響應(yīng)面法優(yōu)化大葉白麻莖多酚的提取及其抗氧化性研究

靳欣欣 田英姿

摘要 [目的]優(yōu)化大葉白麻莖多酚的提取工藝，并考察其體外抗氧化性。[方法]采用響應(yīng)面法對(duì)大葉白麻莖多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，考察了料液比、超聲強(qiáng)度、超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響，以VC為參照，將大葉白麻莖多酚和茶多酚的抗氧化性進(jìn)行對(duì)比。[結(jié)果]大葉白麻莖多酚的最佳提取工藝是料液比1∶17，超聲強(qiáng)度410 W，提取時(shí)間60 min，在該條件下大葉白麻莖多酚的提取得率為2.09%，提取時(shí)間和超聲強(qiáng)度對(duì)提取得率的影響均為極顯著。還原力與還原劑濃度之間有較好的量效關(guān)系，三者的還原力從高到低依次為大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC，與抗氧化能力的強(qiáng)弱性一致。大葉白麻莖多酚清除羥基自由基的能力是茶多酚的1.34倍，清除超氧陰離子、DPPH·自由基的能力與茶多酚較為接近，且明顯高于VC，分別是VC的2.00、2.80倍。[結(jié)論]大葉白麻莖多酚具有良好的抗氧化活性，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

關(guān)鍵詞 大葉白麻莖；多酚；抗氧化；響應(yīng)面

中圖分類號(hào) TS01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0116-04

Study on Optimization of Extraction Process of Polyphenol in Stem of Poacynum hendersonii by Response Surface Aanlysis and Its Oxidation Resistance

JIN Xin-xin1，TIAN Ying-zi1，2*

（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong 510640； 2.College of Life and Geography Sciences，Kashi University，Kashi，Xinjiang 844006）

Abstract [Objectuve] The aim of the study was to optimize extraction technology of polyphenol in stem of Poacynum hendersonii and study its antioxidation in vitro.[Method]The extraction technology of polyphenol was optimized by response surface analysis and the effect of liduid ratio，extraction time and ultrasonic intensity on extraction yield of polyphenol was investigated.VC taken as reference，antioxidant activity of polyphenol in Poacynum hendersonii and tea were compared and analyzed.[Result] The optimal extraction technology was as follows solid-liquid ratio of 1∶17，ultrasonic intensity of 410 W，extraction time for 60 min，under this technology，the extraction yield of polyphenol from Poacynum hendersonii was 2.09%.Both influence of time and ultrasonic intensity on the yield was very significant.The order of antioxidative effect from high to low was polyphenol in Poacynum Hendersonii，polyphenol in tea，VC.As the dose of the three antioxidant increasing，reducing power strengthens，displays good does-effect relationship.The order of reducing power and antioxidative effect were identical.Hydroxyl radical scavenging ability of polyphenol in Poacynum Hendersonii was about 1.34 times of polyphenol in tea.DPPH· and superoxide anion scavenging ability of polyphenol in stem of Poacynum hendersonii were close to that in tea，2.00，2.80 times of VC.[Conclusion]The polyphenol in stem of Poacynum hendersonii has been shown to exhibit excellent antioxidant activity，so it should strengthen the further application research.

Key words Poacynum Hendersonii；Polyphenol；Antioxidant activity；Response surface

大葉白麻（Poacynum hendersonii），又稱大花羅布麻，直立半灌木，主要分布于新疆、青海和甘肅等省區(qū)。主要野生在鹽堿荒地和沙漠邊緣及河流兩岸沖積平原水田和湖泊周圍[1]。大葉白麻葉被用于沖泡和中藥，但其莖部被大量丟棄。目前有大葉白麻多酚提取和抗氧化性研究的相關(guān)報(bào)道[2-3]，而關(guān)于大葉白麻莖中多酚的提取工藝及抗氧化性鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取大葉白麻莖多酚，以VC為參照，將大葉白麻莖多酚和茶多酚的抗氧化性進(jìn)行對(duì)比，旨在為大葉白麻莖多酚的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：大葉白麻莖，取自新疆塔里木盆地?；瘜W(xué)試劑：石油醚、乙酸乙酯、磷酸、酒石酸亞鐵等均購(gòu)自廣州市雨韶貿(mào)易有限公司。標(biāo)準(zhǔn)品：沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

儀器：分析天平HANGPING FA2004，上海天平儀器廠；真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DLSB-FZ低溫循環(huán)真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Q02旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾拓思實(shí)驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司廣州辦事處；紫外分光光度計(jì)，Lambda 900。

1.2 方法

1.2.1 大葉白麻莖多酚含量的測(cè)定。

（1）大葉白麻莖多酚的萃取。稱取大葉白麻莖3.000 g，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，然后測(cè)定其多酚含量，確定最佳提取工藝。

（2）大葉白麻莖多酚的純化[4]。濾液經(jīng)過(guò)濃縮處理后，加入溶液體積1/4的乙酸乙酯，合并有機(jī)相，真空旋蒸儀濃縮；冷凍干燥得粗多酚固體；將多酚固體充分溶解后，用氯仿萃取出其中的植物堿；再用乙酸乙酯萃取出水相中的多酚；通過(guò)減壓蒸餾、真空干燥得大葉白麻莖多酚固體。

（3）沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品為梯度濃度的沒(méi)食子酸，精確量取2.500 mL加入10 mL比色管，在比色管中加入2.500 mL酒石酸亞鐵溶液，用pH 7.5的磷酸緩沖液定容，545 nm測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）大葉白麻莖多酚濃度的計(jì)算。精確稱取大葉白麻莖多酚精制固體稀釋至合適倍數(shù)，得到實(shí)際濃度的多酚溶液，用酒石酸亞鐵法在545 nm測(cè)定吸光度，將其代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出測(cè)定濃度。

（5）大葉白麻莖多酚含量的測(cè)定。取一定質(zhì)量粉碎后的大葉白麻莖，用乙酸乙酯低溫萃取5次合并濾液濃縮，用80%乙醇稀釋一定倍數(shù)，用酒石酸亞鐵法在545 nm測(cè)定吸光度，將吸光度代入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其濃度，計(jì)算大葉白麻莖多酚含量。

1.2.2 大葉白麻莖多酚還原力的測(cè)定。

取0.010 g大葉白麻莖多酚固體溶解于80%乙醇溶液，定容至100 mL。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于10 mL容量瓶中，并定容至刻度。取上述溶液各2.5 mL于試管中，依次加入0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液 2.5 mL，于50 ℃水浴保溫 20 min 后快速冷卻，再加入 10%三氯乙酸溶液2.5 mL，以2 000 r/min 離心10 min，取上清液5.0 mL，依次加入4.0 mL蒸餾水，1.0 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置 10 min 后，在 700 nm 下測(cè)定吸光度（以VC和茶多酚作為對(duì)照品，同法測(cè)量）[4-5]。

1.2.3 大葉白麻莖多酚清除羥基自由基清能力的測(cè)定。

取7.5 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液0.2 mL，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL，充分混勻后加入0.2 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，混勻后加入2 mL去離子水補(bǔ)充體積，加入1.0 mL 0.1%雙氧水，反應(yīng)液在（37±2）℃保溫1 h，于510 nm測(cè)定吸光度；用大葉白麻莖多酚溶液、VC溶液、茶多酚溶液代替去離子水，混勻加入1.0 mL 0.1%雙氧水，510 nm處分別測(cè)定吸光度；未損傷管不加雙氧水和樣品溶液[5-6]。

1.2.4 大葉白麻莖多酚清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定。

取50 mmol/L緩血酸銨緩沖溶液（pH 8.1）4.5 mL，加入4.2 mL去離子水混勻后于（25±2） ℃水浴40 min，取出后加入經(jīng)25 ℃水浴過(guò)的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（空白樣以10 mmol/L鹽酸代替鄰苯三酚），混勻后于420 nm測(cè)定吸光度，每間隔30 s測(cè)定1次，共測(cè)定6 min，計(jì)算對(duì)照溶液吸光度隨時(shí)間的變化率。與上述試驗(yàn)其他步驟相同，用1 mL樣品溶液（大葉白麻多酚溶液、Vc溶液、茶多酚溶液）代替4.2 mL去離子水，計(jì)算樣品吸光度隨時(shí)間的變化率[5-6]。

1.2.5 大葉白麻莖多酚清除DPPH·自由基能力的測(cè)定。

吸取不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液各2.0 mL至試管中，加 0.057 mg/mL DPPH·乙醇溶液2.0 mL，置于暗處 30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以乙醇溶液做空白參比[5-6]。

1.3 響應(yīng)面法因素水平編碼

以提取時(shí)間（A）、液料比（B）、超聲強(qiáng)度（C）為響應(yīng)變量，以多酚的提取得率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平編碼見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)計(jì)算，其轉(zhuǎn)換系數(shù)為7.925?；貧w方程為y=0.004x-0.042，R2=0.998。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

以提取時(shí)間（A）、液料比（B）、超聲強(qiáng)度（C）為響應(yīng)變量，以多酚的提取得率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取得率見(jiàn)表2。

利用Design-expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到大葉白麻莖多酚得率與各因素變量之間的二次回歸模型。

R1=-0.988 84+0.094 07A+0.018 97B+0.046 18C+9.941 67E-004AB+2.757 50E-004AC+7.558 33E-004BC-1.266 84E-003A2-3.212 62E-003B2-9.093 37E-004C2

試驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治霰砻?，回歸方程模型極顯著（P<0.000 1），模型可決系數(shù)R2=0.983 4，校正決定系數(shù)R2Adj=0.961 7，模型變異系數(shù)為0.87%，說(shuō)明該模型能夠擬合真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)誤差??；該模型的失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著，表明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)相符，可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

回歸模型的顯著性檢驗(yàn)表明，提取時(shí)間、超聲強(qiáng)度對(duì)大葉白麻莖多酚得率有極顯著影響，而液料比對(duì)得率的影響不顯著。3個(gè)因素對(duì)得率影響的主次因素為提取時(shí)間、超聲強(qiáng)度、液料比。3個(gè)因素的交互作用對(duì)得率也有顯著影響。

從圖2可看出，三維曲面圖形均為上凸形，且最高點(diǎn)落在所選區(qū)域，說(shuō)明因素水平的選擇合理；大葉白麻莖多酚提取得率隨著提取時(shí)間、液料比、超聲強(qiáng)度的增大均呈先增大后減小的二次關(guān)系。

由Design-expert軟件獲得大葉白麻莖多酚的最佳提取條件：液料比17.11∶1，超聲強(qiáng)度41.59%，提取時(shí)間59.97 min，提取得率預(yù)測(cè)值2.07%。為了方便實(shí)際操作，最佳條件確定為料液比1∶17，超聲強(qiáng)度410 W，提取時(shí)間60 min，在該條件下大葉白麻莖多酚的提取得率為2.09%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型用于大葉白麻莖多酚的提取是可靠的。

2.3 大葉白麻莖多酚的抗氧化能力

2.3.1 還原力。

抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原力越大，抗氧化性越強(qiáng)。因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的強(qiáng)弱。從圖3可以看出，隨著3種清除劑濃度的升高，其還原力呈增大趨勢(shì)，由高到低依次為大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC。

2.3.2 對(duì)羥基自由基的清除能力。

從圖4可以看出，茶多酚和大葉白麻莖多酚清除羥基自由基的能力均高于VC，大葉白麻莖多酚清除羥基自由基的能力高于茶多酚，3種樣品清除羥基自由基的能力均隨著樣品濃度的升高而增大。此外，大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC對(duì)羥基自由基清除率的IC50分別約35.5、47.5、66.0 mg/L，大葉白麻莖多酚清除羥基自由基的能力為茶多酚的1.34倍，VC的1.86倍。

2.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

從圖5可以看出，大葉白麻莖多酚和茶多酚清除超氧陰離子自由基的能力較為接近，且明顯高于VC，3種樣品清除超氧陰離子的能力都隨著樣品濃度的升高而增大，但大葉白麻莖多酚茶多酚的清除率達(dá)到80%之后趨于穩(wěn)定。此外，大葉白麻莖多酚、茶多酚和VC清除超氧陰離子自由基的IC50分別是35.00、35.00、7.00 mg/L，大葉白麻莖多酚超氧陰離子清除能力約為VC的2.00倍。

2.3.4 對(duì)DPPH·自由基的清除能力。

從圖6可以看出，大葉白麻莖多酚和茶多酚清除DPPH·自由基的曲線基本重合，3種樣品清除DPPH·自由基的能力均隨著樣品濃度的升高而增加，且大葉白麻莖酚和茶多酚的清除能力隨著濃度的升高明顯高于VC，但當(dāng)大葉白麻莖酚和茶多酚的DPPH·自由基清除率達(dá)到80%之后，其DPPH·自由基清除率趨于穩(wěn)定。此外，大葉白麻莖多酚、茶多酚和VC清除DPPH·自由基的IC50分別為18.0、18.0、50.0 mg/L，大葉白麻莖多酚和茶多酚清除DPPH·自由基的能力約為VC的2.80倍。

3 結(jié)論

（1）該研究采用響應(yīng)面法對(duì)大葉白麻莖多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了超聲提取多酚的數(shù)學(xué)模型。評(píng)價(jià)了料液比、超聲強(qiáng)度、超聲時(shí)間對(duì)于提取得率的影響，從大到小依次為提取時(shí)間、超聲強(qiáng)度、料液比，其中提取時(shí)間和超聲強(qiáng)度對(duì)提取得率的影響均為極顯著。由試驗(yàn)結(jié)果得到最佳提取工藝是料液比1∶17，超聲強(qiáng)度410 W，提取時(shí)間60 min，在該條件下大葉白麻莖多酚的提取得率為2.09%。該研究確定的大葉白麻莖多酚的提取方法操作便捷，提取得率較高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，方便對(duì)大葉白麻莖中多酚的進(jìn)一步應(yīng)用進(jìn)行研究。

（2）該研究對(duì)大葉白麻莖多酚和茶多酚的抗氧化性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC的抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC。大葉白麻莖多酚、茶多酚、VC的還原力與濃度有較好的量效關(guān)系，三者的還原力從高到低依次為大葉白麻多酚、茶多酚、VC，與抗氧化能力一致。對(duì)三者的抗氧化能力分析結(jié)果顯示，大葉白麻莖多酚清除羥基自由基的能力強(qiáng)于茶多酚，是其1.34倍；大葉白麻莖多酚對(duì)超氧陰離子、DPPH·自由基的清除能力與茶多酚較為接近，且明顯高于VC，分別是VC的2.00、2.80倍。相對(duì)于茶多酚，大葉白麻莖多酚具有相對(duì)較好的抗氧化活性，應(yīng)在今后加強(qiáng)其應(yīng)用研究。

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