凱氏定氮法測定固體飲料中蛋白質(zhì)含量的不確定度評定

戴飛 吳貝貝 關(guān)敬媛 張浩杰

摘要 [目的] 對凱氏定氮法測定固體飲料中蛋白質(zhì)含量的不確定度進(jìn)行評定。[方法] 根據(jù)JJF 1059.1—2012標(biāo)準(zhǔn)中要求，建立了凱氏定氮法測定固體飲料中蛋白質(zhì)含量的測量不確定度的數(shù)學(xué)模型，分析了凱氏定氮法中不確定度的主要來源，對已識別來源的不確定度分量進(jìn)行分析評價。[結(jié)果] 固體飲料中蛋白質(zhì)含量為11.60%，擴(kuò)展不確定度為0.46%（95%，k=2）。測量結(jié)果的不確定度主要來源于測定樣品實(shí)際消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積與測量重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響次之，樣品質(zhì)量、取樣體積與定容的體積帶來的影響可忽略不計。[結(jié)論] 系統(tǒng)介紹了蛋白質(zhì)測量不確定度的評定過程，提高了檢測數(shù)據(jù)的可靠性和一致性。

關(guān)鍵詞 凱氏定氮法；蛋白質(zhì)；固體飲料；不確定度

中圖分類號 TS278 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0076-03

Evaluation of Uncertainty in Determination of Protein Content by Kjeldahl Method in Solid Beverage

DAI Fei， WU Bei-bei， GUAN Jing-yuan et al

（Ningbo Yufangtang Biological Technology Co.， Ltd.， Ningbo， Zhejiang 315012）

Abstract [Objective] The uncertainty in determination of protein content by Kjeldahl method in solid beverage was evaluated. [Method] According to the requirements of JJF 1059.1—2012 standard， a mathematical model for uncertainty in determination of protein content by Kjeldahl method in solid beverage was established， various sources of uncertainty were analyzed， the uncertainty components of identified sources are analyzed and evaluated. [Result] The concentration of protein was 11.60% and the expanded uncertainty was 0.46 %（95%， k=2）. The uncertainties of measurement result were mainly from volume determination of the actual consumption of sulfuric acid solution and measurement repeatability， the influence of standard solution on the second， the sample quality， the influence brought by sample volume and volume of constant volume was negligible. [Conclusion] The evaluation process of protein measurement uncertainty is introduced systematically， and the reliability and consistency of the data are improved.

Key words Kjeldahl determination；Protein；Solid beverage；Uncertainty

測量結(jié)果都不可避免地會有不確定度，不確定度可以給出測量結(jié)果的可信程度，是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量評定[1]。不確定度評估可以作為產(chǎn)品質(zhì)量評價的一個重要指標(biāo)，也可以反映數(shù)據(jù)可信的程度。檢測結(jié)果一般是用數(shù)值來表示，而檢測數(shù)值的可信程度則一般用它的不確定度來表示，數(shù)值只有包含了可置信的范圍，檢測的最終結(jié)果才有意義。不確定度的大小，表述了測量結(jié)果與被測量真值的接近程度，不確定度越小，離真值更近，則測量結(jié)果質(zhì)量越高；不確定度越大，離真值越遠(yuǎn)，則測量結(jié)果的使用價值就越低。因此，在給出測量結(jié)果時，應(yīng)相應(yīng)給出它的測量不確定度，使人們可以更直觀地評定其可靠性，使檢測結(jié)果更有意義。

寧波御坊堂生物科技有限公司生產(chǎn)的固體飲料是指以乳或乳制品、蛋或蛋制品、白砂糖、果汁或植物提取物等為主要原料，添加適量的輔料或食品添加劑制成的固體制品，以動物蛋白（膠原蛋白）、植物蛋白（大豆分離蛋白、花生蛋白）為主適量加入各種功能肽和調(diào)味劑制成的蛋白型固體飲料。常規(guī)固體飲料分為蛋白型固體飲料、普通型固體飲料和焙烤型固體飲料三大類。蛋白質(zhì)作為固體飲料中的品質(zhì)指標(biāo)，備受人們的重視，并且寧波御坊堂生物科技有限公司生產(chǎn)的蛋白型固體飲料其蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于市面上流通的普通蛋白型固體飲料，國家標(biāo)準(zhǔn)中蛋白質(zhì)型固體飲料中對蛋白質(zhì)的要求僅大于4.0%，而該公司生產(chǎn)的固體飲料對蛋白質(zhì)的要求大于10.0%，大大高于國家標(biāo)準(zhǔn)要求，因此蛋白質(zhì)是一個重要的檢測指標(biāo)，更應(yīng)該引起人們的重視。目前，測定蛋白質(zhì)采用GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[2]第一法（仲裁法）凱氏定氮法，此法作為蛋白質(zhì)檢測的經(jīng)典方法，操作方便簡單，重復(fù)性和重現(xiàn)性較好，被廣泛應(yīng)用于各類食品等樣品的蛋白質(zhì)含量測定中。關(guān)于各類食品中蛋白質(zhì)的不確定度評定已有不少報道[3-14]，而有關(guān)固體飲料中蛋白質(zhì)的不確定度評估尚少見報道，因此筆者以固體飲料為研究對象，結(jié)合GB 5009.5—2010檢測方法和實(shí)際操作，建立凱氏定氮法的數(shù)學(xué)模型，分析測量結(jié)果的不確定度來源并進(jìn)行定量分析，以此提高數(shù)據(jù)的可靠性，提升實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)技術(shù)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。

固體飲料，寧波御坊堂生物科技有限公司生產(chǎn)。硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，證書編號為BWB2010—2016，濃度值0.100 0 moL/L；硫酸鉀（AR）、硫酸銅（AR）、氫氧化鈉（AR）、硼酸（AR）。

1.1.2 主要儀器。

凱氏定氮裝置；電子分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；A級25 mL滴定管；A級10 mL移液管；A級100 mL容量瓶。

1.2 樣品處理

稱取固體飲料2 g，精確至0.000 1 g，移入干燥的500 mL定氮瓶中，加入0.2 g硫酸銅、6.0 g硫酸鉀及20 mL濃硫酸，將瓶斜支于石棉網(wǎng)上。用電爐小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化與泡沫完全停止后，增大火力，并保持瓶內(nèi)液體沸騰，至液體顏色為藍(lán)綠色并透明澄清后，再加熱0.5～1.0 h。取下放冷，小心加入20 mL試驗(yàn)用水。冷卻后，移入容量瓶，并用少量試驗(yàn)用水洗500 mL定氮瓶，洗液并入容量瓶，加試驗(yàn)用水至刻度，混勻后備用。吸取10 mL試樣處理液加入到凱氏定氮裝置進(jìn)行蒸餾。蒸餾后用硼酸吸收液吸收，用 0.100 0 mol/L 濃度的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定?？瞻坠芗酉嗤脑噭┳鲈噭┛瞻自囼?yàn)。

1.3 數(shù)學(xué)模型

蛋白質(zhì)含量計算公式如下：

X=（V1-V2）×0.014×C×100×Fm×V3/100式中，X為固體飲料中蛋白質(zhì)含量（%）；V1為消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；V2為空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；C為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（mL）；F為氮（N）換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，把固體飲料列為一般食物，換算系數(shù)為6.25；m為樣品質(zhì)量（g）；V3為吸取消化液的體積（mL），該試驗(yàn)為10 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量主要來源的定量分析

由于采用GB 5009.5—2010國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，因此忽略實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等環(huán)境條件的影響。產(chǎn)生不確定度的主要因素有以下幾點(diǎn)：由硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度u1；由測定樣品消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V1-V2）引入的不確定度u2；由定容的體積引入的不確定度u3；由樣品質(zhì)量引入的不確定度u4；由測量重復(fù)性引入的不確定度u5；由取樣體積V3引入的不確定度u6。

2.1.1 由硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度u1。

硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度，濃度為0.100 0 mol/L，證書上給出的擴(kuò)展不確定度為0.1%，因此考慮正態(tài)分布，k=3，則0.100 0 mol/L 濃度的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對不確定度為u1=0.0010.1×3=0.005 77。

2.1.2 由測定樣品實(shí)際消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V1-V2）引入的不確定度u2。

測定樣品實(shí)際消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定體積來自滴定管本身帶入的不確定度、滴定管使用和校準(zhǔn)溫度差帶入的不確定度、滴定管讀數(shù)引入的不確定度。由于實(shí)驗(yàn)室溫度為20 ℃，與校正的溫度相差無幾，因此滴定管使用和校準(zhǔn)溫差帶入的不確定度可忽略不計。

2.1.2.1 由滴定管本身引入的不確定度uV1 。

滴定采用25 mL的A級酸式滴定管，消耗0.100 0 moL/L 濃度硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.65 mL左右，按檢定證書給出的最大容量的允許誤差為±0.04 mL，矩形分布考慮，k=3，則滴定管校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.043=0.023 0（mL），則相對不確定度為uV1=0.023 02.65=0.008 68。

2.1.2.2 滴定管讀數(shù)引入的不確定度uV2。

25 mL的A級滴定管最小刻度為0.1 mL，估讀最大誤差為±0.05 mL，矩形分布考慮，計算不確定度為0.053=0.028 9（mL），則相對不確定度為uV2=0.028 92.65=0.010 9。

則由測定樣品實(shí)際消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u2=u2V1+u2V2=0.013 9。

2.1.3 由定容的體積引入的不確定度u3。

樣品消化提取后，洗入并定容到100 mL容量瓶，此100 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源包括：

①100 mL容量瓶的校準(zhǔn)。經(jīng)計量檢定，100 mL A 級容量瓶最大允差為±0.1mL，按照B類不確定度評定，則用均勻分布換算成100 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3-1（V100）=0.13=0.058（mL）。

②100 mL容量瓶的重復(fù)性。用100 mL A 級容量瓶重復(fù)進(jìn)行20次定容和稱量，測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.080 mL，按照A類不確定度評定，則充滿液體至100 mL容量瓶刻度的準(zhǔn)確性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

u3-2（V100）=0.080（mL）。

③溫度。由于實(shí)驗(yàn)室溫度為20 ℃，與校正溫度相差不大，因此100 mL容量瓶使用和校準(zhǔn)溫差引入的不確定度可忽略不計。

合成以上2項(xiàng)得出：u（V100）=u3-1（V100）2+u3-2（V100）2=0.098 8 mL，則樣品定容的相對不確定度為u3=u（V100）V100=0.098 8100.0=0.000 988。

2.1.4 由樣品質(zhì)量引入的不確定度u4。

所用電子天平的最大允差±0.000 1 g，按B類不確定度評定，可認(rèn)為其服從均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（m）=0.000 13=0.000 058（g）。

樣品的稱取質(zhì)量為2.000 0 g，則樣品質(zhì)量（2.000 0 g）引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u4=u（m）m=0.000 0582.000 0=0.000 029。

2.1.5 由測量重復(fù)性引入的不確定度u5。

8次重復(fù)測定的試驗(yàn)結(jié)果，覆蓋試驗(yàn)的全過程，即始于取樣、消化、蒸餾、滴定，直至計算結(jié)果。結(jié)果見表1。

按A類不確定度考慮，蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)差為S=（xi-2）n-1=0.429，則測量重復(fù)性A類不確定度為uS=0.4298=0.152（mL），測量重復(fù)性A類相對不確定度為u5=0.15211.60=0.013 1。

2.1.6 由取樣體積V3引入的不確定度u6。

該試驗(yàn)使用10 mL A級移液管移取樣品稀釋液10 mL，10 mL A級移液管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度來源如下：①移液管體積引入的不確定度，10 mL A級移液管20 ℃時容量允許偏差為±0.05 mL，按照矩形發(fā)布估算，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05/10×3=0.003 mL。②充滿液體至10 mL刻度的變動性，重復(fù)4次的測定結(jié)果為0.02 mL。③移液管和溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度，假設(shè)溫度偏差為2.0 ℃，水的體積膨脹系數(shù)則為2.1×10-4/℃；則95%置信概率（k=2）時體積變化的區(qū)間為0.004 2 mL（10×2×2.1×10-4），轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002 1 mL。將以上3項(xiàng)合成得出：uV10=（0.003）2+（0.02）2+（0.002 1）2=0.023 0 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u6=0.020 310=0.002 03。

2.2 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由以上可知，該公司生產(chǎn)的固體飲料中蛋白質(zhì)含量的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下：

樣品中蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分析即為測得固體飲料中蛋白質(zhì)含量為8.66%，則樣品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel（C）=u21+u22+u23+u24+u25+u26=0.020 1 mL。

則固體飲料中蛋白質(zhì)含量的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：uc（X）=0.016 9X=0.016 9×11.60=0.23%。各不確定度分量及其合成不確定度的貢獻(xiàn)率列于表2。

2.3 擴(kuò)展不確定度的評定

取包含因子k=2（95%的置信概率），則U（X）=2uc（X）=0.23×2×10=0.46%。

測量結(jié)果可表示為X=（11.60±0.46）%，k=2。

3 結(jié)論

由不確定度評定定量分析結(jié)果可知，固體飲料中蛋白質(zhì)含量為11.60%，擴(kuò)展不確定度為0.46%，因此蛋白質(zhì)含量為（11.60±0.40）%，符合寧波御坊堂生物科技有限公司制定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求（≥10.00%）。測量結(jié)果的不確定度主要來源于測定樣品實(shí)際消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積與測量重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響次之，樣品質(zhì)量、取樣體積與定容的體積帶來的影響較小，可忽略不計。因此在以后的實(shí)際檢測工作中應(yīng)控制影響測量不確定度的主要因素，滴定要準(zhǔn)確，同時增加重復(fù)次數(shù)，以提高檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

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