RP-HPLC法同時測定熱感賽比斯坦顆粒中4種成分的含量Δ

翟 欣，龐克堅，唐 輝，劉新豫，孫小雅，王亞喬（.石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 8300；.和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆和田 84800）

RP-HPLC法同時測定熱感賽比斯坦顆粒中4種成分的含量Δ

翟 欣1＊，龐克堅2，唐 輝1#，劉新豫1，孫小雅1，王亞喬1（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002；2.和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，新疆和田 848200）

目的：建立同時測定熱感賽比斯坦顆粒中沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Waters RP-C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm（沒食子酸、迷迭香酸和甘草苷）、230 nm（甘草酸銨），柱溫為28℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.274 4～7.546 μg（r＝0.999 8）、0.187 0～5.143 μg（r＝0.999 6）、0.130 0～3.575 μg（r＝0.999 9）、0.254 0～6.985 μg（r＝0.999 8）；定量限分別為2.67、1.36、1.09、2.11 ng，檢測限分別為1.03、0.62、0.87、0.91 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.26%～101.00%（RSD＝1.1%，n＝9）、97.66%～101.80%（RSD＝1.3%，n＝9）、97.45%～101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）、97.74%～101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于熱感賽比斯坦顆粒中沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨含量的同時測定。

熱感賽比斯坦顆粒；反相高效液相色譜法；沒食子酸；迷迭香酸；甘草苷；甘草酸銨

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of gallic acid，rosmarinic acid，liquiritin and ammonium glycyrrhetate in Regan saibisitan granules.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Waters RP-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were 210 nm（gallic acid，rosmarinic acid and liquiritin），230 nm（ammonium glycyrrhetate）.The column temperature was 28℃，and sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.274 4-7.546 μg for gallic acid（r＝0.999 8），0.187 0-5.143 μg for rosmarinic acid（r＝0.999 6），0.130 0-3.575 μg for liquiritin（r＝0.999 9）and 0.254 0-6.985 μg for ammonium glycyrrhetate（r＝0.999 8），respectively.The LOQ were 2.67，1.36，1.09 and 2.11 ng，respectively.The LOD were 1.03，0.62，0.87 and 0.91 ng，respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all less than 2.0%.The average recoveries were 97.26%-101.00%（RSD＝1.1%，n＝9），97.66%-101.80%（RSD＝1.3%，n＝9），97.45%-101.70%（RSD＝1.4%，n＝9），97.74%-101.70%（RSD＝1.4%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be applied for simultaneous determination of gallic acid，rosmarinic acid，liquiritin and ammonium glycyrrhetate in Regan saibisitan granules.

KEYWORDSRegan saibisitan granules；RP-HPLC；Gallic acid；Rosmarinic acid；Liquiritin；Ammonium glycyrrhetate

熱感賽比斯坦顆粒（國藥準(zhǔn)字：Z65020143）是維吾爾民族治療感冒的常用藥，處方由破布木果、甘草、罌粟殼等中藥組成，具有清除異常膽液質(zhì)、止咳、化痰的功效，可用于治療熱性感冒咳嗽、呼吸道感染[1]。本制劑收載于1998年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（維吾爾藥分冊）》[2]中，該標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜法對罌粟殼和罌粟子進(jìn)行定性鑒別；也有文獻(xiàn)對熱感賽比斯坦顆粒中的嗎啡、甘草苷和甘草酸銨分別進(jìn)行含量測定的報道[3]，但目前還未見對處方中君藥破布木果進(jìn)行含量測定的報道。維吾爾醫(yī)認(rèn)為，破布木果具有生濕生熱、潤肺潤喉、止咳化痰、清音止渴、通便利尿的功效，主治干寒性或黑膽質(zhì)性疾病[4-7]。鑒于此，本課題組采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了測定熱感賽比斯坦顆粒中破布木果和甘草的主要成分（沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨）含量的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2998二級管陣列檢測器、717自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

熱感賽比斯坦顆粒（新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20150602、20150711、20150910，規(guī)格：12 g/袋）；沒食子酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：CAS#149-91-7，純度：≥98%）；迷迭香酸對照品（中國科學(xué)院成都生物研究所，批號：MUST-12020702，純度：≥98%）；甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：11610-201106，純度：≥98%）；甘草酸銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110731-201418，純度：≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters RP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，6%A；7～11 min，6%→45%A；11～25 min，45%→80% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷）、230 nm（甘草酸銨）；柱溫：28℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷、甘草酸銨對照品各適量，分別加乙腈溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.823 0、0.501 0、0.390 0、 0.254 0 mg/mL的單一對照品溶液；取上述單一對照品溶液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻，制成沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為137.2、93.5、65.0、127.0 μg/mL的混合對照品溶液。于4℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加75%甲醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，加75%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，取不含破布木果和甘草的其余藥材制備陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以沒食子酸峰計≥5 000，沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨保留時間分別為6.932、17.160、18.810、22.320 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液2、10、20、30、40、55 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD，結(jié)果見表2。

表2 LOQ與LOD測定結(jié)果（ng）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.48%、0.49%、0.35%、0.39%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20150602）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.51%、0.95%、0.77%和0.62%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：20150602）適量，共6份，每份5.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.81%、1.90%、0.98%和0.52%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：20150602）適量，共9份，每份約0.5 g，精密稱定，各置于10 mL量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of 3 batches of samples（n＝3，mg/g）

相關(guān)文獻(xiàn)報道，沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨最大吸收波長分別為208、220、230、237 nm[8-10]。本試驗(yàn)采用紫外檢測器在190～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)沒食子酸在210、215、247 nm波長處有最大吸收，迷迭香酸在210、329 nm波長處有最大吸收，甘草苷在210、230、275 nm波長處有最大吸收，甘草酸銨在230、237 nm波長處有最大吸收；為了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)選擇210 nm（沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷）、230 nm（甘草酸銨）為檢測波長。

3.2 提取溶劑、提取方法和超聲時間的考察

在預(yù)試驗(yàn)時，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)選擇20%甲醇溶液、75%甲醇溶液、80%甲醇溶液為提取溶劑[11-13]，結(jié)果75%甲醇溶液的提取率最高，因此選擇75%甲醇溶液為本試驗(yàn)的提取溶劑。本課題組還考察了提取方法（超聲法和加熱回流法），結(jié)果超聲法與加熱回流法的提取量相當(dāng)，綜合考慮超聲法簡便、快速易行，因此選擇超聲法為本試驗(yàn)的提取方法。此外，本課題組對超聲時間也進(jìn)行了考察（15、40、60 min），結(jié)果超聲處理40 min和60 min時的提取量相當(dāng)且均大于超聲處理15 min時的提取量。為節(jié)約試驗(yàn)時間，最終確定本試驗(yàn)的超聲處理時間為40 min。

3.3 流動相的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中本課題組還考察了不同的流動相系統(tǒng)（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.2%磷酸溶液），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入磷酸溶液時，保留時間更穩(wěn)定，分離效果較好，并且乙腈-0.2%磷酸溶液比乙腈-0.1%磷酸溶液的峰形好，故選用乙腈-0.2%磷酸溶液作為本試驗(yàn)的流動相[14-15]。

3.4 柱溫的選擇

色譜柱的溫度對被分離物質(zhì)有較大影響，本試驗(yàn)考察了不同溫度（25、28、30℃）對沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨色譜分離的影響。結(jié)果，柱溫為25℃時，色譜峰有拖尾現(xiàn)象，分離度不佳；柱溫為30℃時，色譜峰有上漂現(xiàn)象；柱溫為28℃時，各待測成分的分離均較好。因此，最終確定本試驗(yàn)的柱溫為28℃。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于熱感賽比斯坦顆粒中沒食子酸、迷迭香酸、甘草苷和甘草酸銨含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Regan Saibisitan Granules by RP-HPLC

ZHAI Xin1，PANG Kejian2，TANG Hui1，LIU Xinyu1，SUN Xiaoya1，WANG Yaqiao1（1.School of Pharmacy，Shihezi Univercity/Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Recourses Utilization，Ministry of Education，Xinjiang Shihezi 832002，China；2.Hotan Uygur Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Xinjiang Hotan 848200，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2963-04

2016-10-02

2017-03-10）

（編輯：劉 柳）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81260627）

＊碩士研究生。研究方向：藥物分析。E-mail：810347045@qq. com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥物分析及新藥研究。電話：0993-2057878。E-mail：Tanghuishz@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.23