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    腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002的合成與初步生物學(xué)評(píng)價(jià)

    2017-08-16 09:30:25閆賦琴周衛(wèi)華孫小萌劉曉軍
    同位素 2017年3期
    關(guān)鍵詞:顯像劑紋狀體腺苷

    閆賦琴,周衛(wèi)華,孫小萌,劉曉軍

    (中國(guó)武警總醫(yī)院,北京 100039 )

    腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002的合成與初步生物學(xué)評(píng)價(jià)

    閆賦琴,周衛(wèi)華,孫小萌,劉曉軍

    (中國(guó)武警總醫(yī)院,北京 100039 )

    腺苷A2A受體與中樞神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān),正電子核素標(biāo)記的腺苷A2A受體顯像劑可用于帕金森病(PD)的診斷與療效評(píng)價(jià)。本研究采用碳-11標(biāo)記[(E)-1,3-二乙基-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3,7-雙氫-1H-嘌呤-2,6-二酮](KW6002)制備11C-KW6002,并進(jìn)行正常鼠與PD模型鼠microPET顯像。結(jié)果顯示,以去甲基KW6002為標(biāo)記前體,在NaOH條件下與三氟甲基磺酰基碳-11甲烷(11CH3-Trifcate)反應(yīng),標(biāo)記率達(dá)56%(衰變校正,n=3)。經(jīng)制備HPLC分離和固相萃取,產(chǎn)品放化純度>99.5%,比活度為1.5×1014Bq/g。11C-KW6002的microPET顯像結(jié)果顯示,正常大鼠雙側(cè)紋狀體呈對(duì)稱顯像,PD模型鼠中毀損側(cè)紋狀體放射性較對(duì)側(cè)明顯增加,而同一模型的11C-CFT顯像為毀損側(cè)紋狀體放射性缺失。表明11C-KW6002為具有臨床應(yīng)用的潛在腺苷A2A受體顯像劑。

    腺苷A2A受體;11C-KW6002;合成;microPET;顯像劑

    帕金森病(PD)是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失,導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路功能異常的一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前,PD的藥物治療只能緩解癥狀,不能從根本上減輕多巴胺能神經(jīng)元的惡化。腺苷A2A受體拮抗劑可以阻斷紋狀體內(nèi)A2A的高表達(dá),同時(shí)能抑制單胺氧化酶,達(dá)到治療PD的效果,為治療PD的新型靶點(diǎn)和藥物[1]。腺苷A2A靶點(diǎn)PD的診斷與療效監(jiān)測(cè),如123I-MNI-420,18F-MRS5425 和18F-MNI-444等,均顯示了良好的效果[2-4]。Kyowa Hakko Kirin公司已將腺苷A2A的拮抗劑伊曲茶堿([(E)-1,3-二乙基-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯)-7-甲基-3,7-雙氫-1H-嘌呤-2,6-二酮],KW6002)進(jìn)行臨床三期試驗(yàn)以證實(shí)治療PD的效果。KW6002與腺苷A2A高特異性結(jié)合(抑制常數(shù)Ki=12 nmol/L),而與多巴受體亞型、去甲腎上腺素受體、5-HT受體及乙酰膽堿(acetylcholine, ACH)受體幾乎沒有親和力,正電子核素標(biāo)記的KW6002可用于PD的診斷與療效監(jiān)測(cè)[5]。本研究擬采用碳-11標(biāo)記KW6002制備11C-KW6002,考察11C-KW6002在正常鼠及PD模型鼠上的生物分布及顯像,評(píng)價(jià)11C-KW6002作為腺苷A2A受體顯像劑的潛在價(jià)值。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 主要儀器

    HM-20 回旋加速器:日本住友重機(jī)械株式會(huì)社;PET-CM-3H-IT-Ⅰ型碳-11多功能合成模塊:配備液相碘代甲烷合成儀、Triflate在線轉(zhuǎn)換、半制備HPLC系統(tǒng)(配紫外和放射檢測(cè)器),派特(北京)科技有限公司;分析型HPLC儀、Waters2487紫外檢測(cè)器和BioScan Flowcount放射檢測(cè)器:美國(guó)BioScan公司;eXPlore

    Vista 小動(dòng)物PET/CT成像系統(tǒng):美國(guó)GE公司;Sep-Pak C-18柱:美國(guó)Waters公司。

    1.2 主要試劑

    1 mol/L氫化鋁鋰/四氫呋喃溶液、丙酮:美國(guó)Aldrich公司;57%氫碘酸:百靈威J&K公司;去甲基KW6002和KW6002標(biāo)準(zhǔn)品:美國(guó)NIH的郎立新博士惠贈(zèng);氫氧化鈉(AR):北京試劑廠。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    正常Sprqgue-Dawley大鼠10只,均為雄性,體重180~200 g;PD模型鼠3只,雄性,體重210~230 g。SCXK(京)2016-0011,北京維通華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.111C-CH3I合成與在線轉(zhuǎn)換[6]

    HM-20回旋加速器質(zhì)子轟擊含0.5%氧氣的氮靶,經(jīng)14N(p,α)11C核反應(yīng)在靶內(nèi)生成11CO2,將11CO2轉(zhuǎn)輸至PET-CM-3H-IT碳-11多功能合成模塊,通過(guò)模塊上的不銹鋼LOOP環(huán)(浸于液氮)捕獲。捕獲完畢,移走液氮,空氣加熱LOOP環(huán),環(huán)中11CO2釋放到0.3 mL 1 mol/L的氫化鋁鋰/四氫呋喃溶液反應(yīng)管中。通入氮?dú)獠⒓訜岱磻?yīng)管,除四氫呋喃至干。冷卻后加入0.25 mL 57%氫碘酸。加熱反應(yīng)管并通入氮?dú)?,生成?1CH3I被氮?dú)廨d出。11CH3I流經(jīng)加熱至200 ℃的Triflate-Ag粉/石墨柱,轉(zhuǎn)化為11CH3-Triflate。

    2.211C-KW6002的合成與純化

    11C-KW6002合成路線示于圖1。稱取0.5 mg去甲基KW6002溶解于0.2 mL丙酮中,加入5 μL 2mol/L NaOH溶液[7],冷卻條件下通入11CH3-Triflate,待反應(yīng)管的放射性讀數(shù)達(dá)到最大并開始下降時(shí),停止通入氣體。密封反應(yīng)管,加熱至80 ℃,反應(yīng)2 min。

    圖1 11C-KW6002合成線路圖Fig.1 The scheme of synthesis of 11C-KW6002

    產(chǎn)物經(jīng)半制備HPLC分離,分離柱為Alltech C-18(250 mm×10 mm),流動(dòng)相V(乙腈)∶V(0.1 mol/L甲酸銨水溶液)∶V(乙酸)=35∶64.5∶0.5,流速6 mL/min,收集8~10 min的含放射性峰流動(dòng)相。將收集的溶液用水稀釋,經(jīng)固相萃取柱(Sep Pak C-18)萃取后,用1 mL乙醇洗脫產(chǎn)品。

    2.3 標(biāo)記條件

    分別采用丙酮、乙腈和DMSO為溶劑,以及不同的堿NaOH、Na2CO3調(diào)節(jié)pH,研究不同溶劑以及不同的堿對(duì)11C-KW6002標(biāo)記率的影響。

    2.4 質(zhì)量控制

    采用HPLC測(cè)量放化純度和比活度。Waters的HPLC,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,分析色譜柱為ODS柱(Gemini C-18 5 μ 4.6 mm×150 mm),流動(dòng)與半制備HPLC相同,流速1 mL/min,分別對(duì)制備樣品進(jìn)樣、KW6002標(biāo)準(zhǔn)品單獨(dú)進(jìn)樣和樣品與標(biāo)準(zhǔn)品混和物進(jìn)樣,測(cè)量樣品的相對(duì)保留時(shí)間及色譜峰面積,計(jì)算放化純度與比活度。

    2.5 動(dòng)物模型

    按文獻(xiàn)方法制備帕金森病模型[8],選用健康成年Sprqgue-Dawley大鼠,在麻醉狀態(tài)下,利用大鼠腦立體定位儀將10 μL 2 g/L的6羥多巴(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)注射到中腦腹側(cè)背蓋區(qū)和黑質(zhì)致密部,術(shù)后2周采用腹腔注射阿撲嗎啡加旋轉(zhuǎn)的方式評(píng)估模型,連續(xù)測(cè)量4周,向健側(cè)旋轉(zhuǎn)大于7 圈/min即為模型成功。

    2.6 microPET/CT顯像

    取正常大鼠和PD模型鼠各3只,尾靜脈注射11C-KW6002(74 MBq),注射后20 min將其置于microPET/CT掃描床上,持續(xù)用異氟烷氣體麻醉,行常規(guī)microPET/CT掃描。為了驗(yàn)證和對(duì)比,選同一只模型鼠,間隔1 d注射多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯像劑11C-CFT,注射后40 min行microPET/CT掃描。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 產(chǎn)品鑒別

    去甲基KW6002有三個(gè)叔胺,但受雙鍵影響,這三個(gè)氮基本沒有活性,苯酚在堿性條件下成為酚氧基離子,作為親核試劑進(jìn)攻11CH3-Triflate,Triflate離去,發(fā)生SN親核反應(yīng)。

    收集主產(chǎn)品放射性峰,并經(jīng)固相萃取,在分析型HPLC上僅一個(gè)放射性峰(圖2b,保留時(shí)間tR=6.65 min),該峰與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰(圖2a)在保留時(shí)間上一致(加上兩個(gè)檢測(cè)器之間的死體積)。同時(shí),如果采用該流動(dòng)相和分析柱,單獨(dú)進(jìn)放射性原料11CH3-Triflate時(shí),僅有一個(gè)放射性峰(tR=2.5 min),說(shuō)明tR=6.65 min為前體甲基化產(chǎn)品11C-KW6002。產(chǎn)品的放化純度>99.5%,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算,比活度為1.5×1014Bq/g。

    a——標(biāo)準(zhǔn)品的紫外圖譜;b——11C-KW6002放射性圖譜圖2 HPLC圖譜a——UV HPLC chromatogram of 12C-KW6002;b——Radioactivity HPLC chromatogram of 11C-KW6002Fig.2 HPLC chromatogram

    3.211C-KW6002標(biāo)記條件

    采用丙酮、乙腈和DMSO為溶劑時(shí)標(biāo)記效率(衰變校正,n=3)分別為56%、42%、48%,丙酮的標(biāo)記效率最高;采用10 μmol/L的NaOH和10 μmol/L的Na2CO3時(shí)標(biāo)記效率(衰變校正,n=3)分別為56%、12%,Na2CO3的標(biāo)記效率低于NaOH,可能是酚的酸性較弱,需要強(qiáng)堿才能生成酚氧根負(fù)離子,以便進(jìn)行親核反應(yīng)。

    將0.5 mg去甲基KW6002,用0.2 mL丙酮溶解,并加入5 μL 2 mol/L NaOH溶液,標(biāo)記效率可達(dá)到56%(衰變校正,n=3)。與多巴胺D2受體顯像劑11C-Racloprdie比較,11C-KW6002的標(biāo)記主產(chǎn)品更容易分離,且標(biāo)記率高于11C-Racloprdie[9]。

    3.3 正常大鼠microPET/CT顯像

    正常大鼠注射11C-KW6002后行microPET/CT腦顯像,顯像結(jié)果示于圖3。由圖3結(jié)果可見,大鼠淚腺、唾液腺等腺體顯像清晰且有放射性濃聚,橫斷面、冠狀面大鼠紋狀體顯像對(duì)稱分布,左右雙側(cè)放射性濃聚程度一致。

    3.4 PD模型大鼠microPET/CT顯像

    相同條件下,PD模型大鼠腦的橫斷面、冠狀面大鼠紋狀體顯像呈不對(duì)稱分布,右側(cè)(6-OHDA毀損側(cè))放射性濃聚程度高于左側(cè)(圖4a),經(jīng)SUV計(jì)算,右側(cè)/左側(cè)紋狀體放射性攝取比為2.4。為了驗(yàn)證該模型,對(duì)同一模型鼠間隔1 d,采用多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白11C-CFT顯像(圖4b),左右顯像不對(duì)稱,其中右側(cè)幾乎缺失,僅見左側(cè)紋狀體顯像,表明該模型成功[7]。同時(shí)證明PD模型鼠上毀損側(cè)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受體明顯下降,而腺苷A2A受體上調(diào)。

    圖3 正常大鼠11C-KW6002 microPET/CT顯像Fig.3 The microPET/CT imaging of 11C-KW6002 in normal rat

    a——11C-KW6002;b——11C-CFT圖4 PD模型鼠腦microPET/CT顯像a——11C-KW6002;b——11C-CFTFig.4 The microPET/CT imaging in the same one PD module rat

    4 小結(jié)

    強(qiáng)堿性條件下,11CH3-Triflat與去甲基KW6002在丙酮溶液中反應(yīng),得到11C-KW6002 標(biāo)記率為56%(衰變校正,n=3),經(jīng)半制備HPLC純化及固相萃取,產(chǎn)品的放化純度大于99.5%。經(jīng)正常鼠及PD模型鼠microPET顯像,腺苷A2A受體顯像劑11C-KW6002在正常鼠上雙側(cè)紋狀體顯像對(duì)稱,而模型鼠的毀損側(cè)放射性攝取增高。11C-KW6002具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值,可用于以腺苷A2A受體為靶點(diǎn)的PD診斷與療效評(píng)價(jià)顯像劑。

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    Zhang Jinming, Zhang Xiaojun, Li Yungang, et al. Automatic synthesis and quality control of11C-raclopride for clinical use[J]. Journal of Isotopes, 2014, 27(4): 230-235(in Chinese).

    The Synthesis and Evaluation of11C-KW6002 as the PET Adenosine 2A Receptor Imaging Agent

    YAN Fu-qin, ZHOU Wei-hua, SUN Xiao-meng, LIU Xiao-jun

    (GeneralHospitalofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

    PET with selective adenosine 2A receptor (A2A) radiotracers can be used to study a neurodegenerative disorders in vivo and to diagnose of PD. The PET radiotracer11C-KW6002 for imaging A2Awas synthesized and evaluated, in normal and PD module rats. The results showed that the labeling yield was 56% (decay corrected yield,n=3) when11CH3-Triflate reacted with nor-KW6002 under NaOH. The radiochemical purity of product was 99.5% with specific activity of 1.5×1014Bq/g. The balance of radioactivity in striatum was observed in normal rats with microPET. A significant raised radioactivity on the striatum of lesion compared with the normal side. The radioactivity was found absence on the striatum of lesion with11C-CFT.11C-KW6002 is a potential PET radiotracer for imaging A2A.

    A2Areceptors;11C-KW6002; synthesis; microPET; imaging agent

    2017-01-11;

    2017-02-23

    閆賦琴(1968—),女,河北人,副主任藥師,主要從事臨床藥學(xué)研究

    劉曉軍,主任醫(yī)師,E-mail: m13911735771@163.com

    TL92+3;R817.9+2

    A

    1000-7512(2017)03-0204-05

    10.7538/tws.2017.youxian.003

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