HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒清咽顆粒中5種成分的含量

張申亮，聶黎行（1.山西省平遙縣人民醫(yī)院藥劑科，山西平遙 031100；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050）

HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒清咽顆粒中5種成分的含量

張申亮1＊，聶黎行2#（1.山西省平遙縣人民醫(yī)院藥劑科，山西平遙 031100；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050）

目的：建立同時(shí)測(cè)定小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為8.400～168.0 ng（r＝0.999 6）、11.30～226.0 ng（r＝0.999 8）、128.8～257.6 ng（r＝0.999 3）、8.110～162.2 ng（r＝0.999 6）、29.69～593.8 ng（r＝0.999 4）；定量限分別為33.39、451.2、515.2、324.5、1 188 ng/mL，檢測(cè)限分別為8.348、112.8、128.8、81.12、297.0 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.39%～98.64%（RSD＝0.83%，n＝6）、96.60%～98.89%（RSD＝0.89%，n＝6）、96.28%～99.22%（RSD＝1.25%，n＝6）、96.49%～99.54%（RSD＝1.16%，n＝6）、96.26%～99.70%（RSD＝1.30%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于小兒清咽顆粒中5種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

小兒清咽顆粒；高效液相色譜法；波長(zhǎng)切換；哈巴苷；哈巴俄苷；綠原酸；咖啡酸；連翹苷

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of harpagide，harpagoside，chlorogenic acid，caffeic acid and phillyrin in Xiaoer qingyan granules.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 210 nm（0-13 min，harpagide），327 nm（13-25 min，chlorogenic acid and caffeic acid），277 nm（25-29 min，phillyrin），210 nm（29-40 min，harpagosid）；the column temperature was 30℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of harpagide，harpagosid，chlorogenic acid，caffeic acid and phillyrin were 8.400-168.0 ng（r＝0.999 6），11.30-226.0 ng（r＝0.999 8），128.8-257.6 ng（r＝0.999 3），8.110-162.2 ng（r＝0.999 6），29.69-593.8 ng（r＝0.999 4），respectively.LOQs of the 5 components were 33.39，451.2，515.2，324.5，1 188 ng/mL；LODs were 8.348，112.8，128.8，81.12，297.0 ng/mL，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. The recoveries were 96.39%-98.64%（RSD＝0.83%，n＝6），96.60%-98.89%（RSD＝0.89%，n＝6），96.28%-99.22%（RSD＝1.25%，n＝6），96.49%-99.54%（RSD＝1.16%，n＝6），96.26%-99.70%（RSD＝1.30%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and suitable for simultaneous determination of 5 components in Xiaoer qingyan granules

KEYWORDSXiaoer qingyan granules；HPLC；Wavelength switching；Harpagide；Harpagosid；Chlorogenic acid；Caffeic acid；Phillyrin

小兒清咽顆粒是由玄參、蒲公英、連翹等中藥組成的成方制劑，具有清熱解表、解毒利咽的功效，可用于小兒外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱頭痛、咳嗽音啞、咽喉腫痛等癥。處方中玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效；蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效；連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效[1]。小兒清咽顆?，F(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第六冊(cè)）》，但標(biāo)準(zhǔn)中只有薄層鑒別項(xiàng)，未有含量測(cè)定項(xiàng)，不能保證該制劑的質(zhì)量和用藥的有效性[2]；且目前的文獻(xiàn)報(bào)道多為對(duì)小兒清咽顆粒中1～2個(gè)成分的含量進(jìn)行測(cè)定，不能全面控制該制劑的質(zhì)量[3-7]。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定小兒清咽顆粒中玄參的主要成分（哈巴苷和哈巴俄苷）、蒲公英中的主要成分（綠原酸和咖啡酸）、連翹中的主要成分（連翹苷）含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括四元泵、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：150 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

小兒清咽顆粒（福建省泉州羅裳山制藥廠，批號(hào)：160318、160106、150908，規(guī)格：6 g/袋）；哈巴苷對(duì)照品（批號(hào)：111729-201506，純度：95.9%）、哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)：111730-201508，純度：96.0%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201415，純度：96.2%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：110885-200102，純度：100.0%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201615，純度：94.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%→7%A；5～10 min，7%→13%A；10～20 min，13%→25%A；20～40 min，25%→35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含哈巴苷208.7 μg、哈巴俄苷225.6 μg、綠原酸257.6 μg、咖啡酸202.8 μg、連翹苷198.0 μg的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取哈巴苷對(duì)照品貯備液0.4 mL、哈巴俄苷對(duì)照品貯備液0.5 mL、綠原酸對(duì)照品貯備液0.5 mL、咖啡酸對(duì)照品貯備液0.4 mL、連翹苷對(duì)照品貯備液1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

畢總還特別提到，中美貿(mào)易戰(zhàn)中對(duì)叉車也加征了關(guān)稅，造成了中國(guó)叉車品牌在海外市場(chǎng)的價(jià)格相對(duì)上漲，比亞迪叉車也在其中。海外客戶則表示，相較于比亞迪叉車為企業(yè)節(jié)省的生產(chǎn)成本，比亞迪叉車仍是非常好的選擇。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，取約3 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液超聲處理30 min，放冷至室溫，再加50%甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝分別制備缺玄參、蒲公英、連翹的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、各陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；各成分的理論板數(shù)均＞3 000，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷的保留時(shí)間分別為9.6、30.9、15.3、17.1、28.3 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見(jiàn)表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.65%、0.75%、1.48%、1.07%、1.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2 LOQ與LOD測(cè)定結(jié)果（ng/mL）Tab 2 Results of LOQ and LOD（ng/mL）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：160318）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.97%、1.06%、1.57%、1.27%、1.46%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：160318）適量，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算平均含量。結(jié)果，哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷含量的平均值分別為62.90、88.62、115.9、64.29、271.4 μg/g，RSD分別為1.75%、1.46%、1.07%、1.58%、1.93%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：160318）適量，共6份，每份約1.5 g，各置于25 mL量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 提取方法和提取溶劑的選擇

筆者分別考察了加熱回流和超聲兩種樣品提取方法對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測(cè)成分經(jīng)超聲法提取時(shí)比加熱回流提取時(shí)的含量高，因此選擇超聲法為樣品的提取方法。此外，還考察了不同的提取溶劑（30%甲醇溶液、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇）對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，待測(cè)成分的提取效率高于其他溶劑，因此選擇50%甲醇溶液為本試驗(yàn)的提取溶劑。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷等5個(gè)成分的紫外特征吸收波長(zhǎng)各不相同，為了準(zhǔn)確測(cè)定其含量，本試驗(yàn)根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]和相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]確定5個(gè)成分的最大吸收波長(zhǎng)，再通過(guò)紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)切換功能，在每個(gè)成分的最大吸收波長(zhǎng)下同時(shí)、準(zhǔn)確地測(cè)定小兒清咽顆粒中5個(gè)成分的含量，最終確定本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm（0～13 min，哈巴苷）、327 nm（13～25 min，綠原酸、咖啡酸）、277 nm（25～29 min，連翹苷）、210 nm（29～40 min，哈巴俄苷）。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，μg/g）

3.3 洗脫方式和流動(dòng)相的選擇

小兒清咽顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷、綠原酸、咖啡酸、連翹苷等5個(gè)成分的極性差異較大，且組分中化學(xué)成分較為復(fù)雜，采用等度洗脫流動(dòng)相的方式，難以取得滿意的色譜分離效果，因此選擇梯度洗脫的方式。筆者還分別考察了不同的流動(dòng)相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液），結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，較其他流動(dòng)相的色譜基線平穩(wěn)，峰形更好，可達(dá)到分離測(cè)定的要求，因此本試驗(yàn)選擇其作為流動(dòng)相。綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于小兒清咽顆粒中5種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：117、170、352.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第六冊(cè)[S].1992：23.

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 5 Components in Xiaoer Qingyan Granules by HPLC

ZHANG Shenliang1，NIE Lixing2（1.Dept.of Pharmacy，Shanxi Pingyao County People’s Hospital，Shanxi Pingyao 031100，China；2.Division of TCM and Ethnomedicine，National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-3004-04

2017-01-19

2017-04-04）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：zhangsl2000@hot ail.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：中藥分析。E-mail：nielixing@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.35