10].其中培養(yǎng)基中激素種類和濃度是主要影響因素，濃度過高過低都會(huì)影響分化、增殖和最終成活率[11].達(dá)克東等研究， 在確定繼代培養(yǎng)配方和生根培養(yǎng)配方的試驗(yàn)時(shí)，可以看出，激素濃度過低，對于莖段誘導(dǎo)能力較弱，芽萌發(fā)速度慢，叢生芽增殖數(shù)受到了限制，根的長勢較弱，根量少；激素濃度過高，也會(huì)抑制叢生芽的生長，從而降低了叢生芽的增殖數(shù)， 雖然刺激了根的加粗，但是根量較少[12].激素條件對紅掌腋芽初代培養(yǎng)的影響 激素條件不僅影響著紅掌腋芽分化能力，同時(shí)還決定著不定芽分化的途徑. 在適宜的培養(yǎng)基條件下，紅掌腋芽能通過直接器官發(fā)生途徑直接產(chǎn)生不定芽，試驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素 6-BA 1.0 mg/L、生長素 IBA 0.1 mg/L，此種培養(yǎng)基能很好地誘導(dǎo)腋芽分化[13].以MS為基本培養(yǎng)基， 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究不同濃度的的細(xì)胞分裂素和生長素及組合對芽增殖的影響[14].從表2試驗(yàn)結(jié)果表明:松葉牡丹增殖培養(yǎng)基最佳組合的方案：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂9 g·L-1(圖1). 這也與王越和劉燕在大旗瓣鳳仙花上的研究中也得到相同的結(jié)論[15].

(3)多效唑(PP333) 作為植物生長延緩劑，在植物體內(nèi)抑制內(nèi)源激素 GA 的生物合成，對提高植物抗逆性、促進(jìn)壯苗生根都有重要作用，并已廣泛應(yīng)用于大田和觀賞植物[16].PP333是一種高效且低毒的植物激素，PP333處理能有效控制植株高度，使莖更短，葉片面積縮小并且增厚，使葉片變得更豐厚，提高根系活力[16].陳炫等研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施多效唑和乙烯利混合劑，能有效抑制妃子笑荔枝抽生冬梢， 促進(jìn)花芽分化，提高成花率;還能提高荔枝樹內(nèi)源 ABA、 ZR、 ABA /IAA、 ABA /GA3、 Z R /IAA、 ZR /GA3 值， 降低IAA和GA3含量， 提高可溶性糖、 淀粉、 全氮含量，增加 C /N 比值，從而提高成花率[17].

近年來人們開始將 PP333應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，用于矮化植株，使葉形指數(shù)變小[18].植物生長抑制劑PP333對松葉牡丹壯苗和生根的試驗(yàn)結(jié)果表明:添加質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的PP333，培養(yǎng)植株矮壯,莖粗,葉片厚,莖葉紅,根系發(fā)達(dá)，有利瓶苗的花芽分化.試驗(yàn)結(jié)果表明:松葉牡丹壯苗最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 0.25 mg·L-1+PP3330.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂9 g·L-1.

本試驗(yàn)對松葉牡丹離體快速繁殖及瓶苗微型化培育技術(shù)研究，對促進(jìn)微型化花卉工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù).對營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

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Techniques Onin-vitro Rapid Propagation and Miniaturization cultivation of Bottle Seedling forLampranthustenuifolius

HUANG Zhim-ing SHEN Shi-tai

(Faulty of Environment and Biological Engineering，Putian University，Putian 351100, China)

Techniques about in-vitro rapid propagation for miniaturization breeding ofLampranthustenuifoliuswere presented. Results show that the way that utilizes 0.1% mercuric chloride liquid to sterilize seeds ofLampranthustenuifoliusfor 5 minutes is the best, and the survival rate of these seeds can reach 73.3%. Optimum culture medium for proliferation includes MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1, sucrose 30 g·L-1and agar 9 g·L-1. Additionally, growth of strong seedling illustrates that the best mass concentration of PP333is 0.5 mg·L-1. Culture medium for bud seedling contains MS +NAA 0.25 mg·L-1, PP3330.5 mg·L-1，sucrose 30 g·L-1and agar 9 g·L-1. These plants are short but strong, and they have well developed root system, thick and red stems as well asleaves. It is beneficial to the in-vitro flower bud differentiation.

Lampranthustenuifolius, culture medium, rapid propagation, dwarf, miniaturization

2017-03-10

福建省教育廳科技項(xiàng)目(JB12177)資助

黃志明，E-mai:blackjacket@126.com.

S681.1

A

1672-6634(2017)02-0056-04